王瑢 黃一平

摘要 目的：采用高效液相（HPLC）對比研究補(bǔ)陽還五湯傳統(tǒng)煎法和現(xiàn)代煎藥機(jī)法的指紋圖譜差異。方法：首先采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取不同產(chǎn)地的藥材配出10個不同批次的補(bǔ)陽還五湯配方，配制傳統(tǒng)煎法補(bǔ)陽還五湯供試品溶液和現(xiàn)代煎藥機(jī)補(bǔ)陽還五湯供試品溶液后，以優(yōu)化的色譜條件進(jìn)行HPLC指紋圖譜對比研究。結(jié)果：1）采用HPLC色譜法對補(bǔ)陽還五湯進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯專屬性良好。2）線性關(guān)系考察顯示阿魏酸回歸方程y=259.33X+48.708，r=0.999 9（n=5），結(jié)果表明阿魏酸對照品范圍0.997～9.97 μg/μL，線性考察結(jié)果顯示線性關(guān)系良好。3）精密度試驗(yàn)結(jié)果最終取大于總峰面積5%的色譜峰相對峰面積的RSD平均值2.014%，色譜峰相對保留時間RSD平均值0.29%，研究結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯供試品溶液精密度良好。4）穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果最終取大于總峰面積5%的色譜峰相對峰面積的RSD平均值1.839%，色譜峰相對保留時間RSD平均值0.02%，研究結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。5）重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果最終取大于總峰面積5%的色譜峰相對峰面積的RSD平均值1.901%，色譜峰相對保留時間RSD平均值0.72%，結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯的重復(fù)性良好。6）回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示平均回收率99.76%，RSD 2.14%，表明這一色譜條件下的HPLC方法檢測加樣回收率結(jié)果可靠。7）樣品測定結(jié)果顯示傳統(tǒng)煎法的補(bǔ)陽還五湯指紋圖譜131.88 min即完成檢測，而現(xiàn)代煎藥機(jī)法制備的補(bǔ)陽還五湯指紋圖譜在140 min才完成檢測;另外從圖譜中可見現(xiàn)代煎藥機(jī)制備的補(bǔ)陽還五湯中色譜峰更多。從各自的指紋圖譜相似度中可得，其中傳統(tǒng)煎法平均相似度為0.956，現(xiàn)代煎藥機(jī)法平均相似度為0.974，略高于傳統(tǒng)煎法。結(jié)論：傳統(tǒng)煎法和現(xiàn)代煎藥機(jī)法制備的補(bǔ)陽還五湯的HPLC指紋圖譜存在一定差異。

關(guān)鍵詞 高效液相;指紋圖譜;補(bǔ)陽還五湯;傳統(tǒng)煎法;現(xiàn)代煎藥機(jī);高壓;精密度;重復(fù)性

Abstract Objective：To compare the fingerprint difference of Buyang Huanwu Decoction between traditional decoction and modern decoction machine by high performance liquid chromatography（HPLC）.Methods：Firstly，random number table method was used to randomly select the prescription of 10 different batches of Buyang Huanwu Decoction of different batches，prepared the traditional decoction of Buyang Huanwu Decoction，and the modern decocting machine Buyang Huanwu Decoction.After the optimized chromatographic conditions，the HPLC fingerprint was compared.Results：1）HPLC chromatography was used to make a specific test of Buyang Huanwu Decoction，the results showed that the Buyang Huanwu decoction had good specificity.2）The linear relationship showed the regression equation of ferulic acid y=259.33X+48.708，r=0.999 9（n=5）.The results showed that the range of ferulic acid control was in 0.997～9.97 μg/μL，and the linear investigation showed that the linear relationship was good.3）The results of the precision test were 5% of the total peak area of the peak area of 5%，the average value of the relative peak area of the peak area was 2.014%，and the relative retention time of the chromatographic peak was 0.29% of the average value of RSD.The results showed that the precision of the solution of Buyang Huanwu decoction was good.4）Finally，the results of the stability test were 5% of the total peak area and the RSD average 1.839%.The chromatographic peak relative retention time RSD average value was 0.02%，and the research results showed that Buyang Huanwu decoction solution 24 h stability.5）The results of repeatability test were 5% of the total peak area，and the average value of the peak area was 1.901%，and the relative retention time of the chromatographic peak was 0.72%.The results of this study showed that the repeatability of Buyang Huanwu decoction was good.6）The average recovery was 99.76% and RSD was 2.14%.The results showed that the HPLC method under this chromatographic condition was reliable.7）The test results showed that the traditional decoction of Buyang Huanwu decoction fingerprint 131.88 min was completed，while the Buyang Huanwu decoction fingerprint made by the modern decocting machine was detected in 140 min，and the chromatogram peak of Buyang Huanwu decoction prepared by the modern decocting mechanism could be seen from the atlas.The average similarity of the traditional decocting method was 0.956 and the average similarity of the modern decocting machine method was 0.974，which is slightly higher than the traditional decocting method.Conclusion：The HPLC fingerprint of Buyang Huanwu decoction prepared by traditional decocting method and modern decocting machine is different.

