閔玉濤，宋彥顯，馬慶一，劉 鑫

(1.鄭州工程技術(shù)學(xué)院 化工食品學(xué)院，河南 鄭州 450044 ；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450002；3.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 研發(fā)部,湖北 武漢 430000)

糖尿病是由于代謝混亂造成的一種慢性疾病，目前尚不可治愈，糖尿病藥物市場是當(dāng)前價(jià)值最大和數(shù)量增長最快的醫(yī)藥市場之一。2017年國際糖尿病聯(lián)盟發(fā)布的報(bào)告顯示，全球糖尿病患者達(dá)4.25億。中國是糖尿病患者最多的國家，達(dá)到1.14億，預(yù)計(jì)2035年糖尿病患者將達(dá)到5.92億[1]。糖尿病患者日益增加，受醫(yī)療條件限制，未檢出該病患的人數(shù)眾多，且有年輕化趨勢，已嚴(yán)重影響到人類健康。目前，上市的糖尿病治療藥物以化學(xué)合成藥物為主，不可避免地給患者帶來一定的毒副作用[2-3]，對(duì)患者造成一定的痛苦。因此，糖尿病藥物的開發(fā)任重而道遠(yuǎn)。

鉻是人體必需的微量營養(yǎng)元素之一，是體內(nèi)葡萄糖耐量因子(glucose tolerance factor，GTF)的重要組成成分[4]。1957年美國的醫(yī)學(xué)科學(xué)家MERTZ和SCHWARZ提出了啤酒酵母中含有葡萄糖耐量因子GTF的假設(shè)，并于1959年證實(shí)其重要組成成分是Cr3+。MERTZ后來證實(shí)了鉻是葡萄糖代謝時(shí)胰島素發(fā)揮作用所必需的一種元素[5]。鉻與胰島素兩者缺一或單獨(dú)存在都會(huì)影響到對(duì)葡萄糖的利用。1980年科學(xué)家終于在動(dòng)物的肝、腎中獲取了類GTF物質(zhì)LMWCr(Low-Molecular-Weight Chromium)，被科學(xué)界重新譯為“鉻調(diào)素”。LMWCr與胰島素介導(dǎo)反應(yīng)有關(guān)，它可與胰島素受體結(jié)合，激活受體酪氨酸激酶活性，在胰島素信號(hào)自動(dòng)放大機(jī)制中扮演著重要角色。LMWCr是目前公認(rèn)的鉻的生物活性形式[6]。

DAVIS等[7]證實(shí)LMWCr在激活胰島素受體激酶活性過程中起關(guān)鍵作用。JAIN等[8]表明LMWCr可以增強(qiáng)胰島素的結(jié)合力，增加胰島素受體的數(shù)目。它通過激活胰島素受體激酶和抑制胰島素受體酪氨酸磷酸酶來增加胰島素受體的磷酸化作用，從而提高胰島素的敏感性。吳揚(yáng)等[9]制備了鞣酸與鉻的化合物并用于治療糖尿病效果明顯。DAVIS等[10]合成了鉻的聚合物[Cr3O(O2CCH2CH3)6(H2O)]+，實(shí)驗(yàn)表明此化合物可以激活胰島素受體上的蛋白酪氨酸磷酸激酶，可用于Ⅱ型糖尿病的治療。由此可見，鉻調(diào)素對(duì)于預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥有著極其重要的作用。上述的報(bào)道表明了從天然產(chǎn)物及其鉻調(diào)素類似物中篩選新的降糖因子是一個(gè)頗具潛力的研究領(lǐng)域，但是目前此領(lǐng)域已完成的研究工作，無論從深度(對(duì)機(jī)制的探討)還是廣度(篩選對(duì)象)上尚嫌不足，有廣闊的研究空間。

本文按照Toepfer法制得LMWCr濃縮液，以蛋白酪氨酸磷酸酶為靶酶，測定其抑制作用，可作為蛋白酪氨酸磷酸激酶抑制劑篩選的基準(zhǔn)物，為鉻調(diào)素類似物的篩選提供依據(jù)，為糖尿病藥物的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

PDA斜面培養(yǎng)基：按照GB4789.15進(jìn)行配制，用于菌種的復(fù)蘇及保存；種子培養(yǎng)基[11]：葡萄糖2%，甘氨酸1%，酵母粉0.1%，調(diào)節(jié)至pH 6.0，主要用于發(fā)酵菌種的培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)基：由麥芽汁(12～13Bx)添加經(jīng)預(yù)殺菌的三氯化鉻(20mg/mL)組成，培養(yǎng)基配好后在121℃下高溫滅菌30min；啤酒酵母：安琪酵母股份有限公司；蛋白酪氨酸磷酸酶，實(shí)驗(yàn)室自制；工業(yè)專用粉狀活性炭：江蘇瑞晨碳業(yè)科技有限公司；GF254薄層層析硅膠板：青島邦凱高新技術(shù)材料有限公司；茚三酮：AR級(jí)，北京吉美生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

756MC紫外分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HYG-Ⅲ旋轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；SXK-103超凈工作臺(tái)：中國蚌埠凈化儀器廠；LRH-150S恒溫恒濕培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；YXQ.SG41.280 B電熱手提式壓力蒸汽滅菌鍋：上海醫(yī)用核子儀器廠；JA1003電子天平：上海精科天平廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化

