劉秀花 梁梁 杜風(fēng)光 王有名 梁峰

摘 要：木糖為自然界中最豐富和經(jīng)濟(jì)的糖資源之一，但木糖很少被證明是野生型微藻的碳源。本實(shí)驗(yàn)的目的是確定小球藻的最適培養(yǎng)基以及對(duì)糖的具體利用情況。通過(guò)對(duì)小球藻干重和培養(yǎng)后的藻液中糖含量的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在HSM培養(yǎng)基中，小球藻生長(zhǎng)較好，最適pH為6.5。添加木糖對(duì)小球藻的生長(zhǎng)存在一定的抑制作用，隨著糖含量的增加，抑制越來(lái)越嚴(yán)重。在木糖含量擴(kuò)大培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，木糖耐受在6g/L左右。之后進(jìn)行混合糖（木糖和葡萄糖）培養(yǎng)小球藻，確定混合糖培養(yǎng)效果明顯好于單糖培養(yǎng);經(jīng)過(guò)薄層層析和DNS對(duì)培養(yǎng)后的藻液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有葡萄糖存在時(shí)，小球藻優(yōu)先利用葡萄糖。

關(guān)鍵詞：小球藻;木糖;葡萄糖;薄層層析

中圖分類號(hào)：S963.213 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1003-5168（2019）17-0136-06

Abstract： Xylose is one of the most abundant and economical sugar resources in nature， but xylose is rarely proven to be a carbon source for wild-type microalgae. The purpose of this experiment was to determine the optimum medium for Chlorella and the specific use of sugar. By measuring the dry weight of the Chlorella and the sugar content in the algae after the culture， it was found that the Chlorella grew well in the HSM medium， and the optimum pH was 6.5. The addition of xylose had a certain inhibition on the growth of Chlorella， and as the sugar content increases， the inhibition became more and more serious. In the expansion of xylose content， xylose tolerance was found to be around 6 g/L. After the cultivation of Chlorella with mixed sugar （xylose and glucose）， it could be confirmed that the mixed sugar culture effect was significantly better than the monosaccharide culture， and the cultured algae liquid was measured by thin layer chromatography and DNS， and it was found that there was glucose present. Chlorella preferentially utilized glucose.

Keywords： Chlorella;xylose;glucose;thin layer chromatography

1 研究背景

小球藻為綠藻門小球藻屬（Chlorella sp）普生性單細(xì)胞綠藻，以光合自養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖，分布廣泛，尤以淡水水域種類為最多，生物量大。小球藻通過(guò)光合作用將CO2轉(zhuǎn)化為生物燃料、食物、飼料和高價(jià)值的生物活性物質(zhì)。以小球藻為原料，可以生產(chǎn)幾種不同的可再生生物燃料，如通過(guò)小球藻生物質(zhì)的厭氧消化生產(chǎn)沼氣;小球藻的油脂可以提煉生物柴油;光生物學(xué)上的生物產(chǎn)氫等[1]。另外，小球藻具有多種保健和藥理作用，是目前保健食品開(kāi)發(fā)應(yīng)用較理想和研究較多的微藻之一。通過(guò)對(duì)微藻生長(zhǎng)過(guò)程中能量和碳代謝的分析，Yang等人[2]證明了異養(yǎng)和混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)比光養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生了更多的ATP和生物量。

但是，有機(jī)碳供應(yīng)的可用性和可持續(xù)性仍然是大規(guī)模應(yīng)用的限制因素。木質(zhì)纖維素材料是有前途的原料，這主要是因?yàn)槠漭^為豐富且成本相對(duì)較低。單糖可以從木質(zhì)纖維素的水解獲得，且可以用作微藻異養(yǎng)或混合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)的碳源。D-葡萄糖（主要來(lái)自纖維素）和D-木糖（來(lái)自半纖維素）是木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中的兩種主要碳水化合物。D-葡萄糖被證明是許多微藻生長(zhǎng)的合適碳源，如C. rypthecodinium cohnii， Schizochytrium sp，Nitzschia laevis，Euglena gracilis，Galdieria sulphuraria和Chlorella等[3]。盡管學(xué)術(shù)界已經(jīng)深入研究了用D-葡萄糖培養(yǎng)微藻，但關(guān)于D-木糖利用的報(bào)道非常有限。缺乏有效的攝取系統(tǒng)和（或）相關(guān)的代謝途徑可能是導(dǎo)致這種情況的主要原因。Neish[4]評(píng)估了各種碳水化合物對(duì)小球藻（Chlorella vulgaris）生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，D-葡萄糖、D-果糖、D-半乳糖和β-葡萄糖苷是藻類生長(zhǎng)的碳和能量的物質(zhì)來(lái)源，但很少甚至沒(méi)有關(guān)于包括木糖的戊糖生長(zhǎng)的模擬。同樣，Samejima和Myers[5]發(fā)現(xiàn)盡管葡萄糖和半乳糖支持微藻生長(zhǎng)，但是C. pyrenoidosa和小球藻橢球體很難在木糖上生長(zhǎng)。此外，Hassall[6]證明D-木糖不能用作微藻類pyrenoidosa化學(xué)合成的基質(zhì)，相反，其作為光合作用的特異性抑制劑，在存在0.5%D-木糖（33mM）的情況下，細(xì)胞分裂被阻止并且微藻的顏色在幾天內(nèi)消失。