Key Words High performance liquid chromatography; Fingerprint; Buyang Huanwu decoction; Traditional decoction; Modern decoction machine; High pressure; Precision; Repeatability

中圖分類號：R284 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.07.008

中藥煎劑是中藥臨床制備使用的傳統(tǒng)劑型之一，在中醫(yī)學(xué)中使用歷史悠久，應(yīng)用最為廣泛。在使用過程中，臨床醫(yī)師可根據(jù)中醫(yī)辨證論治對組方進(jìn)行隨癥加減來治療疾病，具有組成靈活、使用方便、療效顯著的特點(diǎn)，是中醫(yī)臨床診療的重要手段之一[1]。在中醫(yī)發(fā)展過程中，中藥煎劑的制備是以手工煎煮中藥飲片為主。但傳統(tǒng)的中藥煎煮方法用時過長，患者對先煎、后入等操作不明，甚至影響到藥物療效[2-3]。故隨著社會的發(fā)展，生活節(jié)奏的加快，臨床患者越來越不傾向于使用傳統(tǒng)煎劑，中藥煎藥機(jī)的出現(xiàn)則為患者提供了一個全新的選擇，與傳統(tǒng)煎藥方法比較，煎藥機(jī)具有省時、安全、方便的特點(diǎn)，特別是其中藥煎煮后使用簡便，而得到越來越廣泛的認(rèn)同[4]。但是現(xiàn)代煎藥機(jī)煎藥模式下的中藥方劑的有效性仍是一個值得關(guān)注的問題。由于臨床研究中對傳統(tǒng)煎煮法和現(xiàn)代煎藥機(jī)煎藥造成的藥物質(zhì)量上的差異，一直缺乏一個系統(tǒng)的、全面的、有效的評價，故現(xiàn)代煎藥機(jī)的效用常常受到部分醫(yī)生或患者的質(zhì)疑。本研究以傳統(tǒng)名方補(bǔ)陽還五湯為研究對象，通過使用分析高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜的方法，以比較傳統(tǒng)煎煮法和現(xiàn)代煎藥機(jī)煎藥所制備的煎劑之間是否存在化學(xué)成分差異，從而對現(xiàn)代煎藥機(jī)煎藥有效性進(jìn)行探討，以期對臨床上不同的煎煮方法所造成的質(zhì)量差異進(jìn)行全面評價，為臨床使用提供一定的參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 購于日本島津公司的高效液相色譜儀（型號：LC-20AT）、四元泵（型號：LC-20AT泵）和自動進(jìn)樣器（型號：SIL-20AC）等;購于美國羅門有限公司的Phenomenex Gemini C18柱（規(guī)格：5 μ m，4.6 mm×250 mm）。

1.2 試劑 購于蘇州市永邁物資有限公司色譜HPLC乙腈和色譜HPLC甲醇;中國食品藥品檢定研究院提供的超純水、蒸餾水和阿魏酸對照品（批號：110773-9910）。

