呂江峰 劉珊 王琳娜 陳晶

[摘要]目的 探討膠質(zhì)母細胞瘤（GM）病人外周血中miRNA的表達情況及其與腫瘤分級和預(yù)后之間的相關(guān)性。方法 應(yīng)用實時熒光定量PCR法檢測40例GM病人（GM組）和40例健康人（對照組）外周血中miR-106b-5p、miR-196b-5p、miR-483-5p、miR-513a1-5p、miR-574-3p及miR-197-5p的表達水平，分析其表達與GM病理分級和預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果 GM組病人外周血中miR-106b-5p、miR-196b-5p、miR-483-5p和miR-574-3p的表達明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（t=4.626～7.013，P<0.01）;兩組miR-513a1-5p及miR-197-5p的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。外周血中miR-106b-5p和miR-574-3p的表達與GM病理分級及預(yù)后均有顯著相關(guān)性（U=314.047、313.500，χ2=8.205、9.114，P<0.01）。結(jié)論 外周血中miR-106b-5p和miR-574-3p的表達或許可以作為GM病人腫瘤分級及預(yù)后的診斷標志物。

[關(guān)鍵詞]膠質(zhì)母細胞瘤;微RNAs;病理學，臨床;預(yù)后

[中圖分類號]R739.41

[文獻標志碼]A

[文章編號] 2096-5532（2019）05-0552-05

doi：10.11712/jms201905012

[開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）]

膠質(zhì)母細胞瘤（GM）惡性程度高，侵襲性強，術(shù)后易復(fù)發(fā)，預(yù)后極差，病程超過1年者不足10%，嚴重威脅著病人的生命健康[1-2]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織頒布的最新指南，GM在組織病理學上被劃分為4級[3]。其中Ⅳ級是惡性度最高也是最常見的級別，一般由影像學結(jié)合病理學來診斷。但病理學和影像學診斷靈敏度較低且費用高[4]，并伴有手術(shù)本身帶來的出血及神經(jīng)壓迫的潛在風險。因此，開發(fā)一種成本低廉且可以在短時間內(nèi)監(jiān)測腫瘤的新的標志物很有必要。雖然血液循環(huán)標志物作為癌癥的早期檢查手段已經(jīng)建立，但其在膠質(zhì)瘤診斷中的應(yīng)用還是非常有限。微小RNA（miRNA）作為無創(chuàng)的腫瘤診斷標志物已經(jīng)越來越得到認可和廣泛應(yīng)用，目前其檢測已經(jīng)延伸到膠質(zhì)瘤的預(yù)后、病理分級及藥物應(yīng)答等方面[5-7]。根據(jù)前期的相關(guān)文獻報道[6，8-9]，本實驗選擇了miR-106b-5p、miR-196b-5p、miR-483-5p、miR-513a1-5p、miR-574-3p及miR-197-5p作為在GM中進一步驗證的目的miRNA，并且探討其表達與GM病理分級和預(yù)后的相關(guān)性，以期為miRNA在GM中作為無創(chuàng)檢測標志物提供實驗依據(jù)?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2014年5月—2017年5月在青島市中心醫(yī)院就診的GM病人40例為GM組，同期收集年齡及性別與GM組相匹配的健康體檢者40例作為對照組。GM組病人，男25例，女15例;年齡為35～61歲，平均（49.21±8.72）歲;均由病理科資深病理醫(yī)師診斷為多形性GM;根據(jù)WHO 2015年的標準，其病理分級為Ⅰ級5例，Ⅱ級8例，Ⅲ級17例，Ⅳ級10例。本研究臨床資料的獲取程序及研究設(shè)計均符合青島市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會制定的倫理學標準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

儀器：IQ5 Real-time PCR 儀（美國Bio-Rad公司產(chǎn)品）;Eppendorf離心機（德國Eppendorf公司產(chǎn)品）;Nanodrop 2000紫外線分光光度計（美國Thermo Fishers公司）;恒溫水浴鍋（上海凌科公司）。試劑：Trizol RNA提取試劑盒（美國Life公司）;Revert AidTM First Strand cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（立陶宛Fermentas公司）;實時熒光定量PCR試劑盒（日本Takara公司）。

1.3 檢測方法

1.3.1 標本采集及處理 用EDTA抗凝管收集新鮮外周血3 mL，置于-80 ℃冰箱長期保存供研究使用。用Trizol RNA提取試劑盒提取外周血清中總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將cDNA置于-20 ℃冰箱中待測。

