賀小英 荊乾鴿 姜欣穎 袁婷 吳憲 佟瑞瑩 王晶妍 馬利兵

摘要：【目的】構(gòu)建攜帶人類端粒酶催化亞基基因（hTERT）的腺病毒載體并優(yōu)化其包裝條件，為進(jìn)一步探究端粒酶與細(xì)胞重編程調(diào)控間的作用機(jī)理提供參考依據(jù)?！痉椒ā坷孟俨《据d體pAdEasy-1構(gòu)建攜帶hTERT基因的重組腺病毒載體，分別采用脂質(zhì)體法和電轉(zhuǎn)法及不同濃度胎牛血清在HKE293A細(xì)胞中進(jìn)行包裝，篩選出最佳病毒包裝條件，收集重組腺病毒rAd-hTERT并體外感染小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，驗(yàn)證重組腺病毒rAd-hTERT的活性功能?！窘Y(jié)果】以腺病毒載體pAdEasy-1為骨架質(zhì)粒，成功構(gòu)建獲得攜帶hTERT基因的重組腺病毒載體（pAd-hTERT），其最佳病毒包裝條件是采用脂質(zhì)體法結(jié)合15%胎牛血清，此條件下收集獲得的病毒滴度最高（1×1011 IFU/mL）。以攜帶hTERT基因的腺病毒rAd-hTERT感染小鼠胎兒成纖維細(xì)胞72 h后，可擴(kuò)增出片段大小約3450 bp的目的基因條帶，即hTERT基因在小鼠胎兒成纖維細(xì)胞中成功表達(dá)?！窘Y(jié)論】采用脂質(zhì)體法結(jié)合15%胎牛血清包裝獲得的攜帶hTERT基因重組腺病毒具有較高病毒滴度，感染小鼠胎兒成纖維細(xì)胞能成功表達(dá)hTERT基因，進(jìn)一步證實(shí)端粒酶具有蛋白功能的生物學(xué)活性。

關(guān)鍵詞： 端粒酶;腺病毒;細(xì)胞重編程;載體構(gòu)建;病毒包裝;功能驗(yàn)證

中圖分類號(hào)： S814.8? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）06-1356-06

Abstract：【Objective】The aim of the study was to construct an adenoviral vector containing the telomerase catalytic subunit（hTERT） gene， optimize its packaging conditions and lay a foundation for further study of the interaction mechanism between telomerase and cell reprogramming. 【Method】The adenoviral vector containing the hTERT gene was constructed by using the AdEasy-1 system of recombinant adenovirus， and then it was packaged in HKE293A cells by liposome， electroporation and different serum concentrations of fetal bovine. The optimal packaging condition was selected. Recombinant adenovirus rAd-hTERT was collected and infected mouse fetal fibroblasts in vitro， and activity function of recombinant adenovirus rAd-hTERT was verified. 【Result】The recombinant adenoviral vector（pAd-hTERT） carrying hTERT gene was successfully constructed with recombinant adenovirus rAd-hTERT as skeleton plasmid. The optimal packaging condition was liposome method combining with 15% serum of fetal bovine. The titer of virus obtained under such condition was the highest（1×1011 IFU/mL）. After 72 h of adenovirus（rAd-hTERT） carrying hTERT gene infected mouse fetal fibroblasts， target gene bands of 3450 bp was amplified， which meaned that hTERT gene was successfully expressed in mouse fetal fibroblasts. 【Conclusion】The recombinant adenovirus carrying hTERT gene has been successfully prepared by liposome method combining with 15% serum of fetal bovine. It has high virus titer. Infecting mouse fetal fibroblasts can successfully express hTERT gene， which further verifies that telomerase has biological activity of functional protein.

Key words： telomerase; adenovirus; cell reprogramming; vector construction; virus packaging; functional verification

收稿日期：2019-04-04

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31560331，31660340）;內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金項(xiàng)目[2017MS（LH）0213，2017MS0337]

作者簡介：賀小英（1978-），博士，副教授，主要從事動(dòng)物細(xì)胞重編程及轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究工作，E-mail：hxy1124@163.com

