趙夢(mèng)鶴 許玉姣 王海語(yǔ) 劉磊 吳碩 王笑峰

[摘要]?目的 了解青島地區(qū)EB病毒（EBV）陽(yáng)性惡性血液病病人RPMS1基因變異特征，并探討RPMS1變異與惡性血液病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

方法選取青島地區(qū)惡性血液病病人345例和健康成人93例為研究對(duì)象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定EBV DNA拷貝數(shù);采用巢式PCR和DNA測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)EBV陽(yáng)性惡性血液病病人和健康成人外周血RPMS1序列，根據(jù)其特征性突變和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)對(duì)基因變異進(jìn)行分類(lèi)，并與同一地區(qū)健康人群RPMS1變異類(lèi)型的分布進(jìn)行比較。

結(jié)果有218例EBV陽(yáng)性標(biāo)本完成測(cè)序分析，共發(fā)現(xiàn)3種RPMS1亞型，即RPMS1-A、RPMS1-B和RPMS1-C。RPMS1-A型為主要亞型，在172例標(biāo)本中檢測(cè)到，其基因序列高度保守，除個(gè)別散在突變外基本與標(biāo)準(zhǔn)株B95-8一致;RPMS1-C相對(duì)較少，以D51N突變?yōu)樘卣?RPMS1-B變異型最少，分別以S65N突變和S98G突變?yōu)樘卣鳌?/p>

結(jié)論青島地區(qū)EBV陽(yáng)性惡性血液病和健康人群RPMS1基因型均以RPMS1-A型為主，而RPMS1-B和RPMS1-C變異型的地域性分布及其與惡性血液病的確切關(guān)系尚不清楚。

[關(guān)鍵詞]?RPMS1;皰疹病毒4型，人;白血病;骨髓增生異常綜合征;多態(tài)性，限制性片段長(zhǎng)度

[中圖分類(lèi)號(hào)]?R733.7

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]?A

[文章編號(hào)]??2096-5532（2019）01-0059-06

SIGNIFICANCE OF EPSTEIN-BARR VIRUS RPMS1 GENE POLYMORPHISM IN PATIENTS WITH HEMATOLOGICAL MALIGNANCY

ZHAO Menghe， XU Yujiao， WANG Haiyu， LIU Lei， WU Shuo， WANG Xiaofeng

（Department of Medical Microbiology， Qingdao University Medical College， Qingdao 266021， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the characteristics of RPMS1 gene variation in patients with Epstein-Barr virus （EBV）-positive hematological malignancy in Qingdao， China and the association of RPMS1 variation with the development and progression of hematological malignancy.

MethodsA total of 345 patients with hematological malignancy and 93 healthy adults in Qingdao were selected as subjects. Quantitative real-time PCR was used to measure EBV DNA copy number， and then nested PCR and DNA sequencing were used to determine the sequence of RPMS1 in peripheral blood of the patients with EBV-positive hematological malignancy and healthy adults. The gene variations were classified according to their characteristic mutations and phylogenetic trees， and the distribution of RPMS1 variants was compared between the patients with EBV-positive hematological malignancy and healthy adults.

ResultsSequencing was performed for 218 EBV-positive specimens， and three subtypes of the RPMS1 gene were found， i.e.， RPMS1-A， RPMS1-B， and RPMS1-C. RPMS1-A was a major subtype of RPMS1 and was detected in 172 specimens; its gene sequence was highly conserved and was basically consistent with the standard strain B95-8 except for a few sporadic mutations. RPMS1-C was less common than RPMS1-A and was characterized by D51N mutation. RPMS1-B was the least common subtype and was characterized by S65N mutation and S98G mutation.

ConclusionRPMS1-A is the major subtype of RPMS1 in patients with EBV-positive hematological malignancy and health adults in Qingdao， and further studies are needed to clarify the regional distribution of RPMS1-B and RPMS1-C variants and their association with hematological malignancy.

