王玉婷　徐紅日　趙世同　程淼　姚興偉　常桂嬌　陳師林　王成祥

摘要?目的：研究扶正解毒化瘀方對多重耐藥銅綠假單胞菌MexAB-OprM外排泵表達的影響。方法：針對篩選出的MexAB-OprM陽性的銅綠假單胞菌菌株，通過微量稀釋法，測定哌拉西林-他唑巴坦的最小抑菌濃度和扶正解毒化瘀方水提物的最小殺菌濃度，從而確定熒光定量PCR細菌樣本時培養(yǎng)劑中哌拉西林-他唑巴坦和扶正解毒化瘀方水提物的濃度。繪制細菌生長曲線，確定細菌樣本的培養(yǎng)時間。利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測藥物干預(yù)前后mexB、oprM、mexR的表達量。結(jié)果：扶正解毒化瘀方水提物能降低MexAB-OprM外排泵陽性MDRPA菌株的mexB、oprM表達量（P<0.05），同時能增加mexR的表達量（P<0.05）。結(jié)論：扶正解毒化瘀方對MDRPA所致肺炎的作用機制之一可能是通過抑制MexAB-OprM外排泵的表達實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞?扶正解毒化瘀方;多重耐藥銅綠假單胞菌;外排泵;MexAB-OprM;最小抑菌濃度;生長曲線;實時熒光定量PCR;作用機制

Effects of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on the Expression of Efflux Pump MexAB-OprM of Multidrug-resistant Pseudomonas Aeruginosa

Wang Yuting1，Xu Hongri2，Zhao Shitong1，Cheng Miao1，Yao Xingwei3，Chang Guijiao3，Chen Shilin1，Wang Chengxiang4

（1 Respiratory Department，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 2 Emergency Department，Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital，Beijing 100029，China; 3 Clinical Laboratory Department，Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100700，China; 4 Respiratory Department，Beijing University of Chinese Medicine Third Affiliated Hospital，Beijing 100029，China）

Abstract?Objective：To study the effects of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on the expression of MexAB-OprM efflux pumps in multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa.Methods：The minimum inhibitory concentration of piperacillin-tazobactam and the minimum bactericidal concentration of the water extract of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction were determined via microdilution method for selected MexAB-OprM positive Pseudomonas aeruginosa strains so as to determine the concentration of piperacillin-tazobactam and the water extract of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction in the culture medium during the fluorescence quantitative PCR of bacterial samples.The bacterial growth curve was drawn and the culture time of the bacterial samples was determined.The expression levels of mexB，oprM，and mexR before and after drug intervention were detected by real-time fluorescence quantitative PCR technology.Results：The expression levels of mexB and oprM in MexB-OprM efflux pump positive strains were decreased after the intervention of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction water extract（P<0.05），and that of mexR was increased than before（P<0.05）.Conclusion：The therapeutic effect of Fuzheng Jiedu Huayu Decoction on pneumonia caused by MDRPA may be attributed to the inhibition of the expression of MexAB-OprM efflux pump.

Key Words?Fuzheng Jiedu Huayu Decoction; Pseudomonas aeruginosa; Efflux pump; MexAB-OprM; Minimum inhibitory concentration; Growth curve; Real-time fluorescence quantitative PCR; Mechanism of action

中圖分類號：R285.5文獻標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.014

銅綠假單胞菌（Pseudomonas Areuginas，PA）是醫(yī)院感染最常見的病原菌之一，尤以肺部感染最多見。PA耐藥形勢嚴(yán)峻，1996—2010年耐藥PA感染所致菌血癥患者病死率由16%升至26%，耐藥PA感染已成為院內(nèi)感染死亡的主因之一[1-3]。PA因其自身結(jié)構(gòu)的特殊性，對多數(shù)抗菌藥物天然耐藥或獲得性耐藥[4]，且耐藥機制復(fù)雜[5]，同時由于臨床抗菌藥物的不合理使用，細菌耐藥逐年增加，耐藥機制不斷變化，因此該菌引發(fā)的感染性疾病治療難度不斷增加。通過依據(jù)不同耐藥機制來尋找或探索相應(yīng)的抗菌藥物已滯后于臨床需求，難以及時應(yīng)用于臨床而起到預(yù)期的抗菌作用。據(jù)NHSN報道，細菌耐藥性的增加明顯限制了抗菌藥物的選擇，在過去20年已加速了抗菌藥物的研發(fā)，但針對耐藥PA感染，目前并無療效更好的藥物問世。因此，研發(fā)新的高效且低不良反應(yīng)的藥物迫在眉睫。