1.3.2 實時熒光定量PCR檢測miRNA表達 采用SYBR Green染料法，以cDNA為模板，在IQ5 Real-time PCR儀上進行PCR擴增檢測。所有待檢測miRNA的莖環(huán)法反轉(zhuǎn)錄引物及上下游引物均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成，其引物序列見表1。取0.5 ?μL的 cDNA作為模板，加入2×TaKaRa SYBR Premix Ex 12.5 ?μL，上下游引物0.5 ?μL，以雙蒸水補足至25 μL，混勻并經(jīng)短暫離心后，在PCR儀上進行擴增檢測。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、72 ℃合成40 s，40個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，每個樣本均設(shè)3個復(fù)孔。miRNA相對表達量的計算采用2-△△Ct 法。

1.4 統(tǒng)計學處理

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理。計量資料先進行Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)組間比較采用Mann-Whitney U檢驗;計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗或Fisher精確概率法;miRNA表達與GM病人預(yù)后的相關(guān)性分析采用Log-Rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組miRNA表達的比較

GM組病人外周血中miR-106b-5p、miR-196b-5p、miR-483-5p和miR-574-3p的表達明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（t=4.626～7.013，P<0.01）;兩組miR-513a1-5p及miR-197-5p的表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

2.2 miRNA表達與GM病理分級的相關(guān)性

外周血中miR-106b-5p和miR-574-3p的表達與GM的病理分級具有顯著相關(guān)性（U=314.047、313.500，P<0.01），miR-106b-5p的表達隨著GM病理分級的增高而增加，miR-574-3p的表達則隨著GM病理分級的增高而降低;其他miRNA的表達與GM病理分級均無相關(guān)性（P>0.05）。見圖1。

2.3 miRNA表達與GM病人預(yù)后的相關(guān)性

本文40例GM病人的血清miRNA表達量經(jīng)Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗均符合正態(tài)分布。以各miRNA的平均表達量作為cut-off值，將每種miRNA分為高表達（高于平均表達量）和低表達（低于平均表達量）。Log-Rank檢驗結(jié)果顯示，在6種miRNA中，只有miR-106b-5p（χ2=8.205，P<0.01）和miR-574-3p（χ2=9.114，P<0.01）的表達與病人的預(yù)后具有相關(guān)性，miR-106b-5p和miR-574-3p的表達水平越高，病人的預(yù)后越差（圖2）;而其他4種miRNA的表達與GM病人的預(yù)后則無相關(guān)性（P>0.05）。

3 討論

miRNA作為一類內(nèi)源性的在進化上高度保守的單鏈非編碼小RNA，具有穩(wěn)定、組織特異性、檢測靈敏等優(yōu)點，逐漸成為疾病無創(chuàng)診斷和預(yù)后判斷的理想生物標志物[6]。根據(jù)前期的相關(guān)文獻報道[8]，本研究選擇miR-106b-5p、miR-196b-5p、miR-483-5p、miR-513a1-5p、miR-574-3p及miR-197-5p作為檢測指標。

