林艷 劉華清 付艷萍 吳明基

摘 要：【目的】利用TALEN技術(shù)定向突變水稻pms3的原始突變區(qū)域，創(chuàng)制不同類(lèi)型osa-smR5864小RNA編碼序列突變體，鑒定不同突變體的雄性育性光溫反應(yīng)變化規(guī)律，為基于定向編輯水稻PMS3基因的方法培育水稻兩系不育系材料提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā繕?gòu)建基因編輯載體TALEN-PMS3，轉(zhuǎn)化日本晴和明恢86，通過(guò)測(cè)序鑒定pms3突變體，利用福州夏季自然長(zhǎng)日高溫鑒定T2代pms3突變體的雄性育性及自交結(jié)實(shí)率。【結(jié)果】轉(zhuǎn)化獲得25個(gè)轉(zhuǎn)基因T0代克隆，其中日本晴有4個(gè)克隆產(chǎn)生了突變，明恢86有5個(gè)克隆產(chǎn)生了突變，突變率分別為40.0%和33.3%。在T1代非轉(zhuǎn)基因材料中，日本晴背景中有3種純合突變類(lèi)型，明恢86中有5種純合突變類(lèi)型。在福州夏季自然長(zhǎng)日高溫條件下，T2代pms3突變體能夠產(chǎn)生正?？捎幕ǚ郏越唤Y(jié)實(shí)率正常，并未表現(xiàn)出類(lèi)似培矮64S的光溫敏雄性不育特征。【結(jié)論】本研究通過(guò)基因編輯獲得的多種類(lèi)型水稻pms3突變體并不能產(chǎn)生光溫敏雄性核不育表型，說(shuō)明了pms3位點(diǎn)調(diào)控水稻光溫敏核不育性分子機(jī)制的復(fù)雜性。

關(guān)鍵詞：水稻;光溫敏核不育;PMS3;基因編輯

中圖分類(lèi)號(hào)：S 511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1008-0384（2019）04-381-06

Abstract： 【Objective】TALEN technology was employed to alter the original mutant region in pms3 gene of rice for creating different genotypes of small RNA osa-smR5864 mutants in studying the photoperiod-temperature-sensitive male sterility （PTGMS） phenotypes of pms3 mutants to provide information for breeding two-line sterile rice by means of targeted editing of PMS3.【Method】The TALEN-PMS3 vector was constructed and transformed into Nipponbare and Minghui 86 with the pms3 mutants identified by sequencing. The T2 generation of the mutants were planted under the natural long-day-high-temperature conditions in Fuzhou. The male fertility and seed setting rates of the mutants were determined. 【Result】 Among the 25 transgenic plants regenerated， 4 clones of Nipponbare and 5 of Minghui 86 contained the target mutation with the mutation rates of 40% and 33.3%， respectively. The non-transgenic mutant plants were obtained in T1 generations. The sequencing showed 3 homozygous mutation genotypes in Nipponbare and 5 in Minghui 86 background. Under the natural long-day-high-temperature， the T2 pms3 mutants developed normal fertile pollens with a normal seed setting rate. But the pms3 mutants did not show a PTGMS similar to P64S. 【Conclusion】The multiple genotypes of pms3 mutants were successfully obtained. However， no PTGMS phenotype could be generated. It suggested that the molecular mechanism of pms3 locus regulating the rice PTGMS was highly complex.