本課題組在“十一五”國家科技支撐計劃項目證實，扶正解毒化瘀方在老年性肺炎的治療中，該方較單純應(yīng)用抗生素能夠顯著改善病程達2周以上患者的呼吸道癥狀，促進炎性反應(yīng)病灶的吸收，提高病程較長老年患者耐藥菌肺炎的臨床有效率[6]。經(jīng)初步分析，扶正解毒化瘀方的療效機制可能與干預(yù)PA耐藥的相關(guān)環(huán)節(jié)從而逆轉(zhuǎn)PA的耐藥性，或與抗生素起到協(xié)同抑菌增效作用有關(guān)。外排泵系統(tǒng)是PA固有耐藥的主要機制，其中MexAB-OprM是最常見的藥物外排系統(tǒng)。本研究將通過觀察扶正解毒化瘀方對多重耐藥銅綠假單胞菌（MDRPA）的MexAB-OprM外排泵表達的影響，深入探索該復(fù)方的作用機制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?菌株?實驗菌株由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院檢驗科細菌室提供。在從臨床診斷為MDRPA感染所致肺炎患者深部呼吸道分泌物標(biāo)本中分離、培養(yǎng)、純化、鑒定所得的18株MDRPA的菌株中（編號為P1～P18），利用碳酰-氰-間氯苯腙（CCCP）篩選出MexAB-OprM高表達株P(guān)17，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。質(zhì)控菌株為ATCC27853。

1.1.2?藥物?扶正解毒化瘀方：黃芩、連翹、漏蘆、赤芍、瓜蔞、西洋參、敗醬草、炒薏苡仁等組成。藥物劑型為北京康仁堂藥業(yè)有限公司制備的全有效成分提取配方顆粒。沸水溶解，用0.22 μm過濾器過濾，4 ℃冰箱低溫保存?zhèn)溆?。哌拉西?他唑巴坦（TZP，Wyeth Lederle S.R.L.，產(chǎn)品批號：AKGD/11）購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院西藥庫。

1.1.3?試劑與儀器?營養(yǎng)肉湯（賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，OXOID CM1168，批號1377374），RNAzol RT、RNAprep Pure總提取試劑盒（天根），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（DBI）;熒光定量PCR檢測試劑盒（Genecopies），DEPC（Vetec）。采用BD Phoenix-100 system全自動細菌分析儀（美國BD公司，型號BD Phoenix），恒溫濕培養(yǎng)箱（上海一恒科技儀器有限公司，型號LHS-250 HC-11），恒溫震蕩器（蘇州培英實驗設(shè)備有限公司，型號MSG.N 180L），臺式高速離心機（D3204R SCIlogex），熒光定量PCR儀（7500，ABI），微量核酸定量儀（Merinton，SMA4000）;基因擴增儀（Stratagene Mx3000P）。

1.1.4?引物設(shè)計?委托上海生物工程有限公司合成序列。目的基因mexB片斷長度為130 bp，上游引物：5′-TCGAGGAGATCGTCAAGCAA-3′，下游引物：5′-CAGAGGAACACCACCAGCAG-3′。目的基因oprM片斷長度為114 bp，上游引物：5′-ACGCGAAGATCCAGAAGGAC-3′，下游引物：5′-GCAACTGCTCGGTGAAGGTA-3′。目的基因mexR片斷長度為142 bp，上游引物：5′-GCAGCTTCCAGCTCTTCCTC-3′，下游引物：5′-CACTGGTCGAGGAGATGCAC-3′。內(nèi)參基因rpsL片斷長度為99 bp，上游引物：5′-AACTCGGCACTGCGTAAGGT-3′，下游引物：5′-AACTCGGCACTGCGTAAGGT-3′。

