王開(kāi)成

摘要：采用PDA培養(yǎng)基和PD培養(yǎng)基，對(duì)西瓜病株病原菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)，經(jīng)致病性測(cè)定，形態(tài)學(xué)及rDNA-ITS測(cè)序，鑒定其致病菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定85%氨基寡糖素和97%咪鮮胺對(duì)西瓜尖孢鐮孢菌的共毒系數(shù)。結(jié)果顯示，85%氨基寡糖素∶97%咪鮮胺=3∶1時(shí)，增效作用最好，共毒系數(shù)為167.88，對(duì)西瓜枯萎病菌菌絲具有很好的抑制效果。

關(guān)鍵詞：西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）;殺菌劑;聯(lián)合作用;混配

中圖分類號(hào)：S436.5? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）14-0059-03

Abstract： Pathogen of watermenlon wilt disease was isolated and cultured on PDA and PD， which was indentified was Fusarium oxysporum Schlecht by analysis of morphological characteristics and rDNA-ITS sequence and pathogenic determination. The co-toxicity coefficient of 85% oligosaccharins and 97% prochloraz mixed against Fusarium oxysporum were tested in lab by mycelium growth rate method， respectively. The results showed that synergistic inhibition best when 85% oligosaccharins and 97% prochloraz combinations mixed by 3∶1， co-toxicity coefficient was 167.88， obviously inhibitory against the pathogen.

Key words： Fusarium oxysporum; fungicides; combined action; mixture

西瓜為葫蘆科西瓜屬植物，其果瓤脆多汁，營(yíng)養(yǎng)豐富，堪稱“瓜中之王”，是世界第五大果品[1]。近年來(lái)隨著西瓜栽培面積和需求量的不斷增加，重茬、抗病品種較少等原因，西瓜土傳病害種類增多且日趨加重[2]，致使西瓜生產(chǎn)中的問(wèn)題也日趨凸顯，尤以西瓜枯萎病發(fā)生較為普遍。目前防治西瓜枯萎病尚無(wú)特別有效的藥劑。于2016—2017年，在海南陵水潤(rùn)達(dá)設(shè)施西瓜基地發(fā)現(xiàn)西瓜萎蔫死苗現(xiàn)象，為明確該病的病原菌，本研究對(duì)引起該萎蔫死苗病害的病原菌進(jìn)行了分離、鑒定和藥劑防治。

本試驗(yàn)防治藥劑選擇氨基寡糖素和咪鮮胺。氨基寡糖素是從海洋甲殼類動(dòng)物外殼中提取的殼聚糖通過(guò)生物酶解工程制備而來(lái)的新型生物制劑，通過(guò)誘導(dǎo)植物體提高自身對(duì)外界的免疫力，從而抗病、抗逆（寒害、干旱），促進(jìn)作物健康生長(zhǎng)，是一類新型多功能植物免疫誘抗劑。咪鮮胺是一種高效、廣譜、低毒的甾醇脫甲基化抑制劑，其作用方式獨(dú)特，可通過(guò)與細(xì)胞色素P450羊毛甾醇生物合成必需酶14α-脫甲基酶（CYP51）的血紅素鐵相互作用而抑制真菌的生長(zhǎng)，對(duì)多種真菌性病害有效。本研究旨在探尋兩類作用機(jī)理不同的殺菌劑（免疫誘抗劑和咪唑類殺菌劑）的最佳混配比例，從而達(dá)到延長(zhǎng)殺菌劑使用壽命、提高藥效、降低使用成本、改善質(zhì)量的目的。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試植株? 樣本來(lái)源于海南省陵水縣英州鎮(zhèn)陵水潤(rùn)達(dá)公司設(shè)施西瓜（小型西瓜-美月）病株。

1.1.2? 供試培養(yǎng)基? 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖（PD）液體培養(yǎng)基。

1.1.3? 供試殺菌劑? 85%氨基寡糖素原藥，海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司;97%咪鮮胺原藥，湖北晟隆化工有限公司。

