噬菌體在環(huán)境耐藥基因轉(zhuǎn)移中的作用綜述

曾祥朋 楊清香

摘要：耐藥細(xì)菌隨著畜禽糞便排出體外后，其攜帶的耐藥基因可以通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動(dòng)元件傳遞給其他環(huán)境微生物，從而導(dǎo)致耐藥基因的傳播和擴(kuò)散。目前對(duì)耐藥基因轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究多集中在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等，對(duì)噬菌體在耐藥基因傳播中的貢獻(xiàn)了解甚少。在河流、海洋、污水等自然環(huán)境中通過噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移已經(jīng)被證實(shí)，噬菌體作為可移動(dòng)元件在基因轉(zhuǎn)移和基因重組中的作用頻率比人們預(yù)想的要高。為了能正確認(rèn)識(shí)噬菌體在畜禽糞便抗生素耐藥基因水平傳播中的作用，結(jié)合國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究，介紹環(huán)境噬菌體的特性及其生態(tài)分布、環(huán)境噬菌體攜帶耐藥基因情況、噬菌體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移機(jī)制以及噬菌體在抗生素耐藥基因傳播中的作用，以期為了解環(huán)境噬菌體在耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中的作用提供參考。

關(guān)鍵詞：抗生素耐藥基因;基因水平轉(zhuǎn)移;噬菌體;轉(zhuǎn)導(dǎo);介導(dǎo);基因轉(zhuǎn)移機(jī)制

中圖分類號(hào)： X172 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）07-0014-05

近幾十年來，為了提高畜禽生長(zhǎng)速度，抗生素在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中被大量應(yīng)用。報(bào)道顯示，我國(guó)抗生素年產(chǎn)量約2萬t，46.1%用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，其中近一半用于動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑[1]?？股氐氖褂酶淖兞损B(yǎng)殖動(dòng)物腸道微生物的耐藥特性，同時(shí)也促進(jìn)了腸道微生物耐藥性的進(jìn)化。Looft等對(duì)生豬飼料同時(shí)添加100 g/t金霉素、100 g/t磺胺甲嘧啶、50 g/t青霉素，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)豬的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，所施加抗生素的耐藥基因豐度也有所增加[2]。Zhu等的研究表明，動(dòng)物飼料和治療用藥使得63種耐藥基因富集了192～28 000倍[3]。長(zhǎng)期使用抗生素而形成的選擇壓力，使得耐藥細(xì)菌逐漸被篩選出，隨著糞便排出體外[4]。目前，畜禽糞便已經(jīng)成為自然環(huán)境中耐藥細(xì)菌和耐藥基因的儲(chǔ)存庫(kù)[5]。耐藥基因是細(xì)菌表現(xiàn)耐藥性的根本原因，耐藥細(xì)菌隨著畜禽糞便排出體外后，其攜帶的耐藥基因可以通過質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等可移動(dòng)元件傳遞給其他環(huán)境微生物，從而導(dǎo)致耐藥基因的傳播和擴(kuò)散[6]。因此，當(dāng)含有耐藥細(xì)菌和耐藥基因的糞便進(jìn)入自然環(huán)境后，在高豐度耐藥基因、可移動(dòng)元件及其他環(huán)境壓力共存的情況下，環(huán)境中的敏感細(xì)菌可能會(huì)因此產(chǎn)生抗生素耐藥性，若人類致病菌通過這種方式獲得多重耐藥性，則會(huì)對(duì)人類健康造成巨大危害[7]。

目前，關(guān)于畜禽糞便中耐藥細(xì)菌和耐藥基因的污染問題已經(jīng)得到廣泛關(guān)注，但是對(duì)其耐藥基因轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究多集中在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子等，對(duì)噬菌體在耐藥基因傳播中的貢獻(xiàn)了解甚少[8-9]。近年來噬菌體在河流、海洋、污水等自然環(huán)境中通過轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移已經(jīng)被證實(shí)[10]，噬菌體作為可移動(dòng)元件在基因轉(zhuǎn)移和基因重組中的作用頻率比人們預(yù)想的要高[11-12]。

