項展愷

摘? ?要：通過培養(yǎng)青花菜幼苗并提取DNA，以所得DNA為模板克隆青花菜MYB基因，并對該基因進行測序。測序后，利用生物信息學手段進行序列分析，包括尋找同源序列、同源序列蛋白質(zhì)翻譯比對、分析翻譯所得蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)，預(yù)測結(jié)構(gòu)域和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。從青花菜中克隆得到的BoMYB基因，其編碼263個氨基酸，蛋白序列中具有2個SANT結(jié)構(gòu)域。對比在擬南芥中的研究推測，該基因可能在滲透脅迫響應(yīng)中起作用。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，BoMYB與歐洲油菜的MYB聚為一組，它們與擬南芥的MYB處于不同分支。對BoMYB基因的克隆與序列進行分析，為探究青花菜MYB基因的表達、功能及抗逆機理研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：青花菜;MYB基因;克隆;序列分析

文章編號： 1005-2690（2019）01-0112-03? ? ? ?中圖分類號： S635.3? ? ? ?文獻標志碼： B

青花菜（Brassica oleracea var. italica），又名西蘭花、綠花菜，是市場上常見的蔬菜之一，浙江臺州是我國的青花菜主產(chǎn)地，建有全國最大的青花菜生產(chǎn)中心，是當?shù)夭宿r(nóng)出口創(chuàng)匯的重要蔬菜作物。植物在生長發(fā)育過程中，經(jīng)常會受到外界不良環(huán)境的影響，如干旱、水澇、病蟲害等，導(dǎo)致生長受阻。青花菜也一樣，在整個生育期中受多種因子的脅迫，引起產(chǎn)量和品質(zhì)下降，最終影響菜農(nóng)的收入。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子之一，其不僅在調(diào)節(jié)植物次生代謝[1]、細胞分化、細胞周期[2]以及葉片等器官形態(tài)建成中發(fā)揮作用，還在植物生長發(fā)育及抗逆境脅迫過程中起著極其重要的作用，如擬南芥AtMYB2受ABA誘導(dǎo)表達，并與RdBPI蛋白相互作用協(xié)調(diào)Rd22的表達，從而提高植物的抗逆境能力[3]等。當植物受到干旱、低溫等非生物因素脅迫時，會誘導(dǎo)MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達，并通過結(jié)合相應(yīng)的順式作用元件，激活并調(diào)控下游基因的表達，從而對植物的抗逆能力產(chǎn)生影響[4]。但在青花菜中，尚未有關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子存在的報道。

本研究嘗試在提取青花菜葉片DNA的基礎(chǔ)上克隆青花菜BoMYB基因，利用生物信息學手段分析其序列特征及與同源序列的差異，預(yù)測該基因的生物學功能，為探究青花菜MYB基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1? ?材料與方法

1.1? ?植物樣本與試劑

1.1.1? ?植物樣本

試驗材料為青花菜“優(yōu)秀”品種，培育于人工氣候箱，2葉1心時從植株上采集葉片用于DNA的提取。

1.1.2? ?主要試劑

使用“新型植物基因組DNA快速提取試劑盒”，試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。dNTPs購自生工生物工程（上海）股份有限公司，Taq酶購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司。