本文的研究目的是確定小球藻的最適培養(yǎng)基以及對(duì)糖的具體利用情況，將小球藻進(jìn)行21d光照培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)后的藻液進(jìn)行DNS和薄層層析分析。通過(guò)不同培養(yǎng)基的比對(duì)、確定最適pH、小球藻對(duì)木糖的最大耐受、混合糖（木糖和葡萄糖）培養(yǎng)及薄層層析分析糖的具體利用情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在一定范圍（0.5g/L）內(nèi)，木糖對(duì)小球藻的生長(zhǎng)并不表現(xiàn)出抑制;pH也是影響小球藻利用木糖生長(zhǎng)的重要因素。此外還發(fā)現(xiàn)，葡萄糖存在時(shí)會(huì)降低木糖的利用，這也很好地佐證了葡萄糖為小球藻生長(zhǎng)最佳碳源的結(jié)論。

2 材料和方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

小球藻（Chlorella. sp）為生物精煉河南省工程實(shí)驗(yàn)室保藏小球藻L4;HSM培養(yǎng)基、BBM培養(yǎng)基溶液和BG-11用于小球藻營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。

2.2 方法

2.2.1 培養(yǎng)。接種前，從斜面挑取小球藻在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，置于26℃光照下培養(yǎng)，獲得生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的藻液，按107/100mL計(jì)數(shù)接種（采用血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)）于相應(yīng)培養(yǎng)基，每組三個(gè)重復(fù)，后置于26℃照射21d。

2.2.2 生物量測(cè)定。收集適量藻液，于8 000r/min離心5min，沉淀于85℃下烘2h，后采用差重法稱取干重。

2.2.3 還原糖測(cè)定。培養(yǎng)后的藻液經(jīng)過(guò)離心后取上清，再進(jìn)行DNS測(cè)定，計(jì)算糖利用率[7];培養(yǎng)后的藻液經(jīng)離心后進(jìn)行薄層層析分析，根據(jù)顯色結(jié)果分析小球藻對(duì)糖的具體利用情況。

2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究對(duì)比了小球藻在三種不同的培養(yǎng)基HSM、BBM和BG-11中的干重和木糖利用率，設(shè)置的木糖含量梯度為0.5、1.0、1.5g/L和2.0g/L，pH為7，經(jīng)過(guò)21d光照培養(yǎng)后測(cè)小球藻的干重和木糖利用率。基于HSM培養(yǎng)基，分析小球藻利用木糖和葡萄糖的情況。前期研究顯示，木糖會(huì)抑制小球藻生長(zhǎng)，因此，為了使實(shí)驗(yàn)效果更明顯，選擇糖含量為2.0g/L。此外，為了分析pH對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響，設(shè)置pH梯度為pH6、pH6.5、pH7、pH7.5和pH8。經(jīng)過(guò)相同的培養(yǎng)條件后測(cè)小球藻干重和木糖利用率。為了分析小球藻對(duì)木糖的最大耐受，通過(guò)增加木糖含量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。設(shè)置的木糖含量為1、2、4、6、8、10g/L和12g/L，pH選最優(yōu)pH，為6.5，同樣經(jīng)過(guò)21d光照培養(yǎng)，測(cè)小球藻干重和木糖利用率。為了進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，對(duì)其進(jìn)行混合糖培養(yǎng)，由此來(lái)確定混合糖培養(yǎng)是否有利于小球藻的生長(zhǎng)。為了分析混合糖中各組分的具體利用情況，采用薄層層析對(duì)培養(yǎng)后的藻液進(jìn)行分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

