方 慶

（商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 商丘476100）

引言

隨著生物科技的發(fā)展，人類對生物的研究已經(jīng)由生物個體、細胞、染色體轉(zhuǎn)向分子領(lǐng)域.目前，幾乎每個生物學(xué)科都在運用染色體核型分析技術(shù)研究染色體，試圖從微觀方面了解更多的有關(guān)生命的奧秘.在園藝作物上，商宏莉、郭英發(fā)表了《6個無花果品種的染色體組型研究》［1］；牛學(xué)南發(fā)表了《百合科三種植物的核型分析》［2］；戴小紅發(fā)表了《百合三品系代表品種的核型分析》［3］；李國泰發(fā)表了《大葉芹染色體的核型分析》［4］；汪衛(wèi)星發(fā)表了《番木瓜的核型分析》［5］及《輪葉黨參染色體核型分析》［6］；呂芳德發(fā)表了《山核桃屬部分種的核型分析》［7］；申定健發(fā)表了《柑桔屬6種植物染色體核型比較分析》［8］……綜合以上研究者的研究，可以看出他們所研究的對象不同，但所用方法基本相似（核型分析），要進行核型分析研究，則必須先做好細胞染色體壓片工作.做好染色體壓片是進行核型分析的前提和關(guān)鍵.

目前，根尖細胞壓片技術(shù)廣泛運用在植物染色體分析上，但此壓片技術(shù)在操作程序、取材時間、解離時間等方面都可以提出不同的處理方法［9-11］.因此，我們于2018年4至6月期間對大蒜等幾種材料的染色體壓片方法進行了研究，對其進行細胞染色體核型分析，擬找到最好的壓片程序及方法，為進行核型分析及下一階段試驗奠定堅實的基礎(chǔ)［12-13］.

1 材料與方法

1.1 材料

采用豌豆根尖、大蒜根尖、石榴根尖和莖尖為試驗材料.

1.2 方法

1.2.1 取材

取正在生長的根尖1cm-2cm，在一天之中的不同時間進行取材.

1.2.2 預(yù)處理

用0.002mol／L 8-羥基喹啉30℃處理2.5h.

1.2.3 固定

放在固定溶液中固定20min-40min，洗凈其醋酸后移入70%酒精中保存.

1.2.4 解離材料在50%酒精中浸泡5min，再用蒸餾水洗滌1min，后轉(zhuǎn)入1mol／L冷鹽酸（室溫）浸泡1min，再轉(zhuǎn)入1mol／L鹽酸（60℃恒溫）浸泡40min，接著轉(zhuǎn)入1mol／L冰鹽酸浸泡1min，再接著置于2%果膠酶水溶液中，在室溫下處理30min，最后取出洗滌1-2次.

1.2.5 染色

一般情況下，經(jīng)過固定的材料馬上進行染色效果較好（染色清晰而且染色體易分散）.若經(jīng)體積分數(shù)70%的酒精長期保存后，雖然細胞質(zhì)也容易著色，但染色體會有不同程度的黏結(jié)，所以分散性差.本試驗是將固定好的材料用蒸餾水反復(fù)洗幾遍，然后將材料放入已預(yù)熱至60℃的1M HCL中保溫10min左右，然后用常溫1M HCL洗1次，最后把材料轉(zhuǎn)入Schiff試劑中，在10℃黑暗條件下染色1h-5h.染色結(jié)束后將材料轉(zhuǎn)到蒸餾水中或45℃的醋酸中.

1.2.6 壓片

給被染色后的材料蓋上蓋玻片放在平整的桌面上，在蓋玻片上蓋兩層吸水紙，用左手手指壓緊，防止蓋玻片滑動，然后用右手持一解剖針，用針柄輕敲蓋玻片，使材料均勻分散開及細胞分散壓平.也可用右手的拇指輕壓蓋玻片，使材料分散.

本試驗按傳統(tǒng)染色方法將解離后的根尖放置在載玻片上，同時用刀片切取1mm-2mm根尖，滴加1滴配置好的染液，并用解剖針搗碎根尖.放置約10min，待根尖染成暗紅色，加蓋玻片，用吸水紙放在蓋玻片上面，用右手拇指在吸水紙上對準(zhǔn)根尖輕壓，或用鉛筆柄端輕輕敲擊，將根尖材料壓成一均勻薄層，注意不要移動蓋玻片（為了觀察方便，可在蓋玻片下墊一張白紙）.

1.2.7 鏡檢

一般來說，在制成的染色體玻片標(biāo)本中，染色清晰而且分散良好的中期分裂相總是少數(shù)，所以，在壓片之后需要認真地進行鏡檢.鏡檢時先用低倍鏡進行觀察，找到一個好的視野后再轉(zhuǎn)用高倍鏡觀察.合格的壓片，可用防水墨水在蓋片和載片的交界處劃線作記號，作為制作永久壓片時封片的標(biāo)記.

