李愛國，李玲梅，張欣婷，劉力，王偉

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)祈福醫(yī)院，廣東 廣州 511495)

近年來，由于環(huán)境污染、食品添加劑的濫用導(dǎo)致免疫受損人群不斷增多，加之家庭飼養(yǎng)寵物的風(fēng)行等，使得真菌病發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。淺部感染真菌主要分為小孢子菌屬、表皮癬菌屬和毛癬菌屬，大約有40多種皮膚癬菌，其中白色念珠菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌為常見致病菌株[1]。目前，臨床上常用抗真菌感染藥物主要有多烯類抗生素、氨基甲酸酯類和咪唑類等；但是，其對(duì)人體均有不同程度的毒副作用，同時(shí)由于使用不規(guī)范、濫用等問題，導(dǎo)致耐藥性日益嚴(yán)重，迫切需要尋找安全有效的新抗真菌藥物[2]。

三氧(即臭氧)是一種常溫下有特殊臭味的淡藍(lán)色氣體，被稱為21世紀(jì)的氣體分子藥物，具有強(qiáng)氧化作用；高純度醫(yī)用三氧對(duì)細(xì)菌、病毒、真菌等多種病原微生物均可起殺滅作用，具有“綠色”殺菌的特點(diǎn)；同時(shí)還能促進(jìn)清除氧自由基，減輕關(guān)節(jié)滑膜及周圍組織炎癥[3]?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于公共衛(wèi)生和日常生活中，在歐洲已有近百年的使用歷史[4]。本院采用獨(dú)家發(fā)明專利技術(shù)[5]，利用臭氧發(fā)生器，將三氧溶解于紫草油中，進(jìn)而制備成復(fù)方中藥軟膏劑——三氧膏，提高其穩(wěn)定性、方便攜帶和涂抹、提高患者的順應(yīng)性，而且其透皮性能好，有利于三氧滲透發(fā)揮抗菌作用。為了驗(yàn)證三氧膏的抗真菌效果，本實(shí)驗(yàn)以白色念珠菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌等臨床常見致病真菌為研究對(duì)象，以抑菌環(huán)直徑及最低抑菌濃度為指標(biāo)，評(píng)價(jià)其體外抗真菌作用。同時(shí)，以臨床常用酮康唑?yàn)閷?duì)照，應(yīng)用三氧膏通過涂抹方式治療足癬患者，評(píng)價(jià)其治療效果，為其臨床的進(jìn)一步應(yīng)用及推廣提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥 酮康唑乳膏(西安楊森制藥有限公司，批號(hào)：170622856，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：2%)；紫草膏(武漢建民集團(tuán)隨州藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1705067，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：35.71%)；三氧膏(廣東祈福醫(yī)院有限公司自制，批號(hào)：20180509，質(zhì)量分?jǐn)?shù):0.84%)；二甲基亞砜(Sigma公司)；瓊脂粉、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)、沙堡弱培養(yǎng)基(SDA)、M-H瓊脂、燕麥培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

1.1.2 菌株 白色念珠菌(Canidiaalbicans，SC 5314)，中山大學(xué)附屬口腔醫(yī)院提供；須癬毛癬菌(Trichophytonmentagrophytes，NBRC 6202)、紅色毛癬菌(Trichophytonrubrum，ATCC MYA-4438)和石膏樣小孢子菌(Microsporum，gypseum，ATCC 14683)，廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.1.3 主要儀器 LI20-2細(xì)菌培養(yǎng)箱(美國Shellab)；Infinite 200 PRO酶標(biāo)儀(瑞士Tecan)；萬分之一電子天平(瑞士Mettler Toledo)；SG-404SG-604生物安全柜(美國Baker)；DVM6顯微鏡(德國Leica)；DendiCHEK plus電子比濁儀(生物梅里埃美國股份有限公司)；YXQ-LS-50SII高壓滅菌器(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外抗真菌活性測(cè)定[6]

1.2.1.1 培養(yǎng)基配制 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、沙堡弱培養(yǎng)基、M-H瓊脂和燕麥培養(yǎng)基等按處方說明稱取，倒入三角瓶中，加入一定量的蒸餾水，攪勻封口，高壓滅菌(121 ℃，30 min)，滅菌后分別倒入一次性平板，冷藏備用。

1.2.1.2 真菌的復(fù)蘇、培養(yǎng)和菌懸液的制備 ①將白色念珠菌用SDA活化，35 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌拭子挑取單個(gè)菌落加入無菌生理鹽水，采用電子比濁儀調(diào)節(jié)菌液濁度至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?，相?dāng)于1～5×106CFU/ mL。②分別將須癬毛癬菌和石膏樣小孢子菌用PDA平板、紅色毛癬菌用燕麥培養(yǎng)基進(jìn)行活化誘導(dǎo)產(chǎn)孢，30 ℃培養(yǎng)7 d，用無菌拭子刮取平板表面孢子加入無菌生理鹽水中，采用電子比濁儀調(diào)節(jié)菌液濁度至0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫?。③分別將上面的菌懸液稀釋1 000倍作為MIC測(cè)定的菌懸液備用。