[KEY WORDS]RPMS1; herpesvirus 4， human; leukemia; myelodysplastic syndromes; polymorphism， restriction fragment length

EB病毒（EBV）是皰疹病毒科嗜淋巴細(xì)胞病毒屬的成員，在人群中廣泛感染，已有調(diào)查顯示90%以上的健康成人攜帶該病毒[1]。EBV感染與人類(lèi)多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括Burkitt淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤（NHL）、鼻咽癌、平滑肌肉瘤及胃癌等[2-6]。有關(guān)EBV基因多態(tài)性的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種EBV亞型，但EBV變異與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系仍未明確。鼻咽癌在中國(guó)南方地區(qū)發(fā)病率高，而在中國(guó)北方和其他國(guó)家較少見(jiàn)。有研究表明，不同地域的EBV呈不同亞型，而同一地區(qū)的健康人與腫瘤病人體內(nèi)EBV呈不同亞型，所以有學(xué)者認(rèn)為EBV基因變異是地域相關(guān)而不是疾病相關(guān)[7-9]。在EBV潛伏感染期表達(dá)的產(chǎn)物除了核抗原（EBNA）家族、潛伏膜蛋白（LMP）以及EBV編碼小RNA（EBER）基因之外，還有BamHI A區(qū)右向轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（BARTs）家族[10-13]。其中，BARTs是EBV潛伏感染時(shí)表達(dá)最為廣泛的基因家族之一，參與多種EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，而RPMS1基因是迄今為止BARTs家族唯一確定了全長(zhǎng)cDNA結(jié)構(gòu)的成員，其編碼結(jié)構(gòu)由BARTs基因第Ⅳ、Ⅴ外顯子剪接而形成[14-16]。目前尚不清楚RPMS1在惡性血液病中的序列變異情況及其生物學(xué)意義。本研究對(duì)青島地區(qū)白血病、骨髓增生異常綜合征（MDS）及淋巴瘤外周血EBV陽(yáng)性標(biāo)本中RPMS1基因多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，探討在惡性血液病發(fā)生中EBV感染與RPMS1基因多態(tài)性是否存在相互關(guān)系，以及RPMS1基因突變?cè)趷盒匝翰“l(fā)生發(fā)展中的作用。

1?資料與方法

1.1?研究對(duì)象

2016年12月—2017年12月，選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院的住院及門(mén)診病例345例，其中白血病193例，MDS 83例，淋巴瘤69例。以青島市健康成人咽漱液（TW）93例為對(duì)照組。

1.2?試劑與儀器

蛋白酶K、酚、氯仿、異戊醇購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，引物由北京華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，高保真Taq DNA聚合酶購(gòu)自大連TaKaRa公司。PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)ABI公司 2700型，DNA測(cè)序由北京華大基因生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.3?DNA提取

取受試者外周血4 mL，EDTA抗凝， 1 200 r/min離心10 min，吸取中間白細(xì)胞層，采用酚-氯仿-異戊醇抽提法常規(guī)提取外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA，無(wú)菌水溶解后檢測(cè)DNA濃度，取100 ng的DNA用于PCR擴(kuò)增。同時(shí)分離血漿置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4?實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EBV DNA拷貝數(shù)

采用EBV-PCR熒光定量檢測(cè)試劑盒實(shí)時(shí)熒光定量PCR（FQ-PCR）方法檢測(cè)EBV基因組中特定BamH I-W序列的擴(kuò)增情況，操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)

明書(shū)。引物序列如下。正向：5′-CCCAACACTCCA-CCACACC-3′，反向：5′-TCTTAGGAGCTGTCCG-AGGG-3′;雙標(biāo)記熒光探針：5′-（FAM）-CACAC-ACTACACACACCCACCCGTCTC-（TAMRA）-3′。

用系列濃度梯度（每升1010，109，108，107，106，105拷貝）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所有樣品均進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。診斷試劑盒檢測(cè)下限為每升106拷貝，低于該檢測(cè)限值的EBV DNA拷貝數(shù)被認(rèn)為EBV陰性。

1.5?PCR擴(kuò)增

應(yīng)用巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增RPMS1編碼基因（B95-8 coordinates138352-160531），所用引物見(jiàn)表1。首先采用RPMS1-1和RPMS1-2進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，然后應(yīng)用RPMS1-3和RPMS1-4進(jìn)行第2輪擴(kuò)增。第1輪的反應(yīng)體系為20 μL，包括10×Buffer 2.0 μL，上下游引物各0.4 μmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U，DNA模板100 ng。循環(huán)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min;然后94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。取第1輪PCR產(chǎn)物3 μL為第2輪擴(kuò)增PCR模板，反應(yīng)體系為30 μL。循環(huán)條件為：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物以15 g/L瓊脂糖凝膠電泳。每次PCR均設(shè)水對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為EBV陽(yáng)性細(xì)胞系B95-8，陰性對(duì)照為EBV陰性細(xì)胞系Jurkat。