Key words： rice; PTGMS; PMS3; gene editing

0 引言

【研究意義】水稻光溫敏核不育基因的發(fā)現(xiàn)與利用是選育兩系雜交水稻的重要環(huán)節(jié)，利用基因編輯技術(shù)突變水稻光溫敏核不育基因，對(duì)定向創(chuàng)制水稻光溫敏核不育系具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】農(nóng)墾58S是我國(guó)研究人員最早發(fā)現(xiàn)的一個(gè)水稻光溫敏核不育系[1]。以農(nóng)墾58S為不育基因供體，育種者選育了一系列光溫敏核不育系應(yīng)用于兩系雜交稻生產(chǎn)[2]。張啟發(fā)研究團(tuán)隊(duì)研究表明，pms3是決定農(nóng)墾58S育性的光敏雄性核不育基因[3-4]，它的轉(zhuǎn)錄本是一條長(zhǎng)度為1 236 bp的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，命名為長(zhǎng)日特異性雄性不育相關(guān)RNA（long-day-specific-male-fertility-associated RNA，LDMAR）[5]。在農(nóng)墾58S中，由一個(gè)C變?yōu)镚的單堿基突變，使這條LDMAR的甲基化程度產(chǎn)生明顯差異，造成長(zhǎng)日照條件下農(nóng)墾58S中的LDMAR轉(zhuǎn)錄量降低，促使發(fā)育中的花藥提前進(jìn)入程序化死亡，導(dǎo)致花粉不能正常發(fā)育，產(chǎn)生了水稻農(nóng)墾58S光敏雄性核不育表型[5]。在短日條件下，水稻花粉粒的正常發(fā)育并不需要LDMAR來(lái)維持，所以農(nóng)墾58S育性可以恢復(fù)[5]。莊楚雄課題組以溫敏核不育系材料培矮64S為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)ptms12-1（pms3）決定了培矮64S溫敏不育特征。ptms12-1是一個(gè)非編碼RNA基因，它的原始轉(zhuǎn)錄本在經(jīng)過(guò)2次加工剪切后，最終形成了一個(gè)21 nt的小RNAosa-smR5864w[6]。水稻品種培矮64S的小RNA序列為CAU UGU UUG UCU ACC AUC CAU，而溫敏不育水稻培矮64S在該小RNA序列第11個(gè)堿基處存在一個(gè)由C變?yōu)镚的單堿基突變（CAU UGU UUG UGU ACC AUC CAU），形成了osa-smR5864m。在高溫條件下，這個(gè)單堿基突變一方面可能影響了小RNA的表達(dá)水平，另一方面也有可能影響了小RNA與下游靶基因的結(jié)合能力而最終導(dǎo)致溫敏雄性不育特征[6]。以上兩項(xiàng)研究結(jié)果表明，pms3位點(diǎn)的同一個(gè)SNP在粳稻農(nóng)墾58S中產(chǎn)生了光敏不育性，而在秈稻培矮64S內(nèi)產(chǎn)生了溫敏不育性，說(shuō)明了水稻光溫敏核不育性遺傳機(jī)理的復(fù)雜性。由于osa-smR5864w是一非編碼小RNA，其編碼序列上的任何新改變都有可能影響其正常表達(dá)量或改變其對(duì)下游基因的調(diào)控功能，從而使突變體表現(xiàn)類(lèi)似農(nóng)墾58S的光溫敏核不育特征。近年來(lái)以TALEN和CRISPR/Cas-9為代表的基因編輯技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水稻基因定向突變，快速有效地獲得了定向改良性狀[7-12]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】利用基因編輯技術(shù)對(duì)編碼osa-smR5864w的序列進(jìn)行定向突變，可能創(chuàng)制出新的光溫敏核不育復(fù)等位基因，但目前尚未見(jiàn)到相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】由于小RNA osa-smR5864w上的原始突變位置附近無(wú)理想的CRISPR/Cas-9編輯所需的NGG結(jié)構(gòu)，因此本研究利用TALEN方法對(duì)編碼該小RNA的基因組區(qū)間進(jìn)行定點(diǎn)突變。構(gòu)建了1個(gè)靶向水稻PMS3的TALEN載體，以秈稻品種明恢86和粳稻品種日本晴品種為遺傳突變對(duì)象，期望通過(guò)定向突變PMS3基因，獲得不同類(lèi)型的小RNA osa-smR5864序列突變體，分析不同突變體的雄性育性光溫反應(yīng)變化規(guī)律，旨在為基于定向編輯水稻PMS3基因的方法培育水稻兩系不育系材料提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

粳稻品種日本晴，由福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。明恢86，由三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。大腸桿菌Escherichia coli感受態(tài)DH5α和根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens感受態(tài)LBA4404由福建省農(nóng)業(yè)遺傳工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。TALEN載體構(gòu)建試劑盒由上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 載體構(gòu)建及水稻遺傳轉(zhuǎn)化 選擇5′-GGT GAA GCA AAG AAG-3′及5′-ACT CTT GAT GGA T-3′序列作為T(mén)ALEN載體的左右臂，設(shè)計(jì)的基因編輯靶點(diǎn)位于小RNA osa-smR5864w之上。利用上海斯丹賽生物技術(shù)有限公司提供的TALEN載體構(gòu)建試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)中的方法，構(gòu)建TALEN載體。將構(gòu)建好的質(zhì)粒通過(guò)熱激轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。挑取3個(gè)正常生長(zhǎng)的單克隆培養(yǎng)，于鉑尚生物技術(shù)（福州）有限公司測(cè)序，正向測(cè)序引物序列為305F：5′-CTC CCC TTC AGC TGG ACA C-3′，反向測(cè)序引物序列為306R：5′-AGC TGG GCC ACG ATT GAC-3′。將測(cè)序結(jié)果中的核酸序列翻譯成氨基酸形式后進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證翻譯的TALE蛋白是否正確，選取1個(gè)序列正確的質(zhì)粒命名為T(mén)ALEN-PMS3，將該質(zhì)粒載體電擊導(dǎo)入LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法[13]轉(zhuǎn)化日本晴和明恢86的愈傷組織，獲得T0代植株。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因植株鑒定 使用CTAB法[14]從水稻葉片中提取基因組DNA。以T0代各單株的基因組DNA為模板，通過(guò)上游引物HptF和下游引物HptR（表1）PCR擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（標(biāo)記基因目的條帶大小為419 bp），以擴(kuò)增出目的條帶的為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株。以T1和T2代各單株的基因組DNA為模板，通過(guò)HptF/HptR進(jìn)行PCR擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，無(wú)目的條帶的單株即為分離出的非轉(zhuǎn)基因植株。