1.2?方法

1.2.1?TZP最小抑菌濃度（MIC）測定?利用微量稀釋法，在96孔板1～10孔中加入100 μL肉湯，第1孔加入配置好的含有4 096 μg/mL TZP的肉湯100 μL，將TZP進行對倍稀釋;再往12、13孔加入200 μL肉湯分別作為陽性和陰性對照;配制菌液，分別往1～11孔中加入已調(diào)制好的菌液10 μL，最終接種菌量約為5×105 CFU/mL，重復(fù)3行。

上述96孔板振蕩培養(yǎng)18～24 h，放入酶標(biāo)儀中檢測，參數(shù)調(diào)整為single，570 nm，讀出相應(yīng)的OD值。MIC判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌率（%）=（陽性對照OD值-試驗OD值）/（陽性對照OD值-陰性對照OD值）×100≥80%。

1.2.2?扶正解毒化瘀方最小殺菌濃度（MBC）測定??微量稀釋法將中藥水提物對倍稀釋成10個梯度，第1孔濃度為1.56 g/mL，11孔為陽性對照，12孔為陰性對照;配制菌液，往1～11孔中加入已調(diào)制好的菌液10 μL，最終接種菌量約為5×105 CFU/mL，重復(fù)3行。

上述96孔板振蕩培養(yǎng)18～24 h。實驗結(jié)果判定：接種環(huán)挑取96孔板中1～10孔內(nèi)菌液涂至增菌培養(yǎng)基血平板上，37 ℃恒溫濕培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果。培養(yǎng)出3個菌落以內(nèi)的濃度為中藥水提物的最小殺菌濃度。

1.2.3?生長曲線測定?取4支50 mL無菌離心管，每只離心管中加入30 mL肉湯，于1、2、3管內(nèi)加入上述實驗中配置的菌液1.5 mL（菌液終濃度為5×105 CFU/mL），前三管為平行實驗組，第4管不加菌，為陰性對照組。將離心管放置于恒溫震蕩器中進行震蕩培養(yǎng)，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。在菌液震蕩培養(yǎng)的0～24 h中，每隔1 h使用酶標(biāo)儀測定菌液的OD570nm值，對OD570nm值用統(tǒng)計軟件進行分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)生長曲線，確定PCR實驗中所需MDRPA菌株樣本的最佳培養(yǎng)時間。

1.2.4?實時熒光定量PCR分離提取總RNA?1）培養(yǎng)細菌：挑取單個細菌菌落分別置于含TZP、中藥水提物的營養(yǎng)肉湯及純營養(yǎng)肉湯中，37 ℃過夜振蕩（200 r/min）培養(yǎng)，收集5 mL含菌培養(yǎng)液，10 000 r/min離心1 min，盡量吸凈上清。往沉淀中加入1 mLRNAzol RT，反復(fù)吹打裂解細胞，裂解液轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中。2）相分離：每1 mLRNAzol RT加入400 mL ddH2O，蓋上蓋子，振蕩混勻約15 s，室溫靜置5～15 min。10 000 r/min離心15 min。3）沉淀：轉(zhuǎn)移上清至新的2 mL離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min。10 000 r/min離心10 min。4）洗滌棄上清，余下沉淀加入400 μL 75%乙醇，混勻后7 500 r/min離心1～3 min，此步重復(fù)1次。5）溶解：棄上清，自然風(fēng)干沉淀，加入50 μL ddH2O溶解，即為總RNA。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液，加入1 μLoligo（dT）15，用無核糖核酸酶的去離子水補足至12 μL，于PCR儀上70 ℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻，依次加入4 μL 5×buffer，2 μL 10 mmol/L dNTPs，1 μL RNA inhibitor和1 μL反轉(zhuǎn)錄酶，用槍抽吸混勻。于PCR儀上42 ℃保溫30 min，結(jié)束后80 ℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。