1.2.1.3 抑菌圈直徑測(cè)定(紙片法) 分別稱取一定量的三氧膏、紫草膏和酮康唑乳膏，制備成含藥量為0.5 mg的藥敏片，另以乳膏基質(zhì)為空白參照；吸取白色念珠菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌的菌懸液各0.1 mL，分別均勻涂布于M-H瓊脂平板上，放置3～5 min，再將3種藥敏片及空白藥敏片等距離(紙片間間距大于24 mm)貼放于含菌瓊脂板上，倒置于培養(yǎng)箱中，白色念珠菌30 ℃培養(yǎng)24 h，其他菌30 ℃培養(yǎng)72 h后測(cè)量抑菌圈，重復(fù)3次試驗(yàn)；用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，取平均值。結(jié)果判定：比較抑菌圈直徑大小，越大則表示越敏感。

1.2.1.4 最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定 分別稱取一定量的三氧膏、紫草膏和酮康唑乳膏，用10%二甲基亞砜溶解配成0.48 mg/mL原液。根據(jù)二倍稀釋法將原液用RPMI-1640液體培養(yǎng)基稀釋成濃度為240、120、60、30、15、7.5、3.75、1.88、0.94、0.47、0.24 μg/mL的系列溶液。吸取系列不同濃度藥液和菌懸液各100 μL于96孔板第1～11孔中，第12孔加入配制溶劑和菌懸液各100 μL作陰性對(duì)照；同時(shí)，另設(shè)“藥液+液體培養(yǎng)基”為對(duì)照以消除每孔藥物稀釋后存在顏色和渾濁度差異；置培養(yǎng)箱中，白色念珠菌35 ℃培養(yǎng)48 h，其他菌30 ℃培養(yǎng)96 h。將96孔板置于酶標(biāo)分析儀中，于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)各孔吸光度(A)值。與陰性對(duì)照孔相比，以A值下降80%以上者為該藥物的最低抑菌濃度(MIC值)。

1.2.2 臨床療效觀察

1.2.2.1 一般資料 選取2017年5月—2018年5月我院收治足癬患者共計(jì)326例，其中男性150例、女性176例，年齡18～50歲，近1個(gè)月內(nèi)均未用過抗真菌藥物。隨機(jī)平分為三氧膏治療組和酮康唑乳膏治療組，每組各163例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《臨床皮膚病學(xué)》[7]，根據(jù)臨床表現(xiàn)：足跟、足跖、足趾及足旁的米粒大丘疹、水皰、片狀脫屑，呈環(huán)狀附于皮損邊緣為主，伴有不同程度的瘙癢。同時(shí)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室真菌分離檢查確診。所有患者符合皮膚真菌感染(足癬)診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。兩組患者的一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2.2.2 治療方法 患者早晚用溫水將足部清洗干凈，擦干水分，分別取三氧膏、酮康唑乳膏薄涂于患處，同時(shí)按摩促進(jìn)滲透。兩組均治療14 d為1個(gè)療程，治療結(jié)束后復(fù)診。治療期間囑患者盡量保持足部干爽、每日更換襪子。

1.2.2.3 療效判斷標(biāo)準(zhǔn) (1)痊愈：皮損消退，無新發(fā)皮疹；(2)顯效：皮損消退60%以上；(3)有效：皮損消退30%～60%；(4)無效：皮損消退不足30%或無變化。臨床治療療效總有效率為痊愈、顯效在患者中所占比例之和。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 抑菌圈直徑比較

結(jié)果見表1。三氧膏、酮康唑乳膏對(duì)白色念珠菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌等4種致病真菌的抑菌圈直徑范圍分別為26.62～31.64 mm、29.44～34.49 mm，試驗(yàn)菌對(duì)兩種藥物均表現(xiàn)為高度敏感，但兩種藥物的抗菌活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。紫草膏、乳膏基質(zhì)抑菌圈直徑均為9.20 mm，表現(xiàn)為無抗菌作用，兩者間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。三氧膏、酮康唑乳膏與紫草膏、乳膏基質(zhì)的抑菌圈直徑相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。對(duì)4種致病真菌的敏感程度強(qiáng)弱順序依次為酮康唑乳膏>三氧膏>紫草膏=乳膏基質(zhì)。

表1 不同藥物對(duì)4種真菌的抑菌圈直徑

Table1Inhibition zone diameter of different drugs on four kinds of fungiD/mm

真菌菌株三氧膏紫草膏酮康唑乳膏乳膏基質(zhì)白色念珠菌26.62±0.44*#9.20±0.00$&29.44±0.33*#9.20±0.00$&須癬毛癬菌28.29±0.40*#9.20±0.00$&34.43±0.43*#9.20±0.00$&紅色毛癬菌30.97±0.47*#9.20±0.00$&32.05±0.57*#9.20±0.00$&石膏樣小孢子菌31.64±0.52*#9.20±0.00$&34.49±0.49*#9.20±0.00$&