1.2.3 靶位點(diǎn)突變檢測(cè) 以水稻PMS3基因組序列為參考，設(shè)計(jì)正向引物L(fēng)DF1和反向引物L(fēng)DR1（表1），PCR擴(kuò)增T0、T1 和T2代各植株的PMS3基因，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)計(jì)410 bp。PCR產(chǎn)物于鉑尚生物技術(shù)公司（福州）進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)比對(duì)測(cè)序結(jié)果鑒定PMS3突變體。

1.2.4 突變體育性觀(guān)察及鑒定 T2代pms3突變體及野生型對(duì)照在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所福州壽山基地作中稻種植，明恢86來(lái)源的材料于5月20播種，日本晴來(lái)源的材料于6月20日播種，秧苗于25 d秧齡時(shí)移栽于大田，每份材料種植100株，采取正常田間管理。水稻抽穗時(shí)，摘取即將開(kāi)花的小穗上、中、下各2個(gè)穎花制片，用1% I2+0.1% IK對(duì)花粉進(jìn)行染色，每份材料制取10個(gè)樣本，利用顯微鏡觀(guān)察并計(jì)算花粉黑染率。套袋10個(gè)單穗，25 d后調(diào)查自交結(jié)實(shí)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 TALEN系統(tǒng)介導(dǎo)的PMS3序列特異性突變分析

構(gòu)建了TALEN-PMS3載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將該載體轉(zhuǎn)化日本晴和明恢86的愈傷組織。共獲25個(gè)轉(zhuǎn)基因T0代克隆，其中日本晴獲10個(gè)克隆，明恢86獲15個(gè)克隆。對(duì)每個(gè)克隆靶位點(diǎn)序列的測(cè)序結(jié)果顯示，在日本晴中有4株產(chǎn)生了突變，明恢86有5株產(chǎn)生了突變，突變率分別為40.0%和33.3%。

通過(guò)T0代植株自交，收獲了上述含有靶序列突變的9株水稻T1代種子。在T1代中，通過(guò)對(duì)單株潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因及突變位點(diǎn)的檢測(cè)，分離出非轉(zhuǎn)基因純合突變單株。各種純合突變體序列如圖1和表2所示。以日本晴為背景，獲得了3種純合突變類(lèi)型（插入1 bp，缺失1 bp和缺失4 bp），以明恢86為背景，獲得了5種純合突變類(lèi)型（插入12 bp，缺失3 bp，缺失4 bp和缺失62 bp，以及缺失82 bp外加插入23 bp）。以上突變體序列分析表明，通過(guò)TALEN方法，在日本晴和明恢86背景下都成功獲得了PMS3序列的定向突變。

2.2 pms3純合突變體花粉育性正常

在福州作中稻種植時(shí)，所有日本晴和明恢86 pms3突變體及野生型親本于8月15～20日開(kāi)始抽穗。在開(kāi)花期對(duì)N-pms3-#1、N-pms3-#2、N-pms3-#3、M-pms3-#1、M-pms3-#2、M-pms3-#5的T2代純合突變體花藥外型進(jìn)行觀(guān)察并利用碘染法對(duì)花粉的育性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果列于表3。分析結(jié)果顯示，所有pms3突變體的花藥外型正常，能夠正常開(kāi)裂并散粉，花粉粒經(jīng)過(guò)碘-碘化鉀染色后，表現(xiàn)為正常染色的可育花粉，突變體與野生型花粉黑染率均為90%左右，無(wú)顯著差異（圖2、表3）。而光溫敏核不育系培矮64S表現(xiàn)為花藥瘦小不開(kāi)裂，花粉粒經(jīng)過(guò)碘-碘化鉀染色后，鏡檢結(jié)果顯示全部為典敗型花粉，無(wú)黑染花粉粒。以上結(jié)果表明，本試驗(yàn)通過(guò)定向突變?nèi)毡厩缂懊骰?6的PMS3基因，所獲得的pms3突變體花粉在福州夏季自然長(zhǎng)日高溫條件下表現(xiàn)正?？捎?，并不能轉(zhuǎn)變?yōu)椴挥ǚ邸?/p>