定量PCR反應(yīng)：使用All in one qPCR Mix進行定量PCR反應(yīng)。取0.2 mL PCR管，配制如下反應(yīng)體系：2×All-in-One qPCR Mix 10.0 μL，PCR forward primer（2 μmol/L）2.0 μL，PCR reverse primer（2 μmol/L）2.0 μL，cDNA 2.0 μL，50×Rox Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR擴增反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 35 s，共進行40個循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后從55 ℃升高到95 ℃獲取熔解曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后所得數(shù)值獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，目的基因的反應(yīng)則根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進行定量分析。目的基因初始模板量與內(nèi)參基因初始模板量的比值，為所測目的基因的相對表達量。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法?采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，方差齊采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），多重比較采用LSD法;方差不齊采用Welch近似方差分析，多重比較采用Dunnett′S T3法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?微量稀釋法測定TZP的MIC值&nbsp;根據(jù)抑菌率≥80%的MIC判定標(biāo)準(zhǔn)得出，P17和ATCC27853菌株TZP的MIC值分別為1 024 μg/mL和2 μg/mL。參照美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)[7]，MIC≤16 μg/mL即為敏感，ATCC27853 MIC值可以驗證實驗方案的可行性，實驗菌株P(guān)17對TZP耐藥。

2.2?微量稀釋法測定中藥水提物的MBC值?將96孔板中1～10孔內(nèi)菌液接種于血平板上，37 ℃恒溫濕培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)18～24 h，結(jié)果顯示只有初始濃度的孔未培養(yǎng)出菌落，最終確定扶正解毒化瘀方水提物的MBC值為0.78 g/mL。

2.3?繪制多重耐藥銅綠假單胞菌的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線??酶標(biāo)儀測得培養(yǎng)24 h的MDRPA實驗管及陰性對照管的OD570nm值。見表1。

OD570nm值反應(yīng)菌液的濃度，OD570nm值越大菌液濃度越大，細菌生長數(shù)量越多。由上表可見在24 h內(nèi)隨著培養(yǎng)時間的增加細菌OD570nm值逐漸增大，說明培養(yǎng)劑中的MDRPA生長、繁殖菌量逐漸增多。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD570nm值為縱坐標(biāo)，繪制實驗菌株P(guān)17的標(biāo)準(zhǔn)生長曲線。結(jié)果提示，在0～6 h細菌進入新的營養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)階段，細菌分裂很少，細菌數(shù)量增加不明顯，為遲緩期，此階段為細菌下一階段的分裂增殖做準(zhǔn)備。在6～21 h進入細菌的快速分裂增值增殖階段，以指數(shù)方式增加，為指數(shù)增長期。21 h后隨著培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，代謝產(chǎn)物的累積，細菌的增殖和死亡達到平衡，細菌量維持在一定水平，進入平穩(wěn)期。細菌在指數(shù)增長期基因復(fù)制處于較高水平，因此實驗菌株P(guān)17在進行實時熒光定量PCR實驗時，最佳的菌株樣本制備時間為18～21 h。見圖1。

2.4?實時熒光定量PCR測定扶正解毒化瘀方對MexAB-OprM外排泵表達的影響?根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，實時熒光定量PCR菌株樣本制備的營養(yǎng)基中TZP組TZP的濃度為1/32MIC值，即32 μg/mL;扶正解毒化瘀方水提物的濃度為1/4MBC值，即0.195 g/mL。單純營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)的菌株樣本作為空白對照組。空白對照組、TZP組、扶正解毒化瘀方水提物組mexB、oprM、mexR的表達量之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。扶正解毒化瘀方水提物干預(yù)組mexB、oprM的表達量較空白組降低，TZP組較空白組增高。經(jīng)TZP干預(yù)組和扶正解毒化瘀方水提物干預(yù)組mexR表達量均高于空白組，TZP干預(yù)組較扶正解毒化瘀方水提物干預(yù)組升高明顯。見表2。

