易玉玲， 宋 瑱， 雍江堰， 黃筱雪， 李 燕*

(1.成都中醫(yī)藥大學 醫(yī)學技術(shù)學院，四川 成都 611137；2.重慶兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院 檢驗科，重慶 401121)

白色念珠菌是一種二相性真菌，從形態(tài)上分為酵母相和菌絲相，在血清等菌絲形成誘導因素的作用下，白色念珠菌可發(fā)生由酵母相到菌絲相的菌態(tài)轉(zhuǎn)換。已有研究證實白色念珠菌的菌態(tài)轉(zhuǎn)換其實是白色念珠菌由定殖菌向致病菌轉(zhuǎn)變的一種標志，與白色念珠菌致病性和生物膜形成密切相關(guān)[1-2]。研究表明菌絲的形成可以提高白色念珠菌對機體組織的侵襲力與黏附性，而沒有菌絲形成能力的白色念珠菌表現(xiàn)出毒性減低、致病力減弱等特點[3]。另一方面，菌絲的形成可以維持成熟生物膜結(jié)構(gòu)的完整性和多層體系，菌絲的缺乏可以導致生物膜形成能力減弱甚至不形成，而生物膜是造成白色念珠菌高感染性以及高耐藥性的主要因素[4]。因此，研究如何抑制酵母相和菌絲相的菌態(tài)轉(zhuǎn)換對治療白色念珠菌生物膜感染具有重要作用。本研究選擇了道地藥材黃連的主要活性成分鹽酸小檗堿作為干預藥物，探討其對白色念珠菌酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)換的抑制作用及其機制，為臨床抗白色念珠菌感染提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 白色念珠菌標準菌株ATCC-10231，購自廣東省微生物菌種保藏中心，為氟康唑敏感菌株。

1.1.2 主要藥物及試劑 鹽酸小檗堿(成都普菲德生物技術(shù)有限公司)，RPMI1640培養(yǎng)基(GBICO)，hochest染色試劑(Solarbio)，Trizol Rengent(Invitrogen)，Trans Script One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix(北京全式金公司)，TransStart Green qPCR Super Mix(北京全式金公司)。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 恒溫37 ℃孵育箱(DH-500)購自北京中興偉業(yè)儀器有限公司，超凈工作臺(SW-QJ-2FD)購自Airtech公司，倒置熒光顯微鏡(DMI8-M)購自德國徠卡公司，熒光定量PCR儀(qtower2.2)購自德國耶拿分析儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白色念珠菌菌絲形成的體外動力學監(jiān)測 挑取沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h的白色念珠菌置于無菌生理鹽水中，顯微鏡下用牛鮑氏計數(shù)板計數(shù)，然后用RPMI1640液體培養(yǎng)基稀釋成1×106cfu/mL的菌液，將稀釋好的菌液按照3 mL/孔的量加入到含有無菌玻片的6孔板中，37 ℃條件下分別于2、4、6、8 h結(jié)束培養(yǎng)。將上述培養(yǎng)結(jié)束后的玻片取出，用PBS輕輕漂洗3次，置于新的6孔板中加入配制好的hochest工作液進行染色。室溫放置5～10 min后，棄去染色液，用PBS洗滌2～3次，置于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果[5]。

1.2.2 鹽酸小檗堿抑制白色念珠菌生長的MIC測定 參考2017版美國臨床實驗室標準化協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)[6]推薦的微量稀釋法并略作改良。將鹽酸小檗堿溶于DMSO中，配制成質(zhì)量濃度為256 μg/mL的原液，無菌濾器過濾除菌備用，用RPMI1640對原液進行倍比稀釋，質(zhì)量濃度為256～0.5 μg/mL，按照1.2.1所述菌液配制方法，配制成4×103cfu/mL的菌液。將配制的藥液和菌液分別按照每孔100 μL加至96孔板，使每孔菌液終濃度達到2×103cfu/mL，藥物終濃度為128～0.25 μg/mL，37 ℃培養(yǎng)24 h后用XTT試劑測定其細胞含量，酶標儀測定A450，計算抑制率，以抑制80%白色念珠菌生長為MIC值。另設(shè)陽性對照：只加菌液與RPMI1640培養(yǎng)基；陰性對照：只加RPMI1640培養(yǎng)基，實驗重復3次。