本文將總結(jié)近些年環(huán)境噬菌體研究的重要進(jìn)展，介紹環(huán)境噬菌體的特性及其生態(tài)分布、環(huán)境噬菌體攜帶耐藥基因情況、噬菌體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移機(jī)制以及噬菌體在抗生素耐藥基因傳播中的研究方法，以期為全面了解環(huán)境噬菌體在耐藥基因水平轉(zhuǎn)移中的作用提供參考。

1 環(huán)境噬菌體的特性及其生態(tài)分布

噬菌體是原核微生物病毒。噬菌體基因組由單鏈或雙鏈的DNA或RNA組成，大小從幾個(gè)kb到100 kb不等。根據(jù)對(duì)宿主菌作用效果不同，將噬菌體分為兩大類，即溫和噬菌體和烈性噬菌體。

噬菌體是生物圈中豐度最高的生物體，據(jù)估計(jì)總體數(shù)量可達(dá)1030～1032個(gè)。在對(duì)海洋、淡水和土壤環(huán)境中的噬菌體生態(tài)研究表明，噬菌體是自然界微生物系統(tǒng)的重要組分，平均每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞約有10個(gè)噬菌體[12]。噬菌體在海洋中的數(shù)量極其豐富，豐度高達(dá)1030個(gè)，表層海水中噬菌體豐度約為 107個(gè)/mL，是細(xì)菌數(shù)量的5～25倍[14]。人和動(dòng)物體內(nèi)也有高濃度的噬菌體，主要存在于腸道中，它們被認(rèn)為是動(dòng)物體內(nèi)最重要的生物群落[15]。由于噬菌體在水和陸地生態(tài)系統(tǒng)中具有極高的豐度和變化性，因此可以通過特異性侵染、基因水平轉(zhuǎn)移、溶源轉(zhuǎn)換等方式影響細(xì)菌群落，并且在有機(jī)物質(zhì)釋放、營(yíng)養(yǎng)循環(huán)和水生態(tài)系統(tǒng)的功能等方面起著重要作用[16]。噬菌體對(duì)微生物群落構(gòu)成的強(qiáng)大的捕食壓力意味著細(xì)菌能否好好生存不僅取決于可利用的資源，而且取決于生物環(huán)境。因此，噬菌體能夠不斷地調(diào)節(jié)微生物生態(tài)和活性，包括營(yíng)養(yǎng)流食物網(wǎng)動(dòng)力學(xué)、微生物多樣性及多樣化趨勢(shì)[17]。

噬菌體在污水處理系統(tǒng)中也普遍存在。研究表明，活性污泥中噬菌體的數(shù)量為108～109個(gè)/mL，該數(shù)量與大多數(shù)其他水生態(tài)系統(tǒng)相比較高或相當(dāng)。由于噬菌體對(duì)其宿主菌具有特異性的侵染和裂解作用，因此，人們利用噬菌體控制污泥產(chǎn)生以達(dá)到污泥減量的目的。Hao等將活性污泥2D號(hào)模型進(jìn)一步發(fā)展并研究了污水處理系統(tǒng)中原生動(dòng)物的捕食和噬菌體的侵染對(duì)污泥減量的貢獻(xiàn)，結(jié)果表明，捕食作用在污泥減量控制方面更有效，捕食和噬菌體的侵染對(duì)污泥減量最大貢獻(xiàn)率分別達(dá)21%、9%[18]。