小球藻在三種不同的培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)21d培養(yǎng)后，生長(zhǎng)情況如圖1所示。培養(yǎng)液顏色的深淺可以大體反映小球藻的生物量。從圖中可以明顯看出：小球藻在HSM培養(yǎng)基中顏色最深，說(shuō)明其生長(zhǎng)得較好;在BG11培養(yǎng)基中顏色較淺;BBM培養(yǎng)基中顏色較BG11更淺。單獨(dú)來(lái)看每一種培養(yǎng)基，在HSM中，木糖濃度的增加對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響不明顯;BG11培養(yǎng)基中每組分小球藻生長(zhǎng)情況差異也不大;而在BBM培養(yǎng)基中，可以明顯看出小球藻液存在一定的梯度，最右邊顏色最深的為CK，之后木糖含量增加，小球藻液顏色越來(lái)越淺，可見(jiàn)，木糖對(duì)小球藻的生長(zhǎng)存在抑制作用。小球藻具體的生物量以及木糖的利用情況如圖2和圖3所示。

從圖2和圖3可以看出，在HSM培養(yǎng)基中，添加木糖對(duì)小球藻生長(zhǎng)存在一定的影響，當(dāng)木糖含量為0.5g/L和1.0g/L時(shí)，小球藻的生物量略高于CK;而隨著木糖含量的增加，小球藻的生物量開(kāi)始下降，說(shuō)明木糖開(kāi)始抑制小球藻的生長(zhǎng)。整體來(lái)看，添加木糖使得小球藻的生物量先增加后降低。在BG11培養(yǎng)基中，CK的小球藻生物量高于實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明木糖抑制了小球藻的生長(zhǎng)。但木糖含量不同，對(duì)小球藻生長(zhǎng)的抑制情況也不同，當(dāng)木糖含量為1.0g/L和1.5g/L時(shí)，小球藻的生物量有所增加，但仍低于CK。在BBM培養(yǎng)基中，添加木糖對(duì)小球藻的生長(zhǎng)抑制明顯，實(shí)驗(yàn)組的生物量明顯低于CK。

就三種培養(yǎng)基而言，三種培養(yǎng)基中的CK差異也明顯，在HSM培養(yǎng)基中，小球藻生長(zhǎng)明顯好于其他兩種培養(yǎng)基。這主要是因?yàn)檫@三種培養(yǎng)基中的鹽分、碳源和氮源含量不同：HSM培養(yǎng)基中的C含量要高于其他兩種培養(yǎng)基;BG11和BBM中的N含量相對(duì)較高。此后的實(shí)驗(yàn)都基于HSM培養(yǎng)基。

3.2 初始糖的不同及pH對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

添加的初始糖為木糖和葡萄糖，含量都為2g/L時(shí)，小球藻在不同pH的HSM培養(yǎng)基中的干重和糖利用率如圖4和圖5所示。

從圖4和圖5可以看出，添加的初始糖不同，小球藻的生物量也存在一定差異。在相同的pH下，初始糖為葡萄糖時(shí)，小球藻的生物量相對(duì)好于木糖，只有在pH為6.5時(shí)，初始糖為木糖時(shí)小球藻生物量略高于葡萄糖。造成這種現(xiàn)象的原因是葡萄糖作為碳源能更快地進(jìn)入代謝循環(huán)，適宜小球藻的生長(zhǎng)，而木糖并不能直接作為小球藻的碳源，木糖含量的增加或者pH的改變都可能抑制小球藻的生長(zhǎng)。初始糖為木糖時(shí)，隨著PH的增加，小球藻的生物量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì);pH為6.5時(shí)，小球藻生物量最高，之后開(kāi)始下降。圖5的木糖利用率趨勢(shì)和圖4的小球藻干重趨勢(shì)大致相同。當(dāng)初始糖為葡萄糖時(shí)，pH為6、7和8時(shí)，小球藻生物量差異不大;pH為7.5時(shí)，小球藻生物量最低，且葡萄糖的利用率也是最低。可見(jiàn)，葡萄糖的利用率整體高于木糖。綜上，pH也是影響小球藻生長(zhǎng)的重要條件。初始糖為木糖時(shí)小球藻最適宜的pH為6.5，此后實(shí)驗(yàn)選擇6.5為初始pH。