3?討論

主動外排系統(tǒng)的過度表達是PA固有耐藥的重要原因之一。1993年，首次報道PA外排泵的表達。許多革蘭氏陰性桿菌均有外排泵，PA外排泵是一種質(zhì)子泵，可將多種藥物泵出細胞并參從而產(chǎn)生多重耐藥[8]。根據(jù)PA全基因組序列分析，推測該菌至少有12種主動外排系統(tǒng)，至今已經(jīng)通過基因檢測發(fā)現(xiàn)了7種[9]。MexAB-OprM是在PA中發(fā)現(xiàn)的最主要的外排系統(tǒng)，也是臨床上最常見的藥物外排系統(tǒng)。MexAB-OprM具有最廣的底物特異性，包括β-內(nèi)酰胺類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類、氯霉素類、新生霉素類、磺胺類及甲氧芐氨嘧啶，可導(dǎo)致野生型PA對上述藥物耐藥[10]。目前研究[11-14]表明，MexAB-OprM是惟一的確定存在于野生型PA中的外排蛋白，對其天生的耐藥性起重要作用而MexAB-OprM的失活可恢復(fù)野生型PA對多種抗菌藥物的敏感性。MexAB-OprM由MexAB-OprM操縱子mexO編碼，mexR、nalC、nalD基因可負性調(diào)節(jié)操縱子mexO的表達，使mexR基因突變失活。mexB和oprM基因位于同一個操縱子，mexR是MexAB-OprM操縱子的上游基因序列，控制產(chǎn)生MexAB-OprM的阻遏蛋白MexR[15]，mexR的表達量增加，則會抑制MexAB-OprM外排泵基因的表達。

盡管抗菌藥物的使用目前仍然是臨床上治療耐藥菌感染最為常用的手段，但由于PA耐藥機制復(fù)雜，抗生素的選擇壓力逐年增加。中醫(yī)藥是一個偉大的寶庫，對于感染性疾病的治療具有豐富的理論和臨床實踐基礎(chǔ)。近年來中藥治療耐藥菌感染的研究進展較快，取得了較為積極的成果。林冬玲[16]等發(fā)現(xiàn)加味銀翹散可通過降低PA外膜蛋白OprD2的表達而減弱其耐藥性。李少濱等[17]證實黃芩苷能夠體外抑制PA生物膜的形成，從而降低PA的耐藥性。

王淋荊等[18]發(fā)現(xiàn)中藥穿心蓮、金銀花、夏枯草和五倍子可通過促進外排泵基因的表達拮抗抗生素的抗菌作用。

本課題組在臨床研究療效肯定的基礎(chǔ)上，選用MDRPA最為重要的外排泵耐藥機制為切入點，對扶正解毒化瘀方延緩或逆轉(zhuǎn)MDRPA耐藥性的相關(guān)機理進行深入研究。利用泵抑制劑和PCR法篩選出MexAB-OprM外排泵陽性的菌株，并對其用TZP和扶正解毒化瘀方水提物進行干預(yù)培養(yǎng)。實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，扶正解毒化瘀方水提物干預(yù)后oprM的表達量降低（P<0.05），mexB表達量顯著降低（P<0.05），mexR表達量明顯高于空白組（P<0.05），表明扶正解毒化瘀方治療MDRPA感染所致肺炎的有效性可能是通過直接和間接抑制MexAB-OprM外排泵的表達，降低細菌耐藥實現(xiàn)的。TZP作為半合成青霉素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑的復(fù)合制劑，除其本身殺菌作用外，還可以通過促進產(chǎn)生阻遏蛋白MexR，而抑制MexAB-OprM外排泵基因的表達，從而降低細菌耐藥性。

近年來對中藥抑菌作用的研究涉及到體外研究與體內(nèi)研究。體外研究多從單味中藥或中藥復(fù)方對細菌的直接抑菌作用入手探討中藥的抑菌機制。但綜合分析目前中藥的體外抑菌研究，未能得出令人滿意的結(jié)果。并且，在組方用藥方面，目前的體外實驗用藥多局限于清熱解毒類藥物，較少涉及含有扶正類藥物的中藥復(fù)方。因此，進一步的研究，應(yīng)在傳統(tǒng)中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，辨病與辨證相結(jié)合，更加重視耐藥菌感染肺炎病機中正氣不足的因素，采用更為切合病機的中藥復(fù)方進行干預(yù)，深入挖掘中藥在直接抑菌、逆轉(zhuǎn)PA耐藥及與抗生素協(xié)同抑菌等方面的作用機制和巨大潛力，從而多角度、多層面探索中醫(yī)藥對于耐藥菌感染性疾病的療效機制。

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