0 引言

【研究意義】端粒酶（Telomerase）是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶，能通過延長端粒進(jìn)而參與細(xì)胞周期調(diào)控，而端粒酶基因是研究細(xì)胞衰老、癌癥致病機(jī)理及制備永生化細(xì)胞系的關(guān)鍵基因（Le?o et al.，2018;Spiegl-Kreinecker et al.，2018）。此外，端粒酶與細(xì)胞重編程密切相關(guān)，在細(xì)胞重編程過程中端粒酶主要調(diào)控端粒發(fā)生重編程（Shin et al.，2018），同時(shí)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和代謝重編程（Zvereva et al.，2010）。因此，開展端粒酶基因研究是揭示細(xì)胞衰老、癌變及其重編程機(jī)制的關(guān)鍵?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自2009年美國科學(xué)家伊麗莎白·布萊克本（Elizabeth H. Blackburn）、卡蘿爾·格雷德（Carol W. Greider）和杰克·紹斯塔克（Jack W. Szostak）因發(fā)現(xiàn)端粒和端粒酶是如何保護(hù)染色體而獲得諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)以來，端粒和端粒酶便成為生物學(xué)研究的熱門領(lǐng)域之一（鐘天映等，2009）。端粒酶不僅具有延長端粒長度的功能，還在調(diào)控細(xì)胞重編程的過程中發(fā)揮重要作用（Takasawa et al.，2018;賀小英等，2019）。Kinoshita等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)敲除供體細(xì)胞端粒酶催化亞基基因（TERT）使端粒酶失活后，細(xì)胞重編程中有75個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1571個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，且多數(shù)與轉(zhuǎn)錄和表觀修飾有關(guān)。Nishino和Umezawa（2016）研究發(fā)現(xiàn)，人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）與親代細(xì)胞的TERT啟動(dòng)子存在差異甲基化區(qū)域（DMR），進(jìn)一步證實(shí)端粒酶可通過改變甲基化修飾水平而調(diào)控細(xì)胞重編程進(jìn)程。Takasawa等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，在重編程人類iPSC的過程中，iPSC的TERT呈高度甲基化修飾，但供體細(xì)胞甲基化修飾水平較低，說明甲基化TERT-DMR能上調(diào)iPSC的啟動(dòng)子活性，從而調(diào)控細(xì)胞重編程進(jìn)程。此外，Lanza等（2000）、Jeon等（2005）也曾研究發(fā)現(xiàn)克隆牛和克隆豬的端粒均發(fā)生重編程現(xiàn)象，這些研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)在體細(xì)胞核重編程過程中端粒酶調(diào)控端粒發(fā)生了重編程。至今，已在羊（Kishigami et al.，2008）、牛（Niemann et al.，2008）、豬（Cheng et al.，2012）和小鼠（Hidema et al.，2016）等不同物種上發(fā)現(xiàn)并證實(shí)端粒酶能有效提高細(xì)胞重編程效率?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，有關(guān)端粒酶功能的研究主要集中在癌癥和細(xì)胞衰老方面，而與細(xì)胞重編程結(jié)合相關(guān)的研究較少。腺病毒載體具有感染效率高、不整合宿主染色體等優(yōu)點(diǎn)，是研究端粒酶基因體外表達(dá)的最佳系統(tǒng)，其包裝效率則決定了目的基因表達(dá)的效果，因此非常有必要對腺病毒載體的包裝條件進(jìn)行優(yōu)化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建攜帶人類TERT基因（hTERT）的腺病毒載體，優(yōu)化其包裝條件并鑒定端粒酶基因在小鼠胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探究端粒酶與細(xì)胞重編程調(diào)控間的作用機(jī)理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌BJ5183菌株和DH5α感受態(tài)細(xì)胞、腺病毒載體pAdEasy-1、pCI-neo-hTERT及HKE293A細(xì)胞系均由內(nèi)蒙古科技大學(xué)細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室保存提供。DMEM培養(yǎng)、澳洲胎牛血清及0.25%胰酶等購自美國Gbico公司;脂質(zhì)體2000購自Life公司;限制性內(nèi)切酶Pac I和Pme I購自NEB公司;RT-PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1. 2 重組腺病毒載體構(gòu)建

參照He等（2011）的方法構(gòu)建重組腺病毒載體。hTERT基因片段由pCI-neo-hTERT經(jīng)Sal I和EcoR I雙酶切獲得，然后與pAdTrack-CMV穿梭載體連接，以獲得重組質(zhì)粒pAdTrack-hTERT。經(jīng)Pme I線性化處理后，共轉(zhuǎn)染pAdEasy-1骨架質(zhì)粒，再通過轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞篩選陽性克隆，重組腺病毒載體命名為pAd-hTERT。