一張優(yōu)良的細胞染色體壓片至少應(yīng)符合如下條件：

1）在一張壓片中應(yīng)有較多的中期分裂相；2）染色體分散而不重疊；3）染色體不扭曲、斷裂，主縊痕、隨體等清晰；3）壓片基本上為一層平展的細胞，觀察時視野內(nèi)所看到的細胞都處在一個平面上；4）染色體著色較深，而細胞質(zhì)不著色或著色很淺，背景清晰無過多雜質(zhì).

1.2.8 染色體觀察

將載有樣品的玻片置于顯微鏡下觀察，若染色較淺，可從蓋玻片一側(cè)加灑液，同時在另一側(cè)用濾紙吸引染料，還可將載玻片在酒精燈上微微加熱，這樣染色體著色效果會更好些.如果分散不夠，難以計數(shù)，可取下載玻片，重新鋪上吸水紙，再次敲打，必要時也可用手指從吸水紙上對蓋玻片施加適度壓力，如此常會得到十分滿意的結(jié)果.但須注意，手指壓力不可過大，否則會壓破細胞，造成染色體的流失、斷裂或卷曲變形.

2 結(jié)果分析

2.1 不同材料根尖細胞壓片效果比較

如圖1、2、3所示，可以清楚地看出：用大蒜根尖細胞所做的壓片最好；其次是豌豆；最差的是石榴.主要原因在于木本植物（如石榴）比草本植物的根尖細胞壁的纖維素層致密，不易解離和搗碎.

圖1 石榴根尖細胞

圖2 豌豆根尖細胞

圖3 大蒜根尖細胞

2.2 不同解離時間對材料搗碎難易程度的影響

草本植物根尖較易搗碎，顯微鏡下細胞分散良好，觀察效果清晰，木本植物根尖則較難搗碎，尤其是木本植物的莖尖更難搗碎.材料越易搗碎越容易做切片.因此，一般多用根尖做切片.從表1可以看出，解離時間對材料的搗碎程度有顯著影響，解離時間越長材料越易搗碎.（說明：解離是指用鹽酸浸泡材料.另外，解離后的材料，需15min-20min搗碎為難搗碎；10min-15min搗碎為較難搗碎；5min-10min搗碎為中等搗碎；2min-3min搗碎為易搗碎）通過對材料搗碎難易程度的把握，可以篩選出適宜材料的解離時間.

表1 解離時間對材料的影響

2.3 經(jīng)酶處理與未經(jīng)酶處理的切片效果比較

用0.2%果膠酶對大蒜、豌豆和石榴的根尖細胞處理30min，并與未處理的根尖細胞作對照，可以看出，經(jīng)過酶處理的根尖細胞切片效果較好.因為果膠酶可以溶解細胞壁果膠質(zhì)成分，從而使細胞壁解體，在顯微鏡下可以清晰看到細胞核部分，周圍有細胞壁輪廓.如圖4、5所示：

圖4 未處理的豌豆根尖細胞

圖5 處理過的豌豆根尖細胞

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 材料的準(zhǔn)備和選擇

通過試驗發(fā)現(xiàn)，在選擇制片材料時，其準(zhǔn)備工作較為復(fù)雜.如果材料的新根生長慢或因休眠等原因而未能長出新根，則影響試驗的進行；石榴的種子長出的新芽易發(fā)生褐變，也會影響到試驗觀察效果.另外，通過試驗我們發(fā)現(xiàn)，在一天之中，晚上取材比早上和中午取材效果好，三者由好到差依次為晚上＞早上＞中午.在試驗過程中，試驗需要用到的最重要的器材是顯微鏡，通過反復(fù)試驗對比發(fā)現(xiàn)，如果要清晰地觀察細胞染色體結(jié)構(gòu)，必須使用高放大倍數(shù)和分辨率的顯微鏡.

3.1.2 操作中注意事項

為了在切取根尖時便于操作，同時為了防止在固定以及解離過程中材料的丟失，應(yīng)該切取較長根尖（一般1cm-2cm）.在染色壓片時，切取最短根尖（大約1mm-2mm），最好使用放大鏡等工具加以輔助，以便準(zhǔn)確地切取最頂端根尖.因為石榴莖尖頂端的生長點不明顯，只有左右對稱的兩片嫩葉（自動封頂現(xiàn)象），因此，可用頂端上部葉腋內(nèi)的側(cè)芽生長點代替.

3.1.3 解離時間的把握

解離時間的長短直接影響后續(xù)的搗碎操作的難易程度和壓片效果的好壞.若解離時間不足，搗碎困難，壓片會出現(xiàn)未分開的組織塊，時間過長則不利于制作.解離時間應(yīng)視材料而定 ，一般木本植物材料解離時間應(yīng)適當(dāng)延長，草本植物材料解離時間應(yīng)適當(dāng)縮短.

3.2 結(jié)論

實驗結(jié)果表明：1）一般情況下，用草本植物的根尖細胞做壓片材料比木本植物效果好；2）制作壓片效果的好壞取決于解離的好壞和搗碎的程度；3）對于同一植物材料，在一定的范圍內(nèi)，解離的時間越長搗碎分散細胞的效果越好，用0.2%果膠酶處理30min的細胞壓片較未經(jīng)0.2%果膠酶處理30min的效果好，其細胞核暴露完全.