1.2.3 hochest染色法觀察鹽酸小檗堿作用下菌絲表觀形態(tài)的變化 實驗分為5組，分別為對照組(不加藥)、氟康唑組、128 μg/mL鹽酸小檗堿組、32 μg/mL鹽酸小檗堿組、8 μg/mL鹽酸小檗堿組。按照1.2.1中配制方法配制白色念珠菌菌懸液，其濃度為2×106cfu/mL，將稀釋好的菌液按照每孔1.5 mL加入到含有無菌玻片的6孔板中，然后按照實驗分組的要求向6孔板中加入1.5 mL相應的藥液，37 ℃培養(yǎng)4、6 h后用hochest進行染色，染色5～10 min后置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 RT-PCR檢測鹽酸小檗堿對白色念珠菌菌絲形成關(guān)鍵基因的影響 同上述操作方法配制菌液，向6孔板中加入白色念珠菌菌液(1.5 mL/孔)，按照1.2.3的實驗分組要求加入相應的藥液(1.5 mL/孔)，37 ℃培養(yǎng)24 h。根據(jù)Trizol法要求提取各組總RNA，并用微量核酸儀測定樣品RNA濃度。隨后按照全式金逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參考文獻[7-9]設(shè)計并在上海生工生物工程公司合成內(nèi)參與目的基因引物(見表1)，并按照全式金熒光定量試劑盒說明書用RT-PCR擴增菌絲形成關(guān)鍵基因(EFG1、HWP1、ECE1和ALS1)，RT-PCR反應條件：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，40次；于 60～95 ℃做溶解曲線分析。實驗重復3次，取平均值，以act1為內(nèi)參基因，采用相對定量2-ΔΔct法對RT-PCR數(shù)據(jù)進行分析。

表1 各基因特異性引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸小檗堿抑制白色念珠菌生長的MIC值

鹽酸小檗堿對浮游狀態(tài)下的白色念珠菌ATCC10231顯示出明顯的抗菌活性，其MIC值均為32 μg/mL。

2.2 白色念珠菌芽管/菌絲形成動態(tài)過程

實驗用hochest染色法對培養(yǎng)0～8 h的白色念珠菌進行染色，從而觀察芽管/菌絲形成動態(tài)過程，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白色念珠菌在培養(yǎng)2 h左右形成大量芽生孢子；4 h左右開始形成較為明顯的芽管；隨后6 h進一步延伸，此時形成的芽管較4 h長，且出現(xiàn)少量的假菌絲；之后8 h大量假菌絲形成，并交織在一起，結(jié)果見圖1。

圖1 ATCC10231芽管/菌絲形成動態(tài)過程Fig.1 The dynamic formation process of germ tubes/hyphal of ATCC10231

2.3 藥物干預下ATCC10231菌絲生長情況

鹽酸小檗堿作用于 ATCC10231 4 h和6 h后，倒置熒光顯微鏡下細胞形態(tài)情況表明，鹽酸小檗堿對ATCC10231的菌態(tài)轉(zhuǎn)換具有較強的抑制作用，但僅限于高濃度和中濃度鹽酸小檗堿，低濃度無明顯抑制作用；與氟康唑組相比較，高濃度鹽酸小檗堿抑制效果明顯優(yōu)于氟康唑，而中濃度與低濃度鹽酸小檗堿抑制作用不及氟康唑；同時與培養(yǎng)4 h的白色念珠菌相比，培養(yǎng)6 h的白色念珠菌菌絲鏡下情況與之類似，但其菌落數(shù)相對增加，菌絲相對更成熟。其中，128 μg/mL鹽酸小檗堿組和4 μg/mL氟康唑組以酵母相細胞為主，且數(shù)量較對照組明顯減少；32 μg/mL鹽酸小檗堿組以酵母相細胞和菌絲相共同存在，菌絲相對較短，且數(shù)量顯著減少；8 μg/mL鹽酸小檗堿組均以菌絲相細胞為主，數(shù)量變化不明顯，結(jié)果見圖2。

圖2 各藥物干預下白色念珠菌菌絲態(tài)微觀形態(tài)Fig.2 The micromorphology of Candida albicans hypahal under drug intervention A為4 h干預：A1：對照組，A2：4 μg/mL氟康唑組，A3：128 μg/mL鹽酸小檗堿組，A4：32 μg/mL鹽酸小檗堿組，A5：8 μg/mL鹽酸小檗堿組；B為6 h干預：B1：對照組，B2：4 μg/mL氟康唑組，B3：128 μg/m鹽酸小檗堿組，B4：32 μg/mL鹽酸小檗堿組，B5：8 μg/mL鹽酸小檗堿組A：the stage of 4 h, A1: the control group, A2: the fluconazole under 4 μg/mL, A3: the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, A4: the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, A5: the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL;B: the stage of 6 h, B1: the control group, B2: the fluconazole under 4 μg/mL, B3: the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, B4: the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, B5: the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL

2.4 藥物干預后菌絲形成關(guān)鍵基因相對表達情況

RT-PCR結(jié)果表明，鹽酸小檗堿對ATCC10231菌絲形成關(guān)鍵基因EFG1、HWP1、ECE1、ALS1的表達具有一定抑制作用。在ATCC10231的4 h階段干預組中，128 μg/mL鹽酸小檗堿組與氟康唑組HWP1和ECE1表達降低，32 μg/mL鹽酸小檗堿組EFG1和ALS1的表達降低，而低濃度鹽酸小檗堿無明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，與氟康唑組相比，128 μg/mL鹽酸小檗堿組HWP1表達相對降低，ECE1表達相對增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在ATCC10231的6 h階段干預組中，與對照組比較，氟康唑組EFG1、HWP1、ECE1和ALS1表達均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；同時128 μg/mL鹽酸小檗堿組HWP1、ECE1和ALS1表達降低，32 μg/mL鹽酸小檗堿組EFG1、HWP1和ALS1表達降低，而8 μg/mL鹽酸小檗堿組對菌絲形成相關(guān)基因的表達無明顯抑制作用，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而與氟康唑組比較，僅有128 μg/mL鹽酸小檗堿組ALS1的表達降低，但差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其他組基因表達均相對增加。與4 h階段干預組各基因表達量相比較，6 h階段干預組中128 μg/mL鹽酸小檗堿組ECE1和ALS1的表達以及32 μg/mL鹽酸小檗堿組EFG1和ALS1的表達均相對降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，128 μg/mL鹽酸小檗堿組HWP1的表達相對增加，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。具體結(jié)果見圖3和表2。

圖3 藥物干預后白色念珠菌菌絲形成關(guān)鍵基因相對表達情況Fig.3 The relative expression level of key genes of hyhal formation A為4 h干預：A1：對照組，A2：氟康唑組，A3：128 μg/mL鹽酸小檗堿組，A4：32 μg/mL鹽酸小檗堿組，A5：8 μg/mL鹽酸小檗堿組；B為6 h干預：B1：對照組，B2：氟康唑組，B3：128 μg/mL鹽酸小檗堿組，B4：32 μg/mL鹽酸小檗堿組，B5：8 μg/mL鹽酸小檗堿組;結(jié)果均以各自對照組表達量為標準“1”進行相對比較，*表示與各自對照組相比，P<0.05A:the stage of 4 h, A1： the control group, A2： the fluconazole under 4 μg/mL, A3： the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, A4： the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, A5： the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL；B： the stage of 6 h, B1： the control group, B2： the fluconazole under 4 μg/mL, B3： the berberberine hydrochloride under 128 μg/mL, B4： the berberberine hydrochloride under 32 μg/mL, B5： the berberberine hydrochloride under 8 μg/mL；Getting the results by comparing with the expression level of control group ,and * indicats that compared with the control group, the difference is significant (P<0.05)

3 討 論

白色念珠菌是一種條件致病菌，是醫(yī)院獲得性感染與社區(qū)感染主要病原菌之一。近年來隨著抗生素濫用、免疫力低下以及生物材料的廣泛應用，白色念珠菌已成為臨床重要的病原微生物，其中生物膜的形成是該菌感染率和耐藥性不斷增強的重要因素，而酵母相與菌絲相的菌態(tài)轉(zhuǎn)換對生物膜形成至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)菌絲相細胞是白色念珠菌的主要致病形式，可以增強白色念珠菌對宿主上皮細胞的黏附及侵襲力，有利于躲避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[10]。白色念珠菌的菌態(tài)轉(zhuǎn)換主要受EFG1調(diào)節(jié)的cAMP信號途徑的調(diào)控，外界環(huán)境因素作用于轉(zhuǎn)錄因子EFG1而發(fā)揮作用，進而通過調(diào)節(jié)菌絲形成特異性基因的表達影響菌絲的生長[11-12]。常見的菌絲特異性基因包括細胞伸長相關(guān)蛋白ECE1、菌絲細胞壁蛋白(hyphal wall protein, HWP) 1等，ECE1和HWP1作為菌絲形成特異性基因，在酵母狀態(tài)下不表達，在菌絲狀態(tài)下大量表達，其表達受到EFG1轉(zhuǎn)錄因子的正向調(diào)控。此外，EFG1還可以正向調(diào)控細胞黏附相關(guān)基因ALS1的表達，ALS1為凝集素樣序列基因家族即ALS基因家族所編碼，在生物膜形成過程中ALS1高度表達，ALS1基因缺失可致生物膜形成障礙。