1. 3 病毒包裝及其滴度測定

以pAd-hTERT感染HKE293A細(xì)胞，熒光顯微鏡下監(jiān)測病毒包裝效率，感染7～10 d收集病毒，經(jīng)3次反復(fù)凍融獲得的病毒，命名為rAd-hTERT。用感染復(fù)數(shù)（MOI）測定法確定病毒量：將HKE293A細(xì)胞接種在6孔板中，每孔細(xì)胞量為106個(gè)，分別以2、5、10、25和50 μL病毒液感染HKE293A細(xì)胞，72 h后通過熒光及細(xì)胞形態(tài)觀察是否產(chǎn)生病理學(xué)效應(yīng)（CPE），病毒MOI為10～20 PFU/細(xì)胞時(shí)估算上清液中的病毒量。

1. 4 包裝條件優(yōu)化

為提高病毒滴度，采用不同方法和不同條件對病毒進(jìn)行包裝，通過病毒滴度及熒光鑒定對比脂質(zhì)體法和電轉(zhuǎn)法的包裝效率。脂質(zhì)體法是DNA與脂質(zhì)體2000按1∶3比例進(jìn)行轉(zhuǎn)染;電轉(zhuǎn)法（BTX電轉(zhuǎn)儀）是參照周磊等（2015）研究得出的最優(yōu)條件（300 V，75 μs，3次）。不同包裝條件：在脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染后的包裝過程分別添加不同濃度（10%、12%、15%和20%）澳洲胎牛血清。通過流式細(xì)胞儀轉(zhuǎn)染效率檢測及病毒MOI估算確定最佳病毒包裝條件。

1. 5 rAd-hTERT感染小鼠胎兒成纖維細(xì)胞

采用組織塊貼壁法體外分離培養(yǎng)小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，同時(shí)解凍rAd-hTERT病毒滴液，分別以MOI為10～20 PFU/細(xì)胞感染小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，2 d后熒光顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)感染效率。

1. 6 RT-PCR鑒定rAd-hTERT活性功能

采用RT-PCR試劑盒提取陽性細(xì)胞mRNA：取3×105～5×105待測細(xì)胞加入500.0 μL TRIzol試劑，再加入100.0 μL氯仿，吸取水相層，加入0.25 mL異丙醇，取沉淀洗滌晾干后采用50.0 μL TE Buffer（RNase free）進(jìn)行溶解并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。鑒定引物（5'-CCTGGAATCGGTCTGCTGCGC-3'和5'-CCCCCTA GCTGATCATCAGTCC-3'）由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：10×LAGC Bu-ffer 25.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）8.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板1.5 μL，LA Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，以超純水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。DNA序列測定由TaKaRa公司完成。

2 結(jié)果與分析

2. 1 重組腺病毒載體的構(gòu)建

重組腺病毒載體pAd-hTERT經(jīng)Pac I酶切后，瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得2條大小分別為4500和30000 bp的目的片段（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組腺病毒載體pAd-hTERT構(gòu)建成功。

2. 2 重組腺病毒包裝結(jié)果

HKE293A細(xì)胞可為重組腺病毒載體pAd-hTERT提供所缺失的E1區(qū)，使其成為完整的腺病毒顆粒。重組腺病毒載體pAd-hTERT具有綠色熒光基因，在感染HKE293A細(xì)胞早期（第1 d和第3 d）觀察到的熒光表達(dá)量較低（圖2），說明此時(shí)病毒顆粒形成較少;至第7 d后可獲得大量懸浮細(xì)胞，熒光表達(dá)量較高，且出現(xiàn)明顯的CPE（圖2），故選擇此時(shí)收集重組腺病毒rAd-hTERT。

2. 3 重組腺病毒包裝條件的優(yōu)化

通過流式細(xì)胞儀檢測不同包裝處理?xiàng)l件下的病毒感染效率，并計(jì)算感染7～10 d后收集的病毒滴度，以此評價(jià)重組腺病毒包裝效率。結(jié)果表明，脂質(zhì)體法優(yōu)于電轉(zhuǎn)法，且胎牛血清對重組腺病毒的包裝效率有一定影響，隨胎牛血清濃度的增加，病毒包裝效率及病毒滴度均呈增長趨勢（表1和圖3）。處理4與處理5相比，盡管病毒包裝效率在高濃度胎牛血清中較高，但病毒滴度基本一致。綜合考慮試驗(yàn)成本，因此確定處理4為最佳病毒包裝條件，即脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后采用15%胎牛血清進(jìn)行病毒包裝，該條件下收集獲得的病毒滴度最高。