一般來說噬菌體有宿主專一性，1株噬菌體只能侵染1個(gè)宿主。但是環(huán)境中也存在一些噬菌體不僅能侵染同種不同株的細(xì)菌，還能夠侵染分類群完全不同的細(xì)菌，甚至能夠侵染革蘭氏染色完全不同的細(xì)菌類群，例如，Khan等從活性污泥中分離出8株噬菌體，其中6株均為寬宿主噬菌體，這就使噬菌體-細(xì)菌的相互作用關(guān)系更加復(fù)雜[19]。一方面噬菌體通過轉(zhuǎn)導(dǎo)可以傳遞相關(guān)基因給宿主菌并有利于宿主菌的生存，另一方面噬菌體侵染并裂解細(xì)菌，使宿主菌產(chǎn)生對(duì)噬菌體的抗性，噬菌體-細(xì)菌可以說是在對(duì)抗中共進(jìn)化[20]。環(huán)境中數(shù)量如此巨大的噬菌體到底有什么作用，在細(xì)菌群落發(fā)展和演化中起什么作用，目前并不清楚，因此，有關(guān)噬菌體和細(xì)菌群落的相互關(guān)系研究是目前微生物生態(tài)學(xué)的重要課題。而耐藥細(xì)菌群落在環(huán)境中的發(fā)展和演化是噬菌體群落研究的很好對(duì)象，因此有關(guān)噬菌體在耐藥轉(zhuǎn)移中的作用研究逐漸成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

2 噬菌體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移機(jī)制

噬菌體介導(dǎo)細(xì)菌間基因轉(zhuǎn)移的方式為特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)或普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。噬菌體在宿主菌體內(nèi)組裝過程中可能產(chǎn)生2種類型的子代病毒顆粒，一種為只包含病毒DNA的顆粒，一種為誤包進(jìn)宿主DNA片段的顆粒。誤包有宿主DNA的病毒顆粒感染新的宿主后可將所攜帶的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞，通過同源重組形成轉(zhuǎn)導(dǎo)子，使受體菌獲得新的基因。此種方式可傳遞供體細(xì)菌任何基因，由烈性噬菌體或溫和噬菌體介導(dǎo)，稱之為普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。噬菌體只能傳遞供體染色體上原噬菌體整合位置附近的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)稱之為特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)，由溫和噬菌體介導(dǎo)。

與轉(zhuǎn)導(dǎo)相似但本質(zhì)不同的另一現(xiàn)象為溶原性轉(zhuǎn)換，當(dāng)溫和型噬菌體感染宿主細(xì)菌時(shí)，噬菌體DNA整合到宿主菌染色體上，使其成為溶原性狀態(tài)并獲得特有的性狀，如對(duì)同源噬菌體的免疫性和可誘導(dǎo)性。通過溶原性轉(zhuǎn)換還可使宿主菌表型發(fā)生改變，獲得或喪失某一性狀。在DNA幾種轉(zhuǎn)移機(jī)制中，由噬菌體引起的溶原性轉(zhuǎn)變更占優(yōu)勢(shì)，且效率更高[7]。雖然以上幾種轉(zhuǎn)移機(jī)制在自然條件下發(fā)生的頻率并不高，但也為基因的轉(zhuǎn)移提供了一個(gè)途徑。

3 環(huán)境噬菌體攜帶耐藥基因情況

噬菌體DNA上攜帶耐藥基因已經(jīng)成為一個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí)，目前，各類水體如城市污水處理廠、活性污泥、河流、醫(yī)院廢水、養(yǎng)殖廢水、屠宰場(chǎng)廢水等均被檢測(cè)，已檢測(cè)到的耐藥基因種類基本涵蓋各種常用抗生素，例如β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、甲氧西林、磺胺類等，具體見表1。

作為噬菌體儲(chǔ)存庫(kù)的土壤環(huán)境目前也已被研究。Ross等利用qPCR手段檢測(cè)土壤中細(xì)菌和噬菌體DNA上所攜帶耐藥基因的情況，共對(duì)strA、strB、sul1、aadA、blaOXA-20等5對(duì)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示所有的耐藥基因均在選用的樣品中檢出[27]。施用未經(jīng)處理、厭氧消化處理、脫水處理肥料的土壤中細(xì)菌DNA中耐藥基因豐度有所增加，但是施用經(jīng)堆肥處理的糞便土壤中耐藥基因豐度有所降低，這就表明堆肥處理顯著降低了攜帶耐藥基因細(xì)菌的數(shù)量，致使檢測(cè)結(jié)果中耐藥基因豐度降低。但是噬菌體DNA上的耐藥基因豐度在各個(gè)土壤樣品中基本持平。這就說明噬菌體作為基因的載體在自然環(huán)境中相對(duì)其宿主菌來說更加穩(wěn)定。