1.2? ?方法

1.2.1? ?DNA提取

提取青花菜DNA的步驟為：在1.5 mL離心管中加入450 μL溶液A，然后加入β-巰基乙醇至濃度為0.5%;取兩片同一株青花菜的葉子，設(shè)為A和B葉片;將A葉片撕成幾片，放入研缽A中;打開液氮瓶，將適量液氮倒入研缽A中，并用研棒研磨葉片;待液氮完全消失后，觀察葉片是否已完全成粉末狀;將研磨好的粉末A加到以上預(yù)備好的離心管中;對于葉片B，重復(fù)以上步驟;粉末A分別放入標記的離心管1和離心管2;粉末B分別放入標記的離心管3和離心管4;將離心管1、2、3、4，65 ℃水浴30 min（期間每隔10 min輕輕顛倒混勻樣品一次）;水浴完成后，加入5 μL RNase，混勻，37 ℃水浴1 h;再加入400 μL溶液B，充分混勻，常溫下放置5 min，再用高速冷凍離心機于12 000 rpm離心5 min;用500 μL氯仿抽提一次;將上清液用移液槍轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入600 μL異丙醇，充分混勻，室溫放置10 min。12 000 rpm離心10 min，小心去除上層清液;加入600 μL去除溶液C，顛倒混勻兩次，用槍頭輕輕吹打沉淀，12 000 rpm離心5 min，棄廢液;于室溫敞蓋放置20 min（至無明顯乙醇味）;加入80 μL溶液D（相應(yīng)離心管中即為基因組DNA溶液）;取5 μL 于1%的瓊脂糖凝膠上進行電泳鑒定。5 min后，棄廢液;于室溫敞蓋放置20 min（至無明顯乙醇味）;加入80 μL溶液D（離心管中即為基因組DNA溶液）。

1.2.2? ?PCR擴增

采用上游引物（5'-ATGGCGGATCGTATTA-3'）、下游引物（5'-CTACTCGATTCTTCCAACT-3'）進行PCR擴增，引物由上海生工合成。PCR反應(yīng)體系共20μL，2μL 10×buffer（含20 mmol/L? Mg2+），DNA模板0.8 μL，上/下游引物（20 μmol/L）各0.3μL，0.5μL dNTPs（10 mmol/L）（上海生工），0.4 μL Taq DNA聚合酶（2 U/μL）（北京鼎國），不足的部分加ddH2O補充。反應(yīng)在Bio-Rad S1000型PCR儀上進行，PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸90 s，32個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。將克隆的BoMYB基因送上海生工測序，獲得目的序列。

1.2.3? ?序列分析

對測得的青花菜MYB基因序列進行序列分析，利用NCBI數(shù)據(jù)庫的在線工具BLAST尋找同源序列;利用Clustal X進行BoMYB及其同源序列的多序列比對;進化樹構(gòu)建采用MEGA5.05;登陸http：//smart.embl-heidelbery.de/，預(yù)測結(jié)構(gòu)域;登陸https：//web.expasy.org/protparam/和https：//web.expasy.org/protscale/，預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì);登陸https：//www.predictprotein.org/，利用PSIPRED在線工具進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。

2? ?結(jié)果與討論

2.1? ?青花菜BoMYB基因的擴增

利用PCR擴增得到的青花菜BoMYB基因長度約為950 bp，與預(yù)期結(jié)果大小基本一致，條帶單一、清晰、明亮，說明PCR擴增成功，可用于后續(xù)的測序和分析。

2.2? ?青花菜BoMYB基因序列分析

測序結(jié)果表明，BoMYB的基因組全長為903 bp，具有一個內(nèi)含子，長度為111 bp，兩個外顯子的長度分別為369 bp和423 bp。BoMYB的編碼區(qū)全長為792 bp，編碼263個氨基酸。

通過BLAST進行同源序列比對，得到8條同源序列，利用Clustal X和GeneDoc，對BoMYB基因及其同源序列的編碼蛋白進行多序列比對。

同源序列比對結(jié)果表明， 1-110，166-171、175-185、252-273、284-305等位點高度保守，但序列中也存在一些殘基的不同，這些位點可能具有功能性價值;BoMYB與其同源序列相比，129-165位點缺失，63、118、221、231、233、285、286、293等位點有新的氨基酸出現(xiàn)。

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明，該基因與BoMYB和歐洲油菜（B. napus）聚為一支，擬南芥（Arabidopsis thaliana）超級家族基因和小鹽芥（Eutrema salsugineum）聚為一支。BoMYB和歐洲油菜BnMYB親緣關(guān)系最近，推測可能有與該類蛋白具有相似的功能。

2.3? ?蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)

利用ProtParam tool檢索蛋白質(zhì)序列的理化參數(shù)，分析結(jié)果表明，BoMYB所翻譯成的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為29 168.00 Da，分子式為C1263H1997N385O382S15，不穩(wěn)定系數(shù)為59.39，總平均疏水性-0.615，說明該蛋白為親水蛋白。