將啤酒酵母接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，置于恒溫培養(yǎng)箱中在28℃下培養(yǎng)，以恢復(fù)其活力。

1.3.2 種子培養(yǎng)

將啤酒酵母菌種接種于50 mL種子培養(yǎng)基中，180r/min，28℃下培養(yǎng)18h，進(jìn)行種子培養(yǎng)。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)[12]

種子培養(yǎng)基按10%接種量接種于50 mL含鉻發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃靜置培養(yǎng)6h后，180r/min，28℃下?lián)u瓶培養(yǎng)18h，得到新鮮的高鉻酵母。酵母菌培養(yǎng)液3000r/min離心10min，沉淀用去離子水反復(fù)沖洗，直至檢測不出鉻離子為止。富鉻酵母于60℃干燥，粉碎，得淡黃色的富鉻酵母粉。

1.3.4 從酵母中分離LMWCr[13]

按照TOEPFER法[14]，將富鉻酵母懸浮于50%的乙醇溶液中，攪拌，加熱至沸后，冷卻至室溫過夜，過濾后去殘?jiān)?，減壓蒸出乙醇，水溶液調(diào)至pH3.5，用活性炭吸附LMWCr，過濾后棄掉濾液，依次用95%乙醇及水洗滌活性炭，濾液懸浮于11的濃氨水-乙醚液中，經(jīng)洗脫、濃縮后，即得到LMWCr濃縮液。

1.3.5 LMWCr對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP 1B)的抑制動(dòng)力學(xué)

底物濃度27.22 mmol/L時(shí)，取一定量的LMWCr濃縮液，在37 ℃，pH7.20，Tris-HC1緩沖溶液(10 mmol/L)所產(chǎn)生的離子強(qiáng)度下進(jìn)行酶促反應(yīng)，405 nm處定時(shí)測定其吸光度。以吸光度每分鐘增加0.001為1個(gè)相對(duì)活力單位。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 LMWCr對(duì)蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP 1B)抑制活性的反應(yīng)體系

以第9min的吸光度計(jì)算各成分的抑制率，

式中：ρ—鉻酵母對(duì)蛋白酪氨酸酶的抑制率；

A0—無抑制劑時(shí)的吸光度；

A1—組分的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 LMWCr水解液的薄層層析

取LMWCr濃縮液1mL，加入0.2%茚三酮試液2～3滴，加熱煮沸4～5min，待其冷卻后呈藍(lán)紫色，表明有肽或氨基酸存在。

LMWCr濃縮液用6mol/L鹽酸回流煮沸20h左右，使肽完全水解，水解液硅膠板薄層層析，結(jié)果如圖1。

從圖1中可以看出，LMWCr濃縮液經(jīng)水解后，含有4種不同的氨基酸，這與劉亞明[15]、李平[16]等提到的GTF中含有4種氨基酸的結(jié)論相吻合。

圖1 LMWCr水解液薄層層析圖

2.2 富鉻酵母的紫外吸收光譜掃描分析

對(duì)所得到的LMWCr濃縮液進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果見圖2。

圖2 LMWCr濃縮液紫外掃描圖

從圖2可見，濃縮液在 260nm 處有一明顯吸收峰，這與金嬋等[17]研究富鉻酵母時(shí)發(fā)現(xiàn)其在260nm有一紫外吸收峰、丁文軍[18]和HAYLOCK等[19]報(bào)道 GTF 在 260nm 處有相同紫外吸收特征峰一致。同時(shí)，測定三氯化鉻溶液時(shí)無此特征吸收峰，再結(jié)合薄層層析結(jié)果，表明富鉻酵母鉻復(fù)合物已成功制得。

2.3 LMWCr對(duì)PTP 1B的抑制活性

在底物濃度為27.22 mmol/L，LMWCr濃縮液為20.13μL時(shí)，以不加LMWCr為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，在405 nm處測定其隨時(shí)間變化的吸光度，繪制透析酶的時(shí)間-吸光度曲線圖，如圖3所示。

圖3 LMWCr對(duì)PTP 1B的抑制活性時(shí)間-吸光度曲線

在405 nm處測定第9min的吸光度，計(jì)算抑制率為13.60%。PTP1B抑制劑通過削弱PTP1B對(duì)胰島素受體的去磷酸化作用，以提高胰島素受體及其底物的磷酸化水平，進(jìn)而起到類胰島素和胰島素增敏的作用，達(dá)到降糖的效果[20]。LMWCr對(duì)PTP 1B有顯著的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)了其可以作為降糖因子，可以把PTP 1B的抑制劑制備鉻絡(luò)合物，進(jìn)一步提高其降糖效果。

3 結(jié)論

LMWCr是目前公認(rèn)的鉻的生物活性形式，再加上酵母鉻研究條件比較成熟，因此，本文選擇酵母鉻為篩選蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑的基準(zhǔn)物。按照TOEPFER法制得LMWCr濃縮液，通過薄層層析和紫外掃描得以驗(yàn)證，表明已成功從富鉻酵母中制得了鉻復(fù)合物。LMWCr對(duì)PTP 1B的抑制率達(dá)13.60%，PTP 1B的抑制劑可制備鉻絡(luò)合物，提高降糖活性，為鉻調(diào)素類似物產(chǎn)品的研發(fā)等提供參考。