鹽酸小檗堿作為臨床常用中藥黃連的主要活性成分之一，具有較強的抗菌作用，已有證據(jù)表明鹽酸小檗堿在抗白色念珠菌感染方面具有良好的效果。王彩瑞[13]研究了丹皮酚、丁香酚、土槿乙酸以及鹽酸小檗堿4種中藥對白色念珠菌抑制作用，發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿對白色念珠菌具有明顯的抑制作用，且抑制效果最強，表明鹽酸小檗堿在抗白色念珠菌感染方面具有良好應用前景。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿對白色念珠菌的抑制作用除了單用具有良好的抗菌效果，與黃芩苷、冰片聯(lián)用也顯現(xiàn)出明顯的協(xié)同抗菌作用[14]。目前鹽酸小檗堿抗白色念珠菌感染的研究主要局限于對浮游菌抑制作用的研究，對白色念珠菌酵母相向菌絲相菌態(tài)轉(zhuǎn)換的研究少見報道，其作用機制也不甚明確。因此，我們觀察了鹽酸小檗堿對白色念珠菌菌態(tài)轉(zhuǎn)換表觀和關(guān)鍵基因表達的影響，以探討其抑制作用及其分子調(diào)節(jié)機制。本研究hochest染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)128 μg/mL和32 μg/mL鹽酸小檗堿均能通過抑制白色念珠菌菌絲的形成以及導致其數(shù)量減少，從而抑制白色念珠菌發(fā)生菌態(tài)轉(zhuǎn)換，并且128 μg/mL鹽酸小檗堿抑制作用明顯優(yōu)于32 μg/mL鹽酸小檗堿和4 μg/mL氟康唑，而8 μg/mL鹽酸小檗堿抑制作用不明顯，說明鹽酸小檗堿對白色念珠菌菌態(tài)轉(zhuǎn)換有一定的抑制作用，可以抑制其生長以及菌絲形成，但抑制作用具有一定的劑量依賴性。

表2 藥物干預后菌絲形成關(guān)鍵基因表達水平

注：P1表示與各自對照組比較，*表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；P2表示與各自氟康唑組比較；#表示差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)

為了進一步明確鹽酸小檗堿對白色念珠菌發(fā)生菌態(tài)轉(zhuǎn)換的抑制作用機制，分析了菌絲形成關(guān)鍵基因的表達情況。RT-PCR結(jié)果表明鹽酸小檗堿對ATCC10231菌態(tài)轉(zhuǎn)換過程中EFG1、HWP1、ECE1和ALS1的表達具有一定的抑制作用，但僅見于較高濃度的鹽酸小檗堿，低濃度鹽酸小檗堿無明顯抑制作用，并且RT-PCR結(jié)果還表明鹽酸小檗堿對6 h的菌絲形成關(guān)鍵基因的抑制作用優(yōu)于4 h，表明鹽酸小檗堿的抑制作用存在一定的劑量依賴性和時間依賴性。由此可見，鹽酸小檗堿對白色念珠菌的菌態(tài)轉(zhuǎn)換具有明顯抑制作用，其抑制作用的分子調(diào)節(jié)機制可能是通過下調(diào)菌絲形成關(guān)鍵基因(EFG1、HWP1、ECE1、ALS1)的表達來實現(xiàn)的。同時本課題組還發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可以抑制生物膜形成——生物膜三維結(jié)構(gòu)破環(huán)、菌絲形成受抑，其分子機制也與EFG1、HWP1、ECE1和ALS1的表達下調(diào)密切相關(guān)，因此進一步證實了菌絲形成是生物膜形成的關(guān)鍵一步，利用鹽酸小檗堿下調(diào)菌絲形成關(guān)鍵基因的表達，影響生物膜形成關(guān)鍵物質(zhì)——菌絲的形成，可以達到抑制生物膜形成的目的。

目前，臨床上針對生物膜感染提出抗生素鎖定(ALT)技術(shù)進行治療，采用高濃度的抗生素作用于細菌生物膜，達到有效清除生物膜的目的[15]。而本研究結(jié)果表明鹽酸小檗堿可以抑制白色念珠菌的菌態(tài)轉(zhuǎn)換，但僅限于較高濃度的鹽酸小檗堿，同時鑒于白色念珠菌菌態(tài)轉(zhuǎn)換在生物膜形成中的重要作用，提示臨床可參考ALT技術(shù)加大局部藥物使用劑量，并延長藥物干預時間，影響白色念珠菌菌態(tài)的轉(zhuǎn)換，從而控制白色念珠菌感染。