1.3 分析樣品 補(bǔ)陽還五湯的藥方根據(jù)古方劑量，黃芪120 g、當(dāng)歸6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、桃仁3 g、紅花3 g、地龍3 g。補(bǔ)陽還五湯采用藥材來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用4.6 mm×250 mm的Phenomenex Gemini C18保護(hù)柱（5 μm），以30 ℃為柱溫，補(bǔ)陽還五湯供試品溶液或阿魏酸對照品溶液均在進(jìn)樣前以流動相梯度初始條件平衡30 min，進(jìn)樣量為15 μL，以乙腈為流動相A，0.05%磷酸水為流動相B，流速1.0 mL/min，流動相使用前須經(jīng)減壓抽濾脫氣，具體梯度洗脫程序見表2，檢測波長為230 nm。

2.2 對照品溶液的制備 首先將阿魏酸對照品精密稱取12.46 mg放置于60 ℃真空干燥，后放入廣口瓶中并加70%甲醇定容至25 mL，經(jīng)超聲重復(fù)溶解均勻，制成阿魏酸對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

2.3.1 傳統(tǒng)煎法供試品溶液制備 根據(jù)補(bǔ)陽還五湯配伍比例，取全部7味藥加10倍量蒸餾水浸泡30 min，采用傳統(tǒng)煎法加熱煮沸10 min后，轉(zhuǎn)小火煮50 min，趁熱采用0.45 μm微孔濾膜過濾，過濾液密封保存;剩余藥渣再加8倍量蒸餾水加熱煮沸，采用傳統(tǒng)煎法沸后10 min，轉(zhuǎn)小火煮50 min，采用0.45 μm微孔濾膜過濾，所取過濾液與第1次煎煮獲得的過濾液合并，濃縮，定容至3.60 g/ mL的補(bǔ)陽還五湯水煎液。精密量取0.2 mL補(bǔ)陽還五湯水煎液于10 mL量瓶中并以50%的甲醇定容，充分混合均勻后0.45 μm微孔濾膜濾過，即得傳統(tǒng)煎法供試品溶液。

2.3.2 現(xiàn)代藥煎機(jī)法供試品溶液制備 根據(jù)補(bǔ)陽還五湯配伍比例，取全部7味藥加10倍量蒸餾水浸泡30 min，采用現(xiàn)代煎藥機(jī)（高壓）法加熱60 min后，趁熱采用0.45 μm微孔濾膜過濾，過濾液密封保存;剩余藥渣再加8倍量蒸餾水，采用現(xiàn)代煎藥機(jī)（高壓）法加熱60 min，采用0.45 μm微孔濾膜過濾，所取過濾液與第一次煎煮獲得的過濾液合并，濃縮，定容至3.60 g/ mL的補(bǔ)陽還五湯水煎液。精密量取0.2 mL補(bǔ)陽還五湯水煎液于10 mL量瓶中并以50%的甲醇定容，充分混合均勻后0.45 μm微孔濾膜濾過，即得現(xiàn)代煎藥機(jī)法供試品溶液。