2. 4? rAd-hTERT感染小鼠胎兒成纖維細(xì)胞的特征

采用組織塊貼壁法獲取小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，2 d后周邊遷出長梭狀細(xì)胞（圖4-A），繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至匯合度達(dá)90%以上（圖4-B）時(shí)即可進(jìn)行后續(xù)的感染試驗(yàn)。以攜帶hTERT基因的腺病毒（rAd-hTERT）感染小鼠胎兒成纖維細(xì)胞72 h后，發(fā)現(xiàn)其感染效率較高（圖4-C和圖4-D）。

2. 5 rAd-hTERT活性功能鑒定結(jié)果

采用RT-PCR鑒定hTERT基因在小鼠胎兒成纖維細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，從rAd-hTERT感染72 h的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞中可擴(kuò)增出預(yù)期的目的基因條帶，片段大小約3450 bp（圖5）;而以空腺病毒載體感染的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞未擴(kuò)增出任何條帶。

3 討論

以腺病毒作為載體工具有諸多優(yōu)點(diǎn)，包括生物安全性高、宿主范圍較廣、可搭載大多數(shù)蛋白基因等，已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究及疾病模型構(gòu)建等方面（劉玉玲和鐘柏茂，2018）。重組腺病毒載體包裝效率決定了目的基因表達(dá)的效果，而病毒包裝效率主要取決于包裝的方法及血清濃度、細(xì)胞狀態(tài)等因素。本研究結(jié)果表明，采用脂質(zhì)體包裝腺病毒的效果明顯優(yōu)于電轉(zhuǎn)法，雖然采用的電轉(zhuǎn)法是參照周磊等（2015）研究得出的最優(yōu)條件（300 V，75 μs，3次），但無論是包裝熒光檢測效果還是病毒滴度均不理想，可能與HEK293A細(xì)胞性質(zhì)有關(guān)，其貼壁率較低，電刺激易使細(xì)胞成簇漂起且出現(xiàn)較多死亡細(xì)胞，因此包裝不穩(wěn)定。至今，有關(guān)腺病毒包裝過程中胎牛血清濃度影響的研究鮮見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，胎牛血清濃度在重組腺病毒包裝過程中發(fā)揮較大作用，濃度越高其病毒包裝效率及獲得的病毒滴度也越高，可能與胎牛血清中含有的生長因子和活性蛋白有利于維持細(xì)胞體外活力有關(guān)，但胎牛血清的成本較高，因此最終確定重組腺病毒的最佳包裝條件為：以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后采用15%胎牛血清進(jìn)行病毒包裝，該條件下病毒收集獲得的滴度最高。

目前，有關(guān)端粒酶與細(xì)胞重編程互作方面的研究報(bào)道較少。Marion等（2009）研究認(rèn)為只有供體細(xì)胞中具有端粒酶活性才能有效誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞重編程;Huang等（2011）研究證實(shí)供體細(xì)胞缺乏端粒酶活性會(huì)引起DNA受損，進(jìn)而阻礙細(xì)胞重編程。Pech等（2015）的研究結(jié)果也表明，端粒酶活性在胚胎發(fā)育和體細(xì)胞重編程過程中發(fā)揮著重要作用。本研究通過重組包裝獲得攜帶端粒酶基因的腺病毒（rAd-hTERT），并以其感染小鼠胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR鑒定證實(shí)，hTERT基因能在小鼠胎兒成纖維細(xì)胞中成功表達(dá)，且具有明顯的生物學(xué)活性功能，但后續(xù)研究需利用免疫印跡試驗(yàn)及端粒酶活性檢測試劑盒進(jìn)一步檢測驗(yàn)證端粒酶活性表達(dá)情況，為探究端粒酶與細(xì)胞重編程互作機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，進(jìn)而有效提高細(xì)胞重編程效率，最終為哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植技術(shù)提供保障。

4 結(jié)論

采用脂質(zhì)體法結(jié)合15%胎牛血清包裝獲得的攜帶hTERT基因重組腺病毒具有較高病毒滴度，感染小鼠胎兒成纖維細(xì)胞能成功表達(dá)hTERT基因，進(jìn)一步證實(shí)端粒酶具有蛋白功能的生物學(xué)活性。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）