1.2? 病原菌分離純化及致病性測(cè)定

從患病西瓜植株發(fā)病部位的病健交界處切取5 mm×5 mm的組織塊，經(jīng)75%乙醇消毒，在無(wú)菌水中漂洗3次后將組織塊移到PDA平板中，在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。待長(zhǎng)出菌落后，通過(guò)挑取菌落邊緣菌絲體進(jìn)行純化和轉(zhuǎn)接培養(yǎng);將純化的菌種HNXG1601接種到液體培養(yǎng)基（PD）中，28 ℃，125 r/min的恒溫?fù)u床上振蕩培養(yǎng)6～7 d后，用雙層紗布過(guò)濾，離心，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌懸液濃度，并用無(wú)菌水對(duì)菌懸液進(jìn)行稀釋，配制成含量為106個(gè)孢子/mL的菌懸液，選擇傷根法進(jìn)行接種。設(shè)置3次重復(fù)，每次10株，接種后的植株置于26～28 ℃玻璃柜中，保濕。待接種植株發(fā)病后進(jìn)行發(fā)病調(diào)查記錄;并對(duì)接種發(fā)病的植株進(jìn)行病原菌的再次分離和鑒定[3]。

1.3? 病原菌鑒定

挑取純化好的HNXG1601菌絲在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，記錄菌落形態(tài)，依據(jù)分生孢子梗、分生孢子形態(tài)特征、大小及其特性鑒定?；蚪MDNA的提取和純化采用CTAB法進(jìn)行，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并利用Blast與GenBank上已發(fā)表基因進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.4? 毒力測(cè)定

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[3]，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選擇各藥劑適當(dāng)?shù)?個(gè)濃度（表1），將配制好的供試藥劑母液按照設(shè)定的濃度比例加入到已融化并冷卻至45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，充分混勻后分別倒入直徑9 cm的滅菌培養(yǎng)皿中，制成系列濃度的含藥PDA平板。以不加藥劑但含等量無(wú)菌水的PDA平板為對(duì)照。接入直徑5 mm的菌餅，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每處理設(shè)3次重復(fù)。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，以平均值代表菌落大小。通過(guò)濃度對(duì)數(shù)值（X）和抑制率幾率值（Y）之間的線性回歸關(guān)系求出毒力回歸方程和EC50。

2種藥劑85%氨基寡糖素和97%咪鮮胺原藥進(jìn)行混配，有效成分配比為1∶1、1∶3、1∶5、3∶1、5∶1，每個(gè)配比配制成相應(yīng)5個(gè)濃度梯度。采用生長(zhǎng)速率法對(duì)西瓜枯萎病菌進(jìn)行聯(lián)合毒力測(cè)定。計(jì)算混配劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑菌率，分別求得藥劑不同混配比例的毒力回歸方程、EC50和相關(guān)系數(shù)。并根據(jù)孫云沛公式計(jì)算共毒系數(shù)（CTC），確定不同比例混劑的相互作用。

1.5? 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)各處理7 d的平均菌落直徑凈增長(zhǎng)值，分別計(jì)算每種藥劑各個(gè)濃度的實(shí)際抑制率，見(jiàn)式（1）。建立以濃度的自然對(duì)數(shù)值為自變量（X），抑菌率的幾率值為因變量（Y）的回歸方程（毒力回歸方程見(jiàn)式（2），a為回歸截距，b為回歸系數(shù)），用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算各藥劑的EC50[4]。將抑制率換算成幾率值（縱坐標(biāo)）濃度換成10為底對(duì)數(shù)（橫坐標(biāo)），根據(jù)最小二乘法求出EC50。根據(jù)孫云沛公式計(jì)算共毒系數(shù)CTC，見(jiàn)式（3）至式（6）[5]。