3.3 小球藻對(duì)木糖的最大耐受

增加木糖含量時(shí)，小球藻的生物量和木糖利用率如圖6所示。

從圖6可知，CK和木糖濃度為1.0g/L時(shí)，小球藻生物量高于上述結(jié)果，說(shuō)明小球藻在pH為6.5時(shí)生長(zhǎng)較pH為7.0時(shí)有明顯優(yōu)勢(shì)。同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中只有木糖時(shí)，隨著糖含量的增加，小球藻的生物量隨之下降，說(shuō)明木糖對(duì)小球藻的抑制作用越來(lái)越嚴(yán)重，木糖含量為6g/L時(shí)，小球藻的生物量?jī)H為0.79g/L。圖中并未顯示出6g/L后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，這是因?yàn)槟咎呛坷^續(xù)增加時(shí)，小球藻的生長(zhǎng)已經(jīng)嚴(yán)重受影響，不能正常生長(zhǎng)而死亡，故無(wú)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。由此可得出，小球藻對(duì)木糖的最大耐受在6g/L左右。

3.4 混合糖培養(yǎng)對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

同時(shí)添加木糖和葡萄糖，總糖含量為2、2.5、3、3.5、4、4.5、5g/L，以木糖∶葡萄糖分別為1∶1和1∶1.5進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，觀察對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響。培養(yǎng)后測(cè)得的小球藻生物量和利用率如圖7和圖8所示。

通過(guò)這兩組實(shí)驗(yàn)可以明顯發(fā)現(xiàn)，混合糖培養(yǎng)效果好于單糖培養(yǎng)。當(dāng)木糖∶葡萄糖為1∶1時(shí)，小球藻的生物量隨著糖含量的增加不斷增加，但糖利用率卻在下降。干重在糖含量為5g/L時(shí)出現(xiàn)最大，為2.01g/L，而糖利用率在糖含量為2.5g/L時(shí)出現(xiàn)最大，為70.31%。當(dāng)木糖：葡萄糖為2∶3時(shí)，大體趨勢(shì)和木糖∶葡萄糖為1∶1時(shí)相似，最大干重出現(xiàn)在木糖含量4.5g/L時(shí)，為2.06g/L，最大的糖利用率出現(xiàn)在糖含量3g/L時(shí)，為76.25%。這可能是由于添加了葡萄糖之后，會(huì)改善木糖對(duì)小球藻生長(zhǎng)的抑制。為了分析混合糖中木糖和葡萄糖的具體利用情況，下面進(jìn)行薄層層析分析糖的具體利用情況。

3.5 薄層層析分析混合糖利用情況

此次進(jìn)行分析的總糖含量為6g/L，在木糖∶葡萄糖分別為1∶1和1∶1.5時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，顯色后的情況如圖9所示。

注：T為實(shí)驗(yàn)組;M為糖標(biāo)準(zhǔn)液;G為葡萄糖;X為木糖。

通過(guò)圖譜分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組中都未顯示出葡萄糖的點(diǎn)，說(shuō)明葡萄糖大部分被利用，而木糖點(diǎn)的顏色會(huì)略淺于實(shí)驗(yàn)組，說(shuō)明木糖被少部分利用。這個(gè)圖直觀反映了混合糖培養(yǎng)時(shí)小球藻會(huì)優(yōu)先利用葡萄糖，當(dāng)葡萄糖用完時(shí)才開(kāi)始利用木糖?；谶@個(gè)猜想，經(jīng)過(guò)DNS計(jì)算過(guò)利用總糖后，對(duì)這次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理，結(jié)果如表1所示。

從表中可以清晰地發(fā)現(xiàn)，加入葡萄糖過(guò)多，導(dǎo)致木糖幾乎沒(méi)有利用。當(dāng)木糖∶葡萄糖=1∶1時(shí)，木糖可以被少許利用，和之前只加木糖的實(shí)驗(yàn)相比，木糖的利用明顯降低。當(dāng)木糖∶葡萄糖=2∶3時(shí)，木糖幾乎沒(méi)有被利用。分析認(rèn)為，當(dāng)有葡萄糖存在時(shí)，小球藻會(huì)優(yōu)先利用葡萄糖，當(dāng)葡萄糖耗盡時(shí)才開(kāi)始利用木糖;加入葡萄糖確實(shí)有利于小球藻生長(zhǎng)，但會(huì)限制木糖的利用。因此，為了提高小球藻利用木糖的量，應(yīng)添加適量的葡萄糖。