2.4? ?蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過PSIPRED在線軟件對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白有α-螺旋（H）79 個、β-折疊（E）2個，有無規(guī)則卷曲（C）182個，即α-螺旋和無規(guī)則卷曲是該蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的主要組成部分。

2.5? ?蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

利用SMART在線軟件預(yù)測青花菜MYB基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。該蛋白含有兩個SANT結(jié)構(gòu)域，分別位于序列的5-54和 57-105處，符合MYB家族蛋白的結(jié)構(gòu)特征。目前，對MYB家族SANT結(jié)構(gòu)域的研究報道較少。SANT可調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性，在調(diào)節(jié)目的基因表達的過程中發(fā)揮重要的作用[5]。如在擬南芥中，SANT可增加擬南芥對鹽和滲透脅迫的抗性，但BoMYB是否能影響青花菜對鹽和滲透脅迫的抗性還有待進一步的研究。

3? ?討論與展望

轉(zhuǎn)錄因子是一類能與啟動子結(jié)合，并調(diào)控下游基因表達的特殊蛋白，常見的有MYB、WRKY、bZIP、AP2和NAC等[6]。MYB以基因家族的形式存在，在植物生長發(fā)育、次生代謝、形態(tài)建成、生物脅迫和非生物脅迫中起著重要作用[7]。

本研究以青花菜為材料，克隆到了一個MYB基因，命名為BoMYB。BoMYB的基因組DNA全長為903 bp，具有一個內(nèi)含子，長度為111 bp，以及兩個外顯子，長度分別為369 bp和423 bp。編碼區(qū)全長為792 bp，編碼263個氨基酸，含兩個SANT結(jié)構(gòu)域。

序列比對結(jié)果表明，BoMYB與歐洲油菜BnMYB的差異最小，僅存在個別氨基酸殘基的差異，與8個擬南芥MYB的差異相對較大，在系統(tǒng)發(fā)育樹上處于不同的分支。在二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲和α-螺旋的數(shù)量最多，β-折疊的數(shù)量最少，僅2個。推測該基因可能在滲透脅迫響應(yīng)中起作用，以適應(yīng)缺水等不良環(huán)境，但其在這類逆境中的生物學功能尚待進一步研究。下一步將研究BoMYB基因在滲透脅迫下的表達模式，并明確其在該脅迫下的功能。

參考文獻：

[ 1 ] Uimari A，Strommer J. Myb26： A MYB-like protein of pea flowers with affinity for promoters of phenylpropanoid genes[J]. The Plant Journal， 1997，12（06）：1 273-1 284.

[ 2 ] Lea U S，Slimestad R，Smedvig P，et al. Nitrogen deficiency enhances expression of specific MYB and bHLH transcription factors and accumulation of end products in the flavonoid pathway[J]. Planta，2007，225（05）：1 245-1 253.

[ 3 ] Hiroshi A，Takeshi U，Takuya I，et al.Arabidopsis At MYC2 （b HLH）and At MYB2 （MYB） function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J]. The Plant Cell，2003，15（01）：63-78.

[ 4 ] 許玲，衛(wèi)培培，張大勇，等. 大豆轉(zhuǎn)錄因子基GmMYB111的克隆及功能分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2015，48（15）：3 079-3 089.

[ 5 ] 賈樂東，李施蒙，許代香，等.甘藍型油菜BnMYB80基因的生物信息學分析[J].植物學報，2016，51（05）：620-630.

[ 6 ] Abe H，Urao T，Ito T，et al. Arabidopsis AtMYC2（bHLH） and AtMYB2 （MYB） function as transcriptional activators in abscisic acid signaling[J]. Plant Cell，2003（15）：63-78.

[ 7 ] 牛義嶺，姜秀明，許向陽.植物轉(zhuǎn)錄因子MYB 基因家族的研究進展[J]. 分子植物育種，2016，14（08）：2 050-2 059.

（收稿日期：2018-12-17）