林雅寧，劉惠娜，占景華，徐忠玉

(第九○九醫(yī)院/廈門(mén)大學(xué)附屬東南醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建漳州 363000)

銅綠假單胞菌(PA)是臨床上常見(jiàn)的條件致病菌，在自然界分布廣泛，對(duì)環(huán)境抵抗力較強(qiáng)[1]。隨著廣譜抗菌藥物的普遍使用，該菌耐藥性明顯上升。PA的致病機(jī)制與Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)密切相關(guān)，毒力基因exoS和exoU在PA致病中起著重要作用。為了提高醫(yī)院抗菌治療效果和指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，現(xiàn)對(duì)2016-2017年本院臨床分離的1 000株P(guān)A和43株多藥耐藥PA菌株的毒力基因進(jìn)行研究分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 1 000株P(guān)A來(lái)自2016-2017年全院臨床各科室送檢的住院患者標(biāo)本，包括痰液標(biāo)本726株，分泌物144株，中段尿44株，血液28株，胸腹腔積液26株，其他32株。同一患者多次分類的菌株不重復(fù)計(jì)入。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行，運(yùn)用WalkAway 96 Plus全自動(dòng)微生物分析儀對(duì)菌株進(jìn)行鑒定及藥敏試驗(yàn)，以PA ATCC 27853作為質(zhì)控菌株。

1.2.2毒力基因exoS和exoU的檢測(cè) 采用煮沸法提取DNA模板，委托上海生工合成兩對(duì)特異度引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上下游引物參考文獻(xiàn)[2]。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 在Excel上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1耐藥率 1 000株P(guān)A對(duì)9種常用抗菌藥物均有不同程度的耐藥，其中對(duì)阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦、環(huán)丙沙星、美羅培南和亞胺培南有較好的藥物敏感活性，對(duì)頭孢他定和頭孢吡肟耐藥率較高。見(jiàn)表1。

表1 1 000株P(guān)A對(duì)9種抗菌藥物的耐藥率

2.2毒力基因exoS和exoU的檢測(cè) 以exoS和exoU特異度引物擴(kuò)增相應(yīng)片段，43株多藥耐藥PA中exoS(+)33株，exoU(+)6株。根據(jù)PCR結(jié)果統(tǒng)計(jì)這43株P(guān)A的毒素基因攜帶情況，其中exoS(+)/exoU(-)基因型共有33株，占78.6%；exoS(-)/exoU(+)基因型有6株，占14.3%；exoS(-)/exoU(-)基因型有4株，占7.1%。

2.3不同基因型的耐藥率比較 exoS(-)/exoU(+)基因型對(duì)抗菌藥物耐藥率基本高于exoS(+)/exoU(-)組，尤其對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢他啶、美羅培南和頭孢吡肟的耐藥性exoS(-)/exoU(+)明顯高于exoS(+)/exoU(-)，耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組含毒力基因的PA對(duì)9種抗菌藥物的耐藥情況

3 討 論

PA是一種重要的醫(yī)院感染條件致病菌，可以感染人體任何組織部位。醫(yī)院2016-2017年共檢出1 000株，標(biāo)本類型構(gòu)成比由高至低依次為痰液726株(72.6%)，分泌物144株(14.4%)，尿液44株(4.4%)，血液標(biāo)本28株(2.8%)，胸腹腔積液26株(2.6%)，其他標(biāo)本32株(3.2%)。其中分離到的痰液標(biāo)本略低于同類報(bào)道的78.01%[3]，但遠(yuǎn)比余昊等[4]報(bào)道的61.7%高。說(shuō)明呼吸道為PA醫(yī)院感染的高發(fā)部位，應(yīng)注意預(yù)防呼吸道發(fā)生醫(yī)院感染。

PA耐藥情況很嚴(yán)重，這與PA的內(nèi)外因密切相關(guān)，外因就是抗菌藥物的廣泛使用，內(nèi)因就是該菌具有特殊的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，對(duì)許多抗菌藥物存在固有耐藥，其耐用機(jī)制復(fù)雜。表1顯示PA對(duì)阿米卡星的藥物敏感度最好，可能是阿米卡星對(duì)該菌產(chǎn)生的鈍化酶比較穩(wěn)定，與楊燕等[5]、孫敏等[6]報(bào)道一致。其次對(duì)哌拉西林/他唑巴坦、環(huán)丙沙星、美羅培南和亞胺培南也有較好的藥物敏感度，這與全國(guó)2012-2013年的“中國(guó)CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)”資料吻合[7-8]。對(duì)三代頭孢他啶耐藥率為42.2%，略高于王靜等[9]報(bào)道的32.39%。這可能與近年來(lái)該抗菌藥物的廣泛使用有關(guān)。

PA致病是由多種致病因子實(shí)現(xiàn)的，其中T3SS是PA的一個(gè)重要毒力因子分泌系統(tǒng)，可以將編碼的毒力蛋白直接注入宿主細(xì)胞中，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10]。本研究對(duì)臨床分離的43株多藥耐藥PA進(jìn)行毒力基因exoS和exoU檢測(cè)與分析。結(jié)果表明，exoS基因攜帶率78.6%遠(yuǎn)高于exoU基因的14.3%，且只存在exoS(+)/exoU(-)、exoS(-)/exoU(+)或exoS(-)/exoU(-) 3種基因型。據(jù)報(bào)道，對(duì)于exoU和exoS基因，一般情況下，每株P(guān)A只攜帶其中的一種基因，exoS和exoU不同時(shí)存在同一菌株[11-12]。本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)基因型為exoS(+)/exoU(+)的菌株。但是鞠曉紅等[13]分離的63株銅綠假單胞中34株菌(53.97%)同時(shí)攜帶兩種毒力基因。

通過(guò)對(duì)兩組含不同毒力基因的PA對(duì)9種抗菌藥物的耐藥率的分析，exoS(+)/exoU(-)和exoS(-)/exoU(+)基因型的PA對(duì)美羅培南、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和頭孢吡肟等的耐藥率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。國(guó)外研究，WONG等[14]研究者分離到的臨床PA攜帶exoS菌株高于exoU(62%vs.27%)，且對(duì)左氧氟沙星耐藥率exoS菌株高于exoU菌株(92.0%vs.61.0%)?？赡艿臋C(jī)制為exoS(-)/exoU(+)菌株多表現(xiàn)為主動(dòng)外排泵相關(guān)基因的過(guò)度表達(dá)或者突變[15]。本研究也表明exoU菌株對(duì)于環(huán)丙沙星等喹諾酮類抗菌藥的耐藥率高于exoS，但未對(duì)其具體機(jī)制進(jìn)行深入研究與探討。

綜上所述,PA在醫(yī)院表現(xiàn)出多藥耐藥，且以exoS為主，雖然攜帶exoU的菌株所占比例較低，但其耐藥率高，對(duì)其具體機(jī)制值得深入研究與探討。