施肖堃 盧園萍 蔡志欣 郭仲杰 陳美元 廖劍華

摘?要：【目的】通過多個雙孢蘑菇菌株不同發(fā)育階段的差異轉(zhuǎn)錄組分析，為進一步驗證雙孢蘑菇發(fā)育相關(guān)基因及探討其分子機理奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā繉﹄p孢蘑菇主栽品種As2796及其親本02、8213，其回交子代W192，以及國外野生菌株ARP159、國內(nèi)野生菌株AgLH830共6個具有重要代表性的菌株子實體原基期、幼菇期、采摘期、開傘期等4個不同發(fā)育階段共24個樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序，并與雙孢蘑菇參考基因組序列進行比對，根據(jù)比對結(jié)果進行各基因在不同樣品中的表達量分析及差異表達基因識別，發(fā)掘新基因與共同基因的差異表達，并進行各數(shù)據(jù)庫的基因功能注釋。【結(jié)果】結(jié)果共鑒定到10 660個轉(zhuǎn)錄本，發(fā)掘新基因677個，其中237個得到功能注釋。與原基期相比，6個菌株在幼菇期、采摘期和開傘期分別有49、82、73個共同差異表達基因，其中有13個是相同的基因。【結(jié)論】發(fā)現(xiàn)了一批在雙孢蘑菇子實體不同發(fā)育階段具有顯著差異表達的基因，篩選出不同菌株不同階段的共有差異基因，對雙孢蘑菇子實體發(fā)育中重要的差異基因進行了注釋與探討。

關(guān)鍵詞：雙孢蘑菇;子實體發(fā)育;轉(zhuǎn)錄組測序;差異表達基因

中圖分類號：S 646.11文獻標識碼：A文章編號：1008-0384（2019）07-775-07

Abstract： 【Objective】Transcriptome analysis was conducted on Agaricus bisporus at 4 developmental stages to identify the genes associated with and decipher the molecular mechanism involving the fungal development. 【Method】From 6 representative strains of A. bisporus including main cultivar As2796， its parents 02 and 8213， its backcrossing offspring W192， foreign wild strain ARP159， and domestic wild strain AgLH830， at primordium， young， harvesting， and opening stages， 24 fruiting body specimens were collected for transcriptome sequence analysis. By aligning them against the reference genome sequence of A. bisporus， the genes that were differentially expressed were identified. Both unique and common differentially expressed genes （DEGs） were clearly exposed to be annotated using the databases to determine their specific functions. 【Result】 Among the 10 660 transcripts obtained， 677 genes were unique with 237 functionally annotated. The tested A. bisporus shared 49 common DEGs between primordium and young stages， 82 between primordium and harvest stages， and 73 between primordium and pileus opening stages. And， 13 genes were found commonly present in the various strains. 【Conclusion】 Both unique and common DEGs in A. bisporus at the 4 developmental stages were identified and annotated in the study.

Key words： Agaricus bisporus; fruiting body development; transcriptome sequencing; differentially expressed gene

0?引言

【研究意義】轉(zhuǎn)錄組研究是發(fā)掘功能基因的重要途徑，通過樣本間基因表達差異比較，進而鑒定與特殊性狀相關(guān)的候選基因，然后通過生物信息學(xué)方法和后續(xù)的實驗對候選基因進行功能分析和驗證，有利于在動植物疾病、功能基因組、育種等領(lǐng)域取得重要的科學(xué)發(fā)現(xiàn)[1-2]。轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）是一種高效、快捷的轉(zhuǎn)錄組研究手段，通過高通量測序技術(shù)對樣品中mRNA反轉(zhuǎn)錄形成的cDNA進行測序，統(tǒng)計相關(guān)讀段（Reads）可計算出不同基因的表達量，該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域?！厩叭搜芯窟M展】轉(zhuǎn)錄組測序在食用菌研究中也有應(yīng)用，例如楊芳等[3]通過對雞樅菌的轉(zhuǎn)錄組進行測序，分析發(fā)現(xiàn)了可能參與降解纖維素和木質(zhì)素等相關(guān)酶類編碼基因;Chen等[4]結(jié)合香菇基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析香菇木質(zhì)素降解相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子的表達情況，揭示了該菌降解木質(zhì)纖維素的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。Fu等[5]通過比較白靈菇不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了一系列與子實體形成相關(guān)的基因。