1.6?測(cè)序分析

取第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物25 μL，采用末端終止法進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物為內(nèi)側(cè)PCR引物。測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Chromes軟件查看峰圖文件，用DNAStar軟件（Lasergene，version 7.0）進(jìn)行剪接序列和對(duì)排分析，以EBV標(biāo)準(zhǔn)株B95-8序列（GenBank收錄號(hào)：V01555）作為參比序列，同時(shí)與基因庫(kù)中相關(guān)序列進(jìn)行對(duì)比分析。采用DNAStar軟件中Clastal W 方法對(duì)基因序列或蛋白序列進(jìn)行比對(duì)和同源性分析，對(duì)RPMS1基因變異類(lèi)型繪制系統(tǒng)樹(shù)，以輔助對(duì)基因變異進(jìn)行分類(lèi)。

1.7?統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)間比較采用χ2檢驗(yàn)及精確概率法。

2?結(jié)??果

2.1RPMS1基因的序列變異

本研究共有218例EBV陽(yáng)性標(biāo)本RPMS1基因測(cè)序成功，包括76例白血病、34例MDS、24例淋巴瘤及84例健康人TW標(biāo)本。在所有標(biāo)本的測(cè)序峰圖中，同一核苷酸位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)雙峰，表明均為單一RPMS1序列。經(jīng)與B95-8標(biāo)準(zhǔn)株RPMS1基因序列對(duì)比，在所有標(biāo)本中共發(fā)現(xiàn)12處核苷酸突變位點(diǎn)，其中9處為錯(cuò)義突變，其余為同義突變。根據(jù)RPMS1基因的突變情況，將其分為3種主要類(lèi)型，并進(jìn)一步分為4種亞型。所有標(biāo)本的RPMS1基因變異情況見(jiàn)圖1，含有相同核苷酸序列的標(biāo)本予以合并，并以其中的1例樣本作為其代表株。

共檢出與B95-8標(biāo)準(zhǔn)株RPMS1核苷酸序列相同的標(biāo)本172例，包括急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）30例、急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）20例、慢性白血?。–L）5例、MDS 32例、NHL 12例、霍奇金淋巴瘤（HL）4例和健康人TW 82例。其中有3例發(fā)生同義突變（g155268a、a155282g、g155495a）。另外，在12例標(biāo)本中各檢出散在氨基酸突變，分別為S46Y、P50L、Y54H、P71S、R84H、G91V。以上與B95-8具有相同RPMS1核苷酸序列或只有散在突變位點(diǎn)的分離株歸為RPMS1-A型。

有5例標(biāo)本在第194位密碼子發(fā)生S65N突變，包括1例AML、1例CL和3例NHL。另外在11例標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)S98G突變，包括5例ALL、2例AML、1例CL、2例MDS和1例健康人TW。以上具有S65N突變和S98G突變的分離株分別歸為RPMS1-B1和RPMS1-B2亞型，此兩種亞型共同組成RPMS1-B型（本文研究均以RPMS1-B型作為一組進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析）。另外，有17例標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)D51N突變，包括2例ALL、6例AML、3例CL、5例NHL和1例健康人TW;值得注意的是，在這17例標(biāo)本中有4例檢測(cè)到了S65N和D51N兩處共有突變，我們將這些具有D51N突變的分離株歸為RPMS1-C亞型。

2.2?系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

以圖1中12條RPMS1基因序列（相同序列只取代表株）繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，系統(tǒng)樹(shù)共分為3大支系，其中一支為無(wú)突變或僅有散在突變的RPMS1-A型;另一支為RPMS1-B型，該支系又分為2組，分別為RPMS1-B1和RPMS1-B2亞型;最后一支為RPMS1-C型。見(jiàn)圖2。