補(bǔ)陽還五湯根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法，隨機(jī)抽取藥材來源組合成方，共10個不同批次。見表3。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取同一供試品溶液根據(jù)2.3制備的供試品溶液，采用HPLC色譜法對補(bǔ)陽還五湯進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取阿魏酸對照品溶液2.0、5.0、10.0、15.0、20.0 μL，根據(jù)2.1色譜條件進(jìn)行HPLC色譜法檢測，記錄峰面積;以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，阿魏酸回歸方程y=259.33X+48.708，r=0.999 9（n=5），結(jié)果表明，阿魏酸對照品范圍在0.997～9.97 μg/μL，線性考察結(jié)果顯示線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密取同一2.3制備的供試品溶液，在一組相同的測量程序、相同測試地點(diǎn)和相同的色譜條件等情況下，連續(xù)重復(fù)測量5次HPLC檢測，各色譜峰相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）<3%，且各色譜峰相對保留時間的RSD<1%，精密度結(jié)果最終取大于總峰面積5%的色譜峰相對峰面積的RSD平均值2.014%，色譜峰相對保留時間RSD平均值0.29%，研究結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯供試品溶液精密度良好。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 由于固定相的穩(wěn)定性都是有限的，因此的HPLC試驗(yàn)開始前，需要確定供試品溶液的穩(wěn)定性，以確保每一次研究之間的結(jié)果誤差最小，結(jié)果數(shù)據(jù)具有較高的可靠性。本研究采用同一供試品溶液分別室溫放置0、4、8、12、16、21 h后進(jìn)行HPLC檢測，各色譜峰相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）<3%，且各色譜峰相對保留時間的RSD<1%，穩(wěn)定性結(jié)果最終取大于總峰面積5%的色譜峰相對峰面積的RSD平均值1.839%，色譜峰相對保留時間RSD平均值0.02%，研究結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 采用6份同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣進(jìn)行短時間內(nèi)的HPLC連續(xù)重復(fù)性測試，各色譜峰相對峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）<3%，且各色譜峰相對保留時間的RSD<1%。重復(fù)性結(jié)果最終取大于總峰面積5%的色譜峰相對峰面積的RSD平均值1.901%，色譜峰相對保留時間RSD平均值0.72%，本研究結(jié)果顯示補(bǔ)陽還五湯的重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的補(bǔ)陽還五湯供試品溶液6份，分別準(zhǔn)確加入1 mL已知濃度為0.25 g/L阿魏酸對照品溶液，混合均勻后水浴蒸干，加70%甲醇到殘渣中并定容至5 mL，作為加樣回收試驗(yàn)的測試供試品溶液，根據(jù)2.1的色譜條件進(jìn)行HPLC測定，計算加樣回收率。結(jié)果顯示平均回收率99.76%，RSD 2.14%，表明這一色譜條件下的HPLC方法檢測加樣回收率結(jié)果可靠。

2.10 樣品測定結(jié)果 補(bǔ)陽還五湯傳統(tǒng)煎法和現(xiàn)代煎藥機(jī)法的指紋圖譜存在一定的差異，在同一色譜洗脫梯度下，傳統(tǒng)煎法的補(bǔ)陽還五湯指紋圖譜131.88 min即完成檢測，而現(xiàn)代煎藥機(jī)法制備的補(bǔ)陽還五湯指紋圖譜在140 min才完成檢測;現(xiàn)代煎藥機(jī)制備的補(bǔ)陽還五湯中色譜峰更多，可能與現(xiàn)代煎藥機(jī)的高壓煎煮設(shè)備能析出更多共有峰有關(guān)。見圖1和圖2。從各自的指紋圖譜相似度中可得，10批傳統(tǒng)煎法補(bǔ)陽還五湯的相似度和10批現(xiàn)代煎藥機(jī)法補(bǔ)陽還五湯的相似度均高于0.9，其中傳統(tǒng)煎法平均相似度為0.956，現(xiàn)代煎藥機(jī)法平均相似度為0.974，略高于傳統(tǒng)煎法。見表4。