【本研究切入點】前期對雙孢蘑菇子實體不同發(fā)育與后熟時期開展了系列差異蛋白質(zhì)組分析[6-9]，在此基礎(chǔ)上，本研究擬對雙孢蘑菇Agaricus bisporus （J.E.Lange） Imbach國內(nèi)主栽品種As2796及其親本02、8213，回交子代W192，以及國外野生菌株ARP159，國內(nèi)野生菌株AgLH830共6個具有重要代表性的菌株子實體原基期、幼菇期、采摘期、開傘期[8]4個不同發(fā)育階段的樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過同一菌株不同發(fā)育階段及不同菌株同一發(fā)育階段間的差異比較，挖掘高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等特性相關(guān)的基因，分析國內(nèi)外菌株的異同點，發(fā)現(xiàn)與雙孢蘑菇子實體生長、發(fā)育相關(guān)基因與通路，用于指導(dǎo)育種工作。

1?材料與方法

1.1?供試菌株

供試菌株As2796、02、8213、W192、ARP159、AgLH830由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏并提供。供試樣品為該6個菌株子實體原基期、幼菇期、采摘期、開傘期4個不同發(fā)育階段的樣品，共24個樣品。

1.2?試驗方法

1.2.1?子實體取樣

常規(guī)栽培獲得的雙孢蘑菇子實體按照之前的方法[8]進行不同發(fā)育階段的采樣，經(jīng)液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2?總RNA提取

待測子實體樣品加液氮研磨成粉末，用真菌總RNA提取試劑盒（Fungal Total RNA Extraction Kit，OMEGA公司產(chǎn)品）按照試劑盒說明書進行總RNA提取。

1.2.3?轉(zhuǎn)錄組測序

提取的總RNA送交北京百邁客生物科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組測序。包括樣品檢測、文庫構(gòu)建、上機測序、測序數(shù)據(jù)處理及質(zhì)量控制等步驟，均按照之前的方法[10-11]進行。

1.2.4?生物信息學(xué)分析

測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析包括與參考基因組的序列比對、可變剪接分析、新基因發(fā)掘、差異表達基因識別、差異表達基因功能注釋和富集分析等，均按照文獻[10]進行?；虮磉_量計算采用FPKM（reads per kb per million reads）方法[12]。

2?結(jié)果與分析

2.1?測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計

24個樣品數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計見表1。經(jīng)過測序質(zhì)量控制，共得到128.98 Gb Clean Data，各樣品Q30堿基百分比均不小于86.06%。利用TopHat 2[13]軟件將Clean Reads與參考基因組進行序列比對，獲得測序樣品特有的序列特征信息及在參考基因組或基因上的位置信息。根據(jù)比對結(jié)果，各樣品的Reads與雙孢蘑菇指定參考基因組的比對效率在69.21%～85.44%。2.2?新基因發(fā)掘

選擇雙孢蘑菇參考基因組序列，使用Cufflinks軟件對匹配的Reads進行拼接，并與參考基因組（https：//genome.jgi.doe.gov/Agabi_varbisH97_2/Agabi_varbisH97_2.home.html）注釋信息進行比較，共發(fā)掘677個新基因。使用BLAST[14]軟件將發(fā)掘的新基因與COG[15]，GO[16]，KEGG[17]，Swiss-Prot[18]，NR[19]等數(shù)據(jù)庫進行序列比對，在各數(shù)據(jù)庫獲得相應(yīng)注釋信息的新基因數(shù)量見表2，總共有237個基因獲得注釋。