2.3RPMS1變異類(lèi)型在不同疾病中的分布

RPMS1基因各變異型在青島地區(qū)的白血病、MDS、淋巴瘤和健康人TW中的分布見(jiàn)表2。本研究各疾病中RPMS1-A均為主要類(lèi)型，其在EBV陽(yáng)性ALL、EBV陽(yáng)性AML、EBV陽(yáng)性MDS、EBV陽(yáng)性淋巴瘤以及EBV陽(yáng)性健康人TW中所占比率分別為：81.08%（30/37）、68.97%（20/29）、50.00%（5/10）、94.12%（32/34）、60.00%（12/20）和97.62%（82/84）。

標(biāo)本號(hào)下括號(hào)中的數(shù)字后為與ALL、AML、CL、MDS、NHL、HL和TW樣本具有相同核苷酸序列的數(shù)目。

使用鄰接方法繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，右側(cè)顯示RPMS1亞類(lèi)型。線段的長(zhǎng)度對(duì)應(yīng)進(jìn)化距離。

2.3.1RPMS1基因型在惡性血液病與健康人群的分布比較?EBV陽(yáng)性ALL、AML、CL、MDS、淋巴瘤以及健康人TW之間RPMS1基因型分布比較結(jié)果顯示，RPMS1基因型在上述疾病中的分布差異有顯著性（χ2=37.296，P<0.01）。進(jìn)一步分析表明，RPMS1-A型在健康人TW中的比率顯著高于4種EBV相關(guān)腫瘤（P<0.01），而健康人TW與MDS中RPMS1基因型分布差異無(wú)顯著性（P>0.05）;RPMS1-B型在健康人TW的比率顯著低于ALL和AML（P<0.05），而在其他疾病中分布差異則無(wú)顯著性（P>0.05）;RPMS1-C型在健康人TW的比率低于AML和NHL（P<0.01），而在其他疾病中分布差異則無(wú)顯著性（P>0.05）。

2.3.2RPMS1各亞型在不同惡性血液病之間的分布比較?EBV陽(yáng)性ALL、AML、CL、MDS以及淋巴瘤之間RPMS1基因各亞型的分布比較結(jié)果表明，RPMS1-A及RPMS1-B亞型在不同的惡性血液病之間分布差異無(wú)顯著性（P>0.05）。RPMS1-C型在EBV陽(yáng)性的ALL、CL、NHL之間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.040、0.030）;在EBV陽(yáng)性的MDS和AML、NHL之間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002、0.001）。

3?討??論

近年來(lái)EBV感染與惡性血液病之間的關(guān)系已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。有研究顯示，骨髓移植后EBV陽(yáng)性病人易發(fā)生淋巴增生性疾病[17]。研究顯示，EBV-IgG陽(yáng)性且EBV-IgM陽(yáng)性的母親，其子女罹患ALL的危險(xiǎn)性顯著增加，表明母親妊娠期間感染EBV與兒童ALL的發(fā)生有關(guān)[18]。此外，淋巴細(xì)胞白血病是淋巴細(xì)胞增殖性疾病，且EBV也可感染淋巴細(xì)胞，故考慮淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)病與EBV存在一定關(guān)系。至2002年已經(jīng)報(bào)道了1例臨床上EBV相關(guān)的ALL[19]。因此，EBV感染與惡性血液病的相關(guān)性日益受到重視。BARTs家族是EBV重要的致病基因，其編碼復(fù)雜的基因產(chǎn)物，且其在所有感染細(xì)胞類(lèi)型中穩(wěn)定表達(dá)[20]。重組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能夠在細(xì)菌中編碼103個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)RPMS1，而雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RPMS1可以與RBP-Jk/CBF1相互作用[21]。基于以上研究結(jié)果，本文實(shí)驗(yàn)對(duì)RPMS1基因進(jìn)行了檢測(cè)。

本研究成功對(duì)青島地區(qū)218例EBV陽(yáng)性樣本中RPMS1基因全長(zhǎng)進(jìn)行了測(cè)序及多態(tài)性分析，包括76例白血病、34例MDS、24例淋巴瘤以及84例健康人TW標(biāo)本。本文結(jié)果表明，EBV陽(yáng)性惡性血液病和健康人群中的EBV RPMS1高度保守，均以RPMS1-A型為主要亞型，而以RPMS1-C型為次要亞型，RPMS1-B型最少。