2.3 pms3純合突變體自交結(jié)實(shí)率正常

抽穗開(kāi)花期對(duì)T2代純合突變體N-pms3-#1、N-pms3-#2、N-pms3-#3、M-pms3-#1、M-pms3-#2和M-pms3-#5進(jìn)行單穗套袋，種子成熟后分單穗統(tǒng)計(jì)自交結(jié)實(shí)率，調(diào)查結(jié)果顯示明恢86的平均結(jié)實(shí)率為（87.1±6.6）%，3個(gè)明恢86來(lái)源的pms3突變體結(jié)實(shí)率約為86%，與明恢86無(wú)顯著差異，而雄性不育系培矮64S的結(jié)實(shí)率為0（表3）。所有日本晴pms3突變體的結(jié)實(shí)率約為89%，與野生型日本晴也無(wú)顯著差異。以上結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，本試驗(yàn)通過(guò)TALEN方法雖然在日本晴和明恢86的osa-smR5864小RNA編碼序列上產(chǎn)生了多種類(lèi)型的突變，但是這些突變體在福州夏季長(zhǎng)日高溫條件下，并不能表現(xiàn)出類(lèi)似農(nóng)墾58S或培矮64S那樣的光溫敏雄性核不育特征。

3 討論與結(jié)論

諸多研究者對(duì)農(nóng)墾58S的光溫敏核不育基因做了大量研究，基于不同的研究材料，認(rèn)為不同的水稻雜交組合中引起光敏核不育的遺傳基因不同[15-17]。位于12號(hào)染色體上的pms3是形成農(nóng)墾58S光敏核不育的原始突變位點(diǎn)[3-4]。水稻PMS3的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是一條非編碼RNA，它的原始轉(zhuǎn)錄本在經(jīng)過(guò)2次加工剪切后，最終形成了一個(gè)21nt的小RNA（osa-smR5864w）[6]。該小RNA序列第11個(gè)堿基處一個(gè)由C變?yōu)镚的單堿基突變，形成了osa-smR5864m，其序列為5′-CAU UGU UUG UGU ACC AUC CAU-3′，這一突變的小RNA決定了農(nóng)墾58S和培矮64S的光溫敏雄性不育特性[6]。

本項(xiàng)研究利用TALEN基因編輯技術(shù)，在粳稻品種日本晴和秈稻品種明恢86的osa-smR5864m小RNA編碼序列上共產(chǎn)生了7種類(lèi)型的插入缺失突變，有些突變類(lèi)型涉及的插入或缺失堿基數(shù)較多（表2，圖1）使osa-smR5864m序列產(chǎn)生了嚴(yán)重改變。例如，M-pms3-#5缺失了62個(gè)堿基，幾乎導(dǎo)致編碼osa-smR5864m的序列完全缺失。然而，這些突變體在福州夏季長(zhǎng)日高溫條件下，并不能表現(xiàn)出類(lèi)似農(nóng)墾58S或培矮64S那樣的光溫敏雄性核不育特征，這一結(jié)果與本研究的預(yù)期不符。

基于前人的研究及本試驗(yàn)的結(jié)果，推測(cè)有兩個(gè)因素決定了這種現(xiàn)象。首先，可能只有原始突變處由C變?yōu)镚的單堿基突變類(lèi)型才能產(chǎn)生光溫敏雄性不育表型，但因?yàn)楸狙芯坎⑽传@得這種突變類(lèi)型，所以定向突變獲得的7種pms3突變體都未表現(xiàn)出光溫敏雄性核不育特性。其次，研究者已從農(nóng)墾58S中克隆出PMS1[16-17]與PMS3兩個(gè)光溫敏核不育基因，它們都編碼21nt的小RNA，這兩種小RNA在誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生光溫敏核不育性狀上或許具有互作關(guān)系，當(dāng)PMS1位點(diǎn)為野生型時(shí)，單純突變PMS3位點(diǎn)可能不足以誘導(dǎo)形成水稻光溫敏核不育表型。以上兩種假設(shè)還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)予以解釋驗(yàn)證。

本研究通過(guò)定向突變粳稻日本晴和秈稻明恢86的PMS3基因，使小RNA osa-smR5864的編碼序列發(fā)生嚴(yán)重改變，但突變體并不能產(chǎn)生水稻光溫敏雄性核不育表型，這一結(jié)果說(shuō)明了PMS3位點(diǎn)調(diào)控水稻光溫敏核不育分子機(jī)制的復(fù)雜性，具體機(jī)理有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)予以解析。

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（責(zé)任編輯：林海清）