與乳膏基質(zhì)比較：*P<0.05；與紫草膏比較：#P<0.05；與酮康唑乳膏比較：$P<0.05；與三氧膏比較：&P<0.05。

2.2 最低抑菌濃度比較

結(jié)果見表2、圖1。紫草膏對(duì)4種致病真菌的抑制作用很弱，MIC值≥240 μg/mL；酮康唑乳膏則具有很強(qiáng)的抑制作用，MIC值范圍為0.47～15 μg/mL；三氧膏亦具有較強(qiáng)的抑制作用，MIC值范圍為0.94～15 μg/mL。三氧膏與酮康唑乳膏對(duì)4種致病真菌的MIC值與紫草膏相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；三氧膏與酮康唑乳膏相比，對(duì)須癬毛癬菌、紅色毛癬菌的MIC值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而對(duì)白色念珠菌、石膏樣小孢子菌的MIC值差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對(duì)4種致病真菌的抑制強(qiáng)弱順序依次為酮康唑乳膏>三氧膏>紫草膏。

表2 不同藥物對(duì)4種真菌的最低抑菌濃度

Table2MIC of different drugs on four kinds of fungiρ/(μg·mL-1)

真菌菌株三氧膏紫草膏酮康唑乳膏白色念珠菌7.50-15.0b>120a7.50-15.0b須癬毛癬菌1.88-3.75bc>120ac<0.12ab紅色毛癬菌0.47-0.94bc>120ac0.12～0.24ab石膏樣小孢子菌3.75-7.50bc>120ac0.94-1.88ab

與三氧膏比較：aP<0.05；與紫草膏比較：bP<0.05；與酮康唑乳膏比較：cP<0.05。

0.60.50.40.30.20.10.0酮康唑膏紫草膏三氧膏酮康唑膏紫草膏三氧膏酮康唑膏紫草膏三氧膏酮康唑膏紫草膏三氧膏1.41.21.00.80.60.40.20.0-0.21.21.00.80.60.40.20.01.21.00.80.60.40.20.0A15306000.240.943.75120ρ/(μg?mL-1)ABCDAAA

A.白色念珠菌； B.須癬毛癬菌； C.紅色毛癬菌； D.石膏樣小孢子菌。

圖1不同濃度藥物對(duì)4種真菌的抑制作用

Figure1Inhibitory effect of different concentration drugs on four kinds of fungi

2.3 兩組足癬患者臨床療效的比較

結(jié)果見表3所示，三氧膏治療組的足癬臨床治療總有效率為85.28%，酮康唑乳膏治療組總有效率為79.75%，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明三氧膏臨床療效與酮康唑相當(dāng)。治療過程中三氧膏治療組未見任何不良反應(yīng)，酮康唑乳膏治療組有個(gè)別病例出現(xiàn)刺痛感。

表3 兩組足癬患者臨床療效的比較

Table3Comparison of clinical efficacy of two groups of patients with tinea pedis [n(%)]

組別N痊愈顯效有效無效總有效率三氧膏 16393(57.06) 46(28.22) 16(9.82) 8(4.91)139(85.28)酮康唑163 75(46.01)55(33.74) 18(11.04) 15(9.20)130(79.75)

3 討論

目前，醫(yī)用三氧療法已在多種疾病治療中開展應(yīng)用，如腫瘤[9]、急性腦梗死[10]、慢性失眠[11]、關(guān)節(jié)炎[12]、口腔潰瘍[13]、手足口病[14]等，前景十分廣泛。

本文就三氧膏在抗真菌方面的活性研究發(fā)現(xiàn)，其對(duì)白色念珠菌、須癬毛癬菌、紅色毛癬菌和石膏樣小孢子菌等致病性真菌的抑菌圈直徑為26.62～31.64 mm、MIC為0.47～15.0 μg/mL，均表現(xiàn)出顯著的抑制作用；抗菌活性由強(qiáng)至弱依次為紅色毛癬菌>須癬毛癬菌>石膏樣小孢子菌>白色念珠菌。三氧膏抑制淺部真菌的作用機(jī)制可能是：三氧膏里面的三氧化學(xué)分子式為O3，三氧具有很強(qiáng)的氧化性，遇到生物大分子發(fā)生以下反應(yīng)：O3+生物大分子→O2+O，單個(gè)氧原子具有很強(qiáng)的氧化性。細(xì)胞色素p450酶系能催化大量生物底物氧化，能從氧分子獲得極強(qiáng)的氧化力，其活性部位含有一個(gè)結(jié)合于血紅素卟啉基上的鐵原子，與O2結(jié)合后形成鐵氧配合物，即三氧膏中的O2與細(xì)胞色素p450酶系的血紅鐵相結(jié)合，干擾了淺部真菌細(xì)胞膜中麥角甾醇的生物合成，產(chǎn)生抗真菌作用。

足癬是由致病性皮膚絲狀真菌引起的常見皮膚真菌病，具有高發(fā)病率及傳染性，治療不當(dāng)則難以治愈。臨床治療效果顯示，三氧膏對(duì)于足癬患者總有效率高達(dá)85.28%，效果顯著；且治療過程無不良反應(yīng)，愈后暫未發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)病例。因此，三氧膏作為新的綠色抗真菌藥物，值得在臨床上進(jìn)一步推廣應(yīng)用。