抑制率=×100%? （1）

Y=a+bX? （2）

毒力指數(shù)（TI）=×100? ?（3）

實(shí)際毒力指數(shù)（ATI）=×100 （4）

混配理論毒力指數(shù)（TTI）=T1×[A/（A+B）]+T2×[（B/A）+B]? ?（5）

共毒系數(shù)（CTC）=（ATI/TTI）×100? ?（6）

式中，T1為標(biāo)準(zhǔn)藥劑毒力指數(shù);T2為供試藥劑毒力指數(shù);A/（A+B）為標(biāo)準(zhǔn)藥劑混配中所占的百分比;B/（A+B）為供試藥劑混配中所占的百分比。

以CTC評(píng)判兩種藥劑的聯(lián)合毒力作用。CTC<80為拮抗作用，80≤CTC≤120為相加作用，CTC>120為增效作用。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病害癥狀及致病性測(cè)定

接種5 d后西瓜莖基部開(kāi)始發(fā)病，變黃褐色，有輕微縊縮，并伴有開(kāi)裂現(xiàn)象，后期葉片萎蔫直至枯死，有時(shí)造成幼苗猝倒。癥狀與田間觀察相同，對(duì)照沒(méi)有發(fā)病。將發(fā)病的病斑進(jìn)行組織分離，獲得的病原菌與原接種菌HNXG1601一致，根據(jù)柯赫氏法則證明接種菌即為致病菌。

2.2? 病原菌鑒定

培養(yǎng)性狀：25 ℃黑暗條件下在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d，菌絲輻射狀向外生長(zhǎng)，氣生菌絲氈狀，絨狀，菌落白色至淺紅色（圖1a）。菌落生長(zhǎng)前期培養(yǎng)基為白色，后期培養(yǎng)基不變色或變淺紅褐色（圖1b）。

顯微特征：病原菌菌絲無(wú)色，多分枝，具隔膜;產(chǎn)孢細(xì)胞為單瓶梗，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，產(chǎn)孢梗短，直立，無(wú)色，不具隔膜;典型的小型分生孢子數(shù)量多，小型分生孢子假頭狀著生，卵圓形至橢圓形，大小：6.3～13.8 μm×2.5～4.0 μm;大型分生孢子有或無(wú)，鐮刀形或梭形，向兩端漸尖，足細(xì)胞明顯，多為2～4個(gè)隔膜，大小為18.6～37.8 μm×2.5～4.5 μm（圖1c）;厚垣孢子多頂生，單生或串生，黃褐色，球形或近球形。

對(duì)病原菌進(jìn)行擴(kuò)增，片段大小為545 bp。測(cè)序結(jié)果與NCBI基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)菌株HNXG1601與登錄號(hào)為KC201696.1的菌株同源性達(dá)100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)進(jìn)一步鑒定該病原菌為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schlecht）。

2.3? 藥劑聯(lián)合毒力測(cè)定

由表2可知，85%氨基寡糖素∶97%咪鮮胺=1∶1、1∶3和1∶5時(shí)共毒系數(shù)分別為33.68、56.97、73.34，小于80，屬于拮抗作用;85%氨基寡糖素∶97%咪鮮胺=3∶1和5∶1時(shí)共毒系數(shù)分別為167.88和149.67，大于120，具有增效作用，且混配比為3∶1時(shí)增效最高，具有明顯增效作用。

3? 小結(jié)與討論

尖孢鐮刀菌是一種嚴(yán)重危害寄主的土壤習(xí)居菌，能夠侵染葫蘆科、茄科、十字花科、豆科、花卉、水果等多種作物，導(dǎo)致枯萎病的發(fā)生[6]?？菸≡谧魑锏娜趦?nèi)均可發(fā)生[7]，其癥狀常表現(xiàn)為植株萎蔫、葉片早落、維管束系統(tǒng)褐變、堵塞，最終使植株死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)及ITS測(cè)序，鑒定出引起海南陵水潤(rùn)達(dá)設(shè)施西瓜基地西瓜萎蔫死苗的病原菌為尖孢鐮刀菌。目前，針對(duì)由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病防控仍以化學(xué)藥劑防治為主，本研究通過(guò)前人對(duì)枯萎病的防治研究[9，10]，篩選兩類作用機(jī)理不同的殺菌劑（免疫誘抗劑和咪唑類殺菌劑）進(jìn)行混配增效試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)85%氨基寡糖素和97%咪鮮胺混配比例為3∶1時(shí)，增效作用最好，共毒系數(shù)為167.88，對(duì)西瓜枯萎病菌菌絲具有很好的抑制效果。