除了環(huán)境樣品，人體糞便樣品中的噬菌體DNA也被檢測(cè)到耐藥基因的存在。Minot等對(duì)人類糞便樣品做病毒宏基因組分析，測(cè)序結(jié)果主要為噬菌體基因組信息[28]。Liu等利用ARDB對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行耐藥基因分析，在基因組中找到萬古霉素類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類等耐藥基因[29]。除了利用宏基因組對(duì)噬菌體基因組進(jìn)行研究，目前對(duì)噬菌體DNA的耐藥基因檢測(cè)主要利用的手段為熒光定量PCR（qPCR）。Quirós等研究了80個(gè)人類糞便樣品中噬菌體DNA上耐藥基因攜帶情況，80個(gè)研究個(gè)體在研究期間均未使用抗生素，用qPCR的方法檢測(cè)了blaTEM、blaCTX-M-1、mecA、armA、qnrA、qnrS等基因的豐度，結(jié)果顯示，77%的樣品中至少被檢測(cè)到1種或多種抗生素耐藥基因，其中blaTEM、qnrA、blaCTX-M-1等是豐度最高的耐藥基因[9]。

噬菌體是細(xì)菌適應(yīng)不同環(huán)境的一個(gè)潛在遺傳基因庫(kù)，是細(xì)菌維持自身群落穩(wěn)定的重要因素。Modi等讓小鼠口服環(huán)丙沙星和氨芐青霉素，研究在抗生素選擇壓力下噬菌體和細(xì)菌如何變化，在抗生素的作用下，噬菌體基因組上編碼大環(huán)內(nèi)酯類和β-內(nèi)酰胺類耐藥基因增多，同時(shí)還出現(xiàn)了與環(huán)丙沙星和氨芐青霉素?zé)o關(guān)的其他耐藥基因;從口服抗生素和對(duì)照的小鼠體內(nèi)分離噬菌體與細(xì)菌群落共培養(yǎng)，與口服抗生素小鼠體內(nèi)分離的噬菌體共培養(yǎng)的細(xì)菌耐藥比例相比對(duì)照增加 2～3倍;抗生素的選擇壓力促進(jìn)了噬菌體和細(xì)菌間的基因交流，噬菌體可以通過基因交換改變宿主菌的抗藥表型以適應(yīng)環(huán)境保證其群落的穩(wěn)定，細(xì)菌群落的穩(wěn)定又保證了噬菌體的正常繁殖[30]。

盡管在噬菌體DNA上檢測(cè)到耐藥基因的存在，在一些菌株之間噬菌體也可以成功介導(dǎo)耐藥基因的轉(zhuǎn)移，然而，目前有關(guān)噬菌體在這種傳播中的證據(jù)還非常有限。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為噬菌體基因組很少編碼耐藥基因。噬菌體在耐藥基因傳播中是否發(fā)揮作用還存在爭(zhēng)論，還沒有一個(gè)完全公認(rèn)的結(jié)論。Enault等的研究結(jié)果[31]可以說是對(duì)目前大多數(shù)研究的一個(gè)巨大反擊，他們采用生物信息學(xué)的方法評(píng)估了1 181株噬菌體基因組耐藥基因存在情況，結(jié)果表明，大多數(shù)噬菌體基因組中的耐藥基因與實(shí)際的耐藥基因的同源性很低，或者檢測(cè)到的耐藥基因?qū)嶋H上是沒有耐藥活性的，而目前大多數(shù)報(bào)道的噬菌體耐藥基因普遍被明顯高估。這就是說噬菌體在耐藥基因傳播中的作用很可能被普遍高估。