3 討論

中藥湯劑在我國的使用歷史悠久，據(jù)史記載最早可追溯到商朝伊尹時期。因相對其他藥物制備手段，中藥湯劑具有吸收快、療效確切、制備使用簡單等優(yōu)勢[5]，其從幾千年前一直使用至今，倍受歷代醫(yī)家所推崇，現(xiàn)仍在中醫(yī)臨床診療中占據(jù)最為重要的地位。對于中藥的煎煮方法，歷代醫(yī)家均要求較為嚴(yán)格，并認(rèn)為不同的操作方法將直接影響到臨床的療效。張仲景在其論著《傷寒雜病論》中對不同的藥物種類煎煮方法均進(jìn)行了詳細(xì)的論述，如礦石類、有毒藥物等均需先煎，芳香類、揮發(fā)性藥物則選后入，貴重的藥物應(yīng)另煎兌服。明代著名醫(yī)家李時珍認(rèn)為：“凡服湯藥，雖品物專精，修治如法……火候失度，則藥亦無功”，同時說“凡煎藥并忌銅鐵器，宜用銀器瓦罐”;清代徐靈胎的《醫(yī)學(xué)源流論》云：“煎藥之法，最宜深講，藥之效不效，全在乎此”。由此可見，古人認(rèn)為不同藥物器皿的選擇，藥物入選的時機(jī)、火候等諸多因素都講影響著中藥湯劑的質(zhì)量[6-7]，現(xiàn)代學(xué)者進(jìn)行的中藥藥理研究也多次證實(shí)了這點(diǎn)[8]。然而隨著社會的發(fā)展，生活節(jié)奏的加快，患者對傳統(tǒng)煎煮方法的認(rèn)知不足，越來越多的醫(yī)院及藥房選擇使用現(xiàn)代機(jī)器煎煮中藥的方法。作為中醫(yī)現(xiàn)代化的一部分，自動煎藥機(jī)有著其無法忽視的優(yōu)勢，相較于傳統(tǒng)的煎煮藥物的方法，現(xiàn)代煎藥機(jī)具有時間短、使用數(shù)據(jù)客觀，煎煮過程密閉衛(wèi)生，有效減輕了醫(yī)生及患者工作量[9-10]。然而目前中藥傳統(tǒng)煎法和機(jī)器制備孰優(yōu)孰劣仍存在較多爭議，并且主要集中在2種不同的制備方法所導(dǎo)致煎劑中主要的藥物有效化學(xué)成分的差異上[11-12]。有研究者[13-14]對四逆湯、六味地黃丸等對比傳統(tǒng)煎法制備及現(xiàn)代煎藥機(jī)制備的差異，結(jié)果顯示傳統(tǒng)煎法與現(xiàn)代煎藥機(jī)各有優(yōu)劣，如現(xiàn)代煎藥機(jī)制備的煎劑的揮發(fā)性成分含量高于傳統(tǒng)煎法;而傳統(tǒng)煎法的浸出率較高，但在治愈率上兩中制備方法的方藥未見明顯差異。也有部分學(xué)者認(rèn)為[15-16]，現(xiàn)代煎藥機(jī)煎藥制備的中藥藥液顏色較淡，口感較為清稀，有背與中國人對于中藥湯劑的傳統(tǒng)認(rèn)知，并對患者產(chǎn)生一定的心理影響，從而降低自動煎藥機(jī)制備出的藥液的治療效應(yīng)[17-20]。本研究中根據(jù)煎煮加水量理論值為飲片吸水量、煎煮過程中蒸發(fā)量及煎煮后所需藥液量的總和，但實(shí)際操作時加水量很難達(dá)精確，應(yīng)根據(jù)飲片質(zhì)地疏密、吸水性能及煎煮時間長短確定，無論是傳統(tǒng)煎法還是現(xiàn)代煎藥機(jī)2次煎煮時會形成新的濃度差，增加有效成分的溶出。結(jié)合醫(yī)院煎藥室實(shí)際情況和臨床患者服藥習(xí)慣，即按每劑藥每日服用量400 mL，補(bǔ)陽還五湯采用現(xiàn)代煎藥機(jī)高壓模式的最佳煎煮工藝調(diào)整為加8～10倍量水浸泡30 min，煎煮2次，60 min/次，混合2次的濾出液，顯示煎煮加水量的多少與最終的平衡濃度有關(guān)，對阿魏酸浸出的影響不大。本研究中樣品測定結(jié)果顯示傳統(tǒng)煎法的補(bǔ)陽還五湯指紋圖譜131.88 min即完成檢測，而現(xiàn)代煎藥機(jī)法制備的補(bǔ)陽還五湯指紋圖譜在140 min才完成檢測;另外從圖譜中可見現(xiàn)代煎藥機(jī)制備的補(bǔ)陽還五湯中色譜峰更多。從各自的指紋圖譜相似度中可得，其中傳統(tǒng)煎法平均相似度為0.956，現(xiàn)代煎藥機(jī)法平均相似度為0.974，略高于傳統(tǒng)煎法。綜上所述，傳統(tǒng)煎法和現(xiàn)代煎藥機(jī)法制備的補(bǔ)陽還五湯的HPLC指紋圖譜存在一定差異，但是具體成分的差異，有待進(jìn)一步結(jié)合質(zhì)譜進(jìn)行深入研究。

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（2018-09-20收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）