氨基寡糖素本身對(duì)病原菌的抑制作用較弱，主要是通過(guò)誘導(dǎo)植物體提高自身對(duì)外界的免疫力，從而達(dá)到抗病效果，促進(jìn)作物健康生長(zhǎng)，是一類新型多功能植物免疫誘抗劑。咪鮮胺是一種高效、廣譜、低毒的甾醇脫甲基化抑制劑，其作用方式獨(dú)特，可通過(guò)與細(xì)胞色素P450甾醇生物合成的必需酶14α-脫甲基酶（CYP51）的血紅素鐵相互作用而抑制真菌的生長(zhǎng)，目前田間尚未檢測(cè)到對(duì)咪鮮胺產(chǎn)生抗性的尖孢鐮刀菌菌株[11]，并且國(guó)外早有使用咪鮮胺防治由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病的報(bào)道，并具有較好的防治效果[12]，但在中國(guó)尚未大面積應(yīng)用推廣。

本試驗(yàn)室內(nèi)藥劑毒力測(cè)定結(jié)果表明，85%氨基寡糖素∶97%咪鮮胺=3∶1對(duì)西瓜枯萎病菌菌絲具有很好的抑制效果，為西瓜生產(chǎn)上防治枯萎病提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王? 鳴，焦定量.我國(guó)西瓜育種的進(jìn)展[A].全國(guó)蔬菜遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C].2002.268-273.

[2] 王曉瑋.設(shè)施栽培中蔬菜根結(jié)線蟲鑒定及蔬菜種質(zhì)資源抗病性[D].杭州：浙江大學(xué)，2013.

[3] 方中達(dá).植病研究方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1998.46-47.

[4] 慕立義.植物化學(xué)保護(hù)研究方法[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1991.124-125.

[5] NY/T1156.6-2006，農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，殺菌劑第6部分：混劑的聯(lián)合作用測(cè)定[S].

[6] LIEVENS B，GRAUWET T J M A，CAMMUE B P A，et al. Recent developments in diagnostics of plant pathogens：A review[A].PANDALAI S G. Recent research developments in microbiology[C].Kerala，India：OAI，2005.57-79.

[7] 張吉祥，凌? 鍵，謝丙炎，等.尖孢鐮刀菌專化型及生理小種分子檢測(cè)研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2013，29（36）：338-342.

[8] 裴月令，曾凡云，彭? 軍，等.尖孢鐮刀菌與寄主互作機(jī)理研究進(jìn)展[J].熱帶生物學(xué)報(bào)，2014，5（1）：92-100.

[9] 徐作珽，李? 林，李長(zhǎng)松，等.中生菌素和氨基寡糖素對(duì)西瓜枯萎病防治試驗(yàn)[J].中國(guó)蔬菜，2003（3）：10-12.

[10] 楊普云，李? 萍，王戰(zhàn)鄂，等.植物免疫誘抗劑氨基寡糖素的應(yīng)用效果與前景分析[J].中國(guó)植保導(dǎo)刊，2013，33（3）：20-21.

[11] 裴龍飛，朱發(fā)娣，柴阿麗，等.中國(guó)華北地區(qū)瓜類尖孢鐮刀菌對(duì)咪鮮胺的敏感性及抗藥突變株生物學(xué)性狀研究[J].農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)，2016，18（5）：575-581.

[12] AMINI J，SIDOVICH D. The effects of fungicides on Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici associated with Fusarium wilt of tomato[J].J Plant Prot Res，2010，50（2）：172-178.