4 噬菌體在抗生素耐藥基因傳播中的作用

噬菌體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的傳統(tǒng)研究手段是利用選擇性培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)子進(jìn)行篩選，可以直觀表征轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果，例如，F(xiàn)ard等以鶉雞腸球菌（Enterococcus gallinarum）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis）為宿主菌分離了3株噬菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)，從基因型和表型對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)后的受體菌進(jìn)行耐藥性評(píng)估，結(jié)果顯示，在噬菌體介導(dǎo)作用下，四環(huán)素抗性由鶉雞腸球菌成功傳遞給了糞腸球菌;慶大霉素抗性由糞腸球菌成功傳遞給屎腸球菌（Enterococcus faecium）、海氏腸球菌（Enterococcus hirae）、耐久腸球菌（Enterococcus durans）、酪黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus）等，雖然轉(zhuǎn)移頻率不高，但是也為耐藥基因的轉(zhuǎn)移提供了一個(gè)途徑，證明噬菌體在腸球菌抗生素耐藥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了一定作用[32]。但是這種方法依賴于轉(zhuǎn)移基因的高頻率表達(dá)，不能對(duì)細(xì)菌-噬菌體間基因流動(dòng)的具體方向做定量描述，更不能在單細(xì)胞水平研究基因的交換重組情況。

Hease等將PCR的高靈敏度與熒光原位雜交技術(shù)對(duì)細(xì)胞精確定位及形態(tài)學(xué)分析技術(shù)相結(jié)合，建立了原位PCR[33]，該方法首先對(duì)細(xì)胞預(yù)處理使細(xì)胞具有適當(dāng)通透性并保持完整;然后PCR各反應(yīng)物進(jìn)入細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增目的基因片段，利用熒光分子標(biāo)記的dNTP和引物在擴(kuò)增同時(shí)或者擴(kuò)增后利用DNA分子雜交和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)等，使擴(kuò)增產(chǎn)物帶上熒光信號(hào)并在細(xì)胞內(nèi)原位停留;最后用熒光顯微鏡檢測(cè)目的基因。原位PCR技術(shù)可以在組織切片、細(xì)胞等樣品中檢測(cè)低拷貝的DNA或RNA，并在形態(tài)學(xué)上精確定位，通過揭示細(xì)胞內(nèi)低拷貝基因的分布，可對(duì)病毒感染、基因突變、基因重排、基因低水平表達(dá)等進(jìn)行深入研究。原位PCR為噬菌體-細(xì)菌間基因流動(dòng)提供一個(gè)直觀的檢測(cè)手段。Hease等利用原位PCR成功擴(kuò)增檢測(cè)到真核細(xì)胞中Visna病毒的DNA[33]。Kenzaka等利用與原位PCR原理相同方法即循環(huán)引物介導(dǎo)的原位標(biāo)記-熒光原位雜交（cycling primed in situ amplification-fluorescent in situ hybridization，簡(jiǎn)稱CPRINS-FISH）精確研究噬菌體介導(dǎo)的氨芐青霉素耐藥基因在大腸桿菌細(xì)胞間的轉(zhuǎn)移頻率，以噬菌體P1、T4、EC10等作為轉(zhuǎn)移工具直接計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示其基因轉(zhuǎn)移頻率分別為10-8～10-6、10-8、10-9～10-8;CPRINS-FISH檢測(cè)結(jié)果顯示其轉(zhuǎn)移頻率均在10-4～10-3之間;直接計(jì)數(shù)和CPRINS-FISH檢測(cè)結(jié)果均表明，超過20%的受體菌攜帶供體菌的基因并發(fā)揮一定的生理功能[34]。2010年，Kenzaka等用相同方法再次證明噬菌體在細(xì)菌基因交換中發(fā)揮著重要作用[35]。噬菌體傳遞基因給其宿主菌以利于宿主適應(yīng)不同的環(huán)境，從而促進(jìn)自己的生存和增殖。這種基因交換表明噬菌體在其宿主適應(yīng)不同環(huán)境壓力中發(fā)揮重要作用。