本文對這6種miRNA的檢測結(jié)果顯示，GM組病人外周血中miR-106b-5p、miR-196b-5p、miR-483-5p和miR-574-3p的表達均顯著高于對照組，而兩組miR-513a1-5p及miR-197-5p的表達差異無統(tǒng)計學意義。就miR-197-5p的表達差異而言，本文結(jié)果與YANG等[10]的研究結(jié)果不一致。YANG等[10]研究顯示，惡性星形細胞瘤病人術(shù)前術(shù)后miR-197的表達差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)果不一致的原因主要為兩者研究對象不一樣，此外，本研究檢測的是miR-197的5′端（即miR-197-5p），而YANG等[10]檢測的是miR-197，并未交代是5′端還是3′端。鑒于同一個miRNA的5′端和3′端所介導(dǎo)的生物學功能不一樣[10]，源于5′端和3′端的同一個miRNA其表達模式也不一樣[11]，所以本研究結(jié)果和YANG等[10]結(jié)果嚴格來說是不具有可比性的。而對于miR-197在膠質(zhì)瘤中的功能而言，兩項體外研究均支持miR-197在膠質(zhì)瘤中作為一種抑癌基因存在[12-13]。BARCISZEWSKA等[14]在其綜述中也提到，miR-197在膠質(zhì)瘤中被預(yù)測為表達下調(diào)，但是并未提供直接的實驗證據(jù)。本研究結(jié)果顯示，相較于正常對照，miR-197-5p在多形性GM病人血清中呈表達上調(diào)，但是差異并無統(tǒng)計學意義。目前，miR-574在GM中的表達未見有研究報道，但是在其他類型的腫瘤中有報道[15-17]。本研究首次報道了miR-574在GM病人血清中呈顯著高表達，此結(jié)果還有待于進一步驗證。WANG等[18]的研究結(jié)果顯示，相較于癌旁正常組織，膠質(zhì)瘤組織中miR-483-5p呈顯著低表達。本文研究結(jié)果顯示，miR-483-5p在GM病人血清中呈顯著高表達。本研究結(jié)果與WANG等[18]研究結(jié)果不一致，導(dǎo)致差異的原因目前尚不清楚。關(guān)于miR-106b-5p和miR-196b-5p在GM病人血清中的表達水平，本文研究結(jié)果與先前有關(guān)miR-106b和miR-196b在膠質(zhì)瘤中的研究報道結(jié)果是高度一致的，這兩種miRNA在膠質(zhì)瘤中都是研究較為透徹的致癌miRNA[19]。本文研究結(jié)果顯示，miR-106b-5p和miR-574-3p的表達上調(diào)與GM的病理分級和不良預(yù)后均具有顯著相關(guān)性。因為大量的臨床及基礎(chǔ)研究證實了miR-106b在膠質(zhì)瘤中起著癌基因的作用[20-22]，所以本研究miR-106b-5p表達上調(diào)與GM的病理分級和不良預(yù)后具有顯著相關(guān)性的結(jié)果不難理解。但是，miR-574-3p在膠質(zhì)瘤中的作用目前尚未有研究報道，該結(jié)果尚需進一步驗證。

盡管首次報道了miR-574-3p在GM病人血清中的表達及其病理學的意義，但是本研究仍然存在一定的局限性。首先，本研究所納入的外周血標本均為-80 ℃冰箱凍存標本，而非新鮮外周血標本，樣本的質(zhì)量可能會對檢測結(jié)果有一定的影響[23];其次，本研究主要從外周血的血清中而非總外周血中提取miRNA進行檢測[24]，考慮到血清和外周血中miRNA的豐度不一樣[23]，這可能有助于解釋為什么本研究部分結(jié)果與既往研究結(jié)果不一致[25];最后，本研究的樣本數(shù)有限，需要在后續(xù)實驗中進一步擴大樣本數(shù)進行驗證[26]。

綜上所述，本研究檢測了6種相關(guān)miRNA在GM病人血清中的表達水平并分析了其表達的臨床病理學的意義，結(jié)果顯示，miR-106b-5p、miR-196b-5p、miR-483-5p和miR-574-3p在GM組外周血中的表達顯著高于其在對照組中的表達，miR-106b-5p和miR-574-3p的異常表達與GM的病理分級和不良預(yù)后均具有顯著相關(guān)性，提示miR-106b-5p和miR-574-3p的表達或許可以作為GM病人的血清診斷標志物。

[參考文獻]

[1]STOYANOV G S， DZHENKOV D， GHENEV P， et al. Cell biology of glioblastoma multiforme：from basic science to diagnosis and treatment[J]. Medical Oncology， 2018，35（3）：27.

[2]LI Xuezhen， LI Yanbin， CAO Yang， et al. Risk of subsequent cancer among pediatric， adult and elderly patients following a primary diagnosis of glioblastoma multiforme：a population-based study of the SEER database[J]. International Journal of Neuroscience， 2017，127（11）：1005-1011.

[3]PAUL Y， MONDAL B， PATIL V， et al. DNA methylation signatures for 2016 WHO classification subtypes of diffuse gliomas[J]. Clinical Epigenetics， 2017，9：32.

[4]HUANG R Y， NEAGU M R， REARDON D A， et al. Pitfalls in le neuroimaging of glioblastoma in le era of antiangiogenic and immuno/targeted therapy-detecting illusive disease， defining response[J]. Frontiers in Neurology， 2015，6：33.

[5]YE Xinyun， WEI Wenjin， ZHANG Zhengyu， et al. Identification of microRNAs associated with glioma diagnosis and prognosis[J]. Oncotarget， 2017，8（16）：26394-26403.

[6]SHEN Li， LIN Yuxin， SUN Zhandong， et al. Knowledge-guided bioinformatics model for identifying autism spectrum disorder diagnostic microRNA biomarkers[J]. Scientific Reports， 2016，6：39663.