4 結(jié)論

通過(guò)分析上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，小球藻在HSM培養(yǎng)基中可以利用木糖，且小球藻的生物量也明顯好于其他兩種培養(yǎng)基;在木糖含量為0.5g/L時(shí)，小球藻生長(zhǎng)情況較好且木糖的利用率也較高。此濃度下，并未表現(xiàn)出木糖對(duì)小球藻生長(zhǎng)的抑制，但木糖含量增加會(huì)對(duì)小球藻生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。從小球藻對(duì)木糖最大耐受實(shí)驗(yàn)中可以看出，只有木糖存在時(shí)，木糖含量增加，小球藻生長(zhǎng)情況變差，木糖含量超過(guò)6g/L后，小球藻已經(jīng)不能正常生長(zhǎng)。之后進(jìn)行的不同pH培養(yǎng)可以發(fā)現(xiàn)，pH對(duì)小球藻的生長(zhǎng)確實(shí)存在一定影響，當(dāng)pH為6.5時(shí)，小球藻的干重明顯優(yōu)于pH為7時(shí)，因此之后部分實(shí)驗(yàn)pH選為6.5。在進(jìn)行混-

基于此猜想，對(duì)DNS測(cè)糖利用的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在混合糖實(shí)驗(yàn)中，假設(shè)葡萄糖全部被利用，經(jīng)過(guò)計(jì)算，發(fā)現(xiàn)木糖的利用最大，為0.7g/L，在單糖實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)木糖含量為6g/L時(shí)，木糖利用可以達(dá)到5.4g/L，而在2g/L木糖單獨(dú)存在時(shí)，木糖的利用可以達(dá)到1.8g/L，相比于只加木糖，添加葡萄糖使得小球藻對(duì)木糖的利用大大降低。通過(guò)這些數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)，隨著木糖含量的增加，小球藻利用木糖的量也在增加，但其生長(zhǎng)已經(jīng)受到抑制。當(dāng)培養(yǎng)基中加入葡萄糖后，小球藻的生長(zhǎng)情況可以得到明顯改善，但木糖的利用明顯減少，小球藻會(huì)大量利用葡萄糖，也就是說(shuō)，加入葡萄糖可以緩解木糖對(duì)小球藻生長(zhǎng)的抑制。在之后的實(shí)驗(yàn)中，會(huì)繼續(xù)探究小球藻對(duì)木糖的利用情況，尋找葡萄糖的最適含量，以得到小球藻生長(zhǎng)最適宜的糖濃度。

參考文獻(xiàn)：

[1]Kapdan I K， Fikret Kargi. Bio-hydrogen production from waste materials[J]. Enzyme & Microbial Technology，2006（5）：569-582.

[2]Yang C， Hua Q， Shimizu K. Energetics and carbon metabolism during growth of microalgal cells under photoautotrophic， mixotrophic and cyclic light-autotrophic/dark-heterotrophic conditions[J]. Biochemical Engineering Journal，2000（2）：87-102.

[3]Bumbak F， Stella Cook， Vilém Zachleder， et al. Best practices in heterotrophic high-cell-density microalgal processes： achievements， potential and possible limitations[J]. Applied Microbiology & Biotechnology， 2011（1）：31-46.

[4]Neish A. C. Carbohydrate nutrition of Chlorella vulgaris[J]. Can J Bot，1951（29）：68-78.

[5]Samejima H， Myers J. On the Heterotrophic Growth of Chlorella pyrenoidosa[J]. Journal of General Microbiology， 1958（1）：107.

[6]Hassall K A. Xylose as a Specific Inhibitor of Photosynthesis[J]. Nature， 1958（4618）：1273-1274.

[7]劉秀花，崔孟岐，王莉，等.雙向薄層色譜法分析混合糖組分[J].商丘師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2015（6）：69-73.

[8]Miller G L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars[J]. Analytical Chemistry，1959（3）：426-428.

[9]劉秀花，王莉，張淑紅，等.薄層色譜法分析玉米芯降解液糖類成分優(yōu)化研究[J].商丘師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2014（9）：55-59.