2.3?差異表達分析

根據(jù)比對結(jié)果計算得到各基因表達量，使用EBSeq[20]進行差異分析，獲得測序樣品之間包括上調(diào)基因和下調(diào)基因在內(nèi)的差異表達基因集，其數(shù)目統(tǒng)計見表3?？梢钥闯鲆栽跒閰⒄?，不同菌株在后3個發(fā)育階段中基因上調(diào)或下調(diào)表達趨勢并不一致，以下調(diào)表達為主。對差異表達基因進行GO、COG、KEGG、Swiss-Prot、NR等數(shù)據(jù)庫的功能注釋，大多數(shù)的差異基因獲得了相應(yīng)的注釋信息（表4）。

2.4?菌株間共有差異基因分析

對雙孢蘑菇6個菌株子實體4個不同發(fā)育階段的差異表達基因進行分析，發(fā)現(xiàn)與原基期相比，6個菌株在幼菇期、采摘期和開傘期分別有49、82、73個共同差異表達基因，并對其進行功能注釋和富集分析。圖1～3顯示了原基期與幼菇期49個共同差異基因的分析結(jié)果，其中COG分類注釋結(jié)果表明差異基因主要集中在氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝、次級代謝產(chǎn)物合成、轉(zhuǎn)運與分解等11個功能類別，GO富集結(jié)果顯示它們主要參與代謝過程、催化活性等14項生物學(xué)過程、細胞組分或分子功能，而KEGG富集分析則表明這些差異基因主要參與脂肪酸代謝、類固醇與葉酸生物合成等途徑。

進一步統(tǒng)計表明，上述來自6個菌株不同發(fā)育階段的49、82、73個共同差異表達基因中有13個基因是相同的，這些基因與原基期相比的上下調(diào)差異表達貫穿于子實體后續(xù)階段的發(fā)育過程。表5列出了這些基因的ID、長度及在As2796子實體4個發(fā)育階段中的相對表達量，在其他5個菌株中的表達量趨勢也是一致的。與原基期比較，只有1個基因（Gene ID：estExt_fgenesh2_kg.C_10275）是上調(diào)表達的，該基因在Swiss-Prot注釋為可能是aminodeoxychorismate synthase（氨基脫氧分支酸合成酶）。其余的12個基因在后3個階段中是下調(diào)表達的，在Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫中分別注釋為transcriptional enhancer factor（轉(zhuǎn)錄增強因子） 、Long-chain-fatty-acid-CoA ligase（長鏈脂肪酸輔酶A連接酶）、O-methylsterigmatocystin oxidoreductase（甲基柄曲霉素氧化還原酶）、Zinc/cadmium resistance protein（鋅/鈣抗性蛋白）等。

3?討?論

本次轉(zhuǎn)錄組測序共24個樣品，即6個代表性雙孢蘑菇菌株的子實體原基期、幼菇期、采摘期、開傘期等4個不同發(fā)育階段的樣品，通過生物信息學(xué)分析及進一步的比較，發(fā)現(xiàn)了一批在雙孢蘑菇子實體不同發(fā)育階段具有顯著差異表達的基因，部分基因的相對表達量差異甚至高達千倍以上。

課題組前期已單獨分析了雙孢蘑菇As2796子實體發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組，對差異基因進行了注釋并篩選出了4個發(fā)育階段中基因相對表達量連續(xù)下調(diào)至痕量水平以及從痕量水平連續(xù)上調(diào)表達的差異基因[10]。吳小梅等[21]之前也對雙孢蘑菇一個菌株子實體發(fā)育的3個時期樣品進行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，列出了3個發(fā)育階段相對表達量大于15倍的18個差異基因。本文使用6個代表性菌株進行子實體發(fā)育不同階段的轉(zhuǎn)錄組分析，獲得了不同菌株間同個階段的共同差異基因，以及不同菌株不同階段的共有差異基因，從上述分析的不同角度對雙孢蘑菇子實體發(fā)育中重要的差異基因進行了注釋與探討。這些顯著的差異表達基因以及在6個菌株不同發(fā)育階段的共同差異表達基因是否與雙孢蘑菇生長發(fā)育、產(chǎn)量、質(zhì)量等相關(guān)，值得后期進行更深入的篩選與驗證分析。

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（責(zé)任編輯：黃愛萍）