到目前為止，大樣本量的關(guān)聯(lián)研究中已經(jīng)鑒定出以g155391a為代表的與鼻咽癌高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的RPMS1基因序列變異，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在其他EBV相關(guān)腫瘤（如EBVaGC、Burkitt淋巴瘤和HL）與g155391a變異之間并無(wú)相關(guān)性，表明RPMS1 g155391a變異可能對(duì)鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展具有特異性[22-24]。另有研究結(jié)果顯示，RPMS1在大多數(shù)鼻咽癌細(xì)胞系及組織中異常表達(dá)，但在淋巴瘤細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)甚至不表達(dá)，在鼻咽癌外周血淋巴細(xì)胞中也未檢測(cè)到該基因轉(zhuǎn)錄，且在鼻咽癌細(xì)胞系或鼻咽癌腫瘤活檢中并沒(méi)有內(nèi)源性RPMS1蛋白表達(dá)的報(bào)道[25-26]。在RPMS1 g155391a變異中鳥(niǎo)嘌呤突變?yōu)橄汆堰蕦?dǎo)致了天冬氨酸變?yōu)樘於０?，而這種氨基酸改變可能與RPMS1轉(zhuǎn)錄或表達(dá)有關(guān)。而本研究中絕大部分RPMS1基因核苷酸序列與標(biāo)準(zhǔn)株B95-8的序列一致，其中有17例標(biāo)本中檢出這一核苷酸突變，這一結(jié)果與之前的實(shí)驗(yàn)一致[22-24]。

值得注意的是，本文研究結(jié)果顯示，在EBV陽(yáng)性白血病中存在RPMS1-C亞型g155391a變異，而EBV陽(yáng)性MDS中則少有這一變異。MDS是起源于造血干細(xì)胞的一組異質(zhì)性髓系克隆性疾病，向AML轉(zhuǎn)化的概率較高，為白血病的前期病變[27]。推測(cè)RPMS1蛋白的第51位氨基酸變異可能與MDS向白血病轉(zhuǎn)化有關(guān)，但其機(jī)制還需進(jìn)一步研究。本文結(jié)果還顯示，RPMS1-B2亞型a155532g變異在健康人TW的比率顯著低于急性白血病病人，提示腺嘌呤突變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤引起的RPMS1蛋白的S98G變異可能與急性白血病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)g155434a與g155391a突變同時(shí)出現(xiàn)，該突變此前未見(jiàn)報(bào)道，可能為地域性特有突變。因此我們推測(cè)，RPMS1蛋白的第84位氨基酸和第91位氨基酸可能存在一定關(guān)聯(lián)。

目前研究關(guān)于特定EBV毒株是否可以促進(jìn)EBV相關(guān)惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展這一問(wèn)題仍存在爭(zhēng)議。根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)及突變特征，本研究將EBV毒株分為RPMS1-A、RPMS1-B和RPMS1-C等3種基因型。RPMS1-A型是青島地區(qū)的主要亞型，共在172例標(biāo)本中檢出，其基因序列高度保守，除個(gè)別散在突變外基本與標(biāo)準(zhǔn)株B95-8一致;RPMS1-C型相對(duì)較少，以D51N突變?yōu)樘卣?RPMS1-B變異型最少，分別以S65N突變和S98G突變?yōu)樘卣?。?duì)RPMS1基因型分布比較結(jié)果顯示，EBV陽(yáng)性惡性血液病和健康人群RPMS1基因的多態(tài)性分布差異有顯著性，其中RPMS1-B2基因型在健康人群中的比率顯著低于急性白血病，提示RPMS1-B2基因型可能與急性白血病發(fā)生有關(guān)。另外，RPMS1-C基因型在健康人群中的比率顯著低于4種EBV陽(yáng)性惡性血液病，且在白血病中檢出率明顯高于MDS及健康人TW，提示RPMS1-C基因型可能與MDS向白血病的轉(zhuǎn)化有關(guān)。

本研究?jī)H局限于RPMS1基因多態(tài)性的分析。為明確RPMS1的3種主要基因型在EBV陽(yáng)性惡性血液病發(fā)生發(fā)展中的作用，仍需進(jìn)行進(jìn)一步的生物學(xué)功能等的研究。

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