[7]TUMILSON C A， LEA R W， ALDER J E， et al. Circulating microRNA biomarkers for glioma and predicting response to therapy[J]. Molecular Neurobiology， 2014，50（2）：545-558.

[8]BARCISZEWSKA A M. MicroRNAs as efficient biomarkers in high-grade gliomas[J]. Folia Neuropathologica， 2016，54（4）：369-374.

[9]YANG Cuihua， WANG Cheng， CHEN Xi， et al. Identification of seven serum microRNAs from a genome-wide serum microRNA expression profile as potential noninvasive biomarkers for malignant astrocytomas[J]. Int J Cancer， 2013，132（1）：116-127.

[10]MARCO A， MACPHERSON J， RONSHAUGEN M， et al. MicroRNAs from the same precursor have different targeting properties[J]. Silence， 2012，3（1）：8.

[11]GUO Li， ZHANG Hui， ZHAO Yang， et al. Selected isomiR expression profiles via arm switching[J]？ Gene， 2014，533（1）：149-155.

[12]ZHANG Guifang， SUN Weibo， ZHU Liangfu， et al. Overexpressed circ_0029426 in glioblastoma forecasts unfavorable prognosis and promotes cell progression by sponging miR-197[J]. Journal of Cellular Biochemistry， 2019，120（6）：10295-10302.

[13]TIAN Liqiang， LIU Enqin， ZHU Xide， et al. MicroRNA-197 inhibits cell proliferation by targeting GAB2 in glioblastoma[J]. Molecular Medicine Reports， 2016，13（5）：4279-4288.

[14]BARCISZEWSKA A M， GURDA D， GLODOWICZ P A， et al. A new epigenetic mechanism of temozolomide action in glioma cells[J]. PLoS One， 2015，10（8）：e0136669.

[15]SAUL M J， BAUMANN I， BRUNO A， et al. miR-574-5p as RNA decoy for CUGBP1 stimulates human lung tumor growth by mPGES-1 induction[J]. FASEB J， 2019. doi：10.1096/fj.201802547R.

[16]SUN F D， WANG P C， LUAN R L， et al. MicroRNA-574 enhances doxorubicin resistance through down-regulating SMAD4 in breast cancer cells[J]. European Review for Medical and Pharmacological Sciences， 2018，22（5）：1342-1350.

[17]ZHOU Rui， ZHOU Xiaoshu， YIN Zhongyuan， et al. Micro-RNA-574-5p promotes metastasis of non-small cell lung cancer by targeting PTPRU[J]. Scientific Reports， 2016，6：35714.

[18]WANG Li， SHI Ming， HOU Shuangxing， et al. MiR-483-5p suppresses the proliferation of glioma cells via directly targeting ERK1[J]. FEBS Letters， 2012，586（9）：1312-1317.

[19]LIU F， GONG J， HUANG W， et al. MicroRNA-106b-5p boosts glioma tumorigensis by targeting multiple tumor suppressor genes[J]. Oncogene， 2014，33（40）：4813-4822.

[20]AMES H， HALUSHKA M K， RODRIGUEZ F J. miRNA regulation in gliomas：usual suspects in glial tumorigenesis and evolving clinical applications[J]. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology， 2017，76（4）：246-254.

[21]CODO P， WELLER M， MEISTER G， et al. MicroRNA-mediated down-regulation of NKG2D ligands contributes to glioma immune escape[J]. Oncotarget， 2014，5（17）：7651-7662.

[22]ZHANG Anling， HAO Jianwei， WANG Kun， et al. Down-regulation of miR-106b suppresses the growth of human glioma cells[J]. Journal of Neuro-Oncology， 2013，112（2）：179-189.

[23]BLONDAL T， NIELSEN S J， BAKER A A， et al. Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids[J]. Methods， 2013，59（1）：S1-S6.

[24]SHIOTSU H， OKADA K， SHIBUTA T， et al. The influence of pre-analytical factors on the analysis of circulating micro-

RNA[J]. Microrna， 2018，7（3）：195-203.

[25]SKOGHOLT A H， RYENG E， ERLANDSEN S E， et al. Gene expression differences between PAX gene and Tempus blood RNA tubes are highly reproducible between independent samples and biobanks[J]. BMC Research Notes， 2017，10（1）：136.

[26]SRIVASTAVA K， TYAGI K. Single nucleotide polymorphisms of microRNA in cardiovascular diseases[J]. Clinica Chimica Acta， 2018，478：101-110.

（本文編輯 馬偉平）