由噬菌體介導(dǎo)的水平轉(zhuǎn)移頻率一般在10-10～10-2之間，但轉(zhuǎn)移頻率與環(huán)境生化特征、受體菌及噬菌體本身特性相關(guān)。Mcdaniel等對(duì)沿海地域和海洋的最新研究得出了較高的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率，可達(dá)10-3～10-1[36]。

噬菌體所介導(dǎo)的耐藥基因轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在同種不同菌株之間，也可以發(fā)生在不同種細(xì)菌之間，報(bào)道最多的是大腸桿菌的不同菌株之間，以及鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）的不同菌株之間，詳見表2。Beumer等研究發(fā)現(xiàn)，在寬宿主噬菌體D3112、UT1、SN-T中均檢測(cè)到16S rRNA基因的存在，這就表明噬菌體和宿主菌存在活躍的基因交流[37]。

5 噬菌體在耐藥基因轉(zhuǎn)移中的作用展望

在不同環(huán)境的噬菌體DNA上檢測(cè)到不同抗生素耐藥基因的事實(shí)讓我們不得不思考，噬菌體在耐藥基因的起源和傳播中扮演著怎樣的角色。噬菌體DNA上攜帶耐藥基因，這就為噬菌體傳播耐藥基因提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。攜帶有耐藥基因的噬菌體隨著人類或動(dòng)物的糞便排放到環(huán)境中，生物體和環(huán)境之間定然有一個(gè)噬菌體循環(huán)，這些沒有被人發(fā)現(xiàn)的噬菌體附著在食物或存在于水體中。當(dāng)進(jìn)入腸道中遇到合適的宿主菌，噬菌體便可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)耐藥基因的轉(zhuǎn)移，獲得耐藥基因的宿主菌在抗生素選擇壓力的作用下成為優(yōu)勢(shì)種群。噬菌體在耐藥基因傳播中的作用主要建立在如下推測(cè)：首先，噬菌體DNA上檢測(cè)到不同種類的抗生素耐藥基因，可能是一個(gè)潛在的耐藥基因庫(kù);其次，相比宿主菌來說，不管溫和噬菌體或烈性噬菌體其在水環(huán)境中存活能力更強(qiáng)[46];最后，由于噬菌體的結(jié)構(gòu)優(yōu)勢(shì)，其在環(huán)境中的活力優(yōu)于游離的DNA，如線性DNA片段或質(zhì)粒[47]，因此，借助噬菌體的主動(dòng)侵染活性，應(yīng)該比轉(zhuǎn)化所介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移更具有優(yōu)越性。另一方面，由于目前報(bào)道的寬宿主噬菌體的存在，使它們?cè)诃h(huán)境中的適應(yīng)性更強(qiáng)，相比接合作用所介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移來說也有更多的機(jī)會(huì)在不同種屬細(xì)菌之間進(jìn)行基因交換。然而Enault等的研究結(jié)果[31]也值得關(guān)注，噬菌體基因組上很少攜帶耐藥基因或者所攜帶的與目前已知的耐藥基因具有相似性的片段沒有活性，那么噬菌體到底如何介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移呢？關(guān)于噬菌體在耐藥基因所有的結(jié)論似乎都太早，須要更多的研究數(shù)據(jù)來證明。

環(huán)境噬菌體宏基因組研究結(jié)果顯示，大多數(shù)噬菌體的開放閱讀框（open reading frames，簡(jiǎn)稱ORF）與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知基因序列無明顯相似性，例如，Breitbart等對(duì)海水和海底沉積物進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示，樣品中出現(xiàn)約65%的新序列[47]。Rohwer在文章中假設(shè)，若環(huán)境中有1億種噬菌體，每個(gè)噬菌體可編碼50個(gè)ORFs，其中有50%的ORFs是新序列，那么環(huán)境中的噬菌體可能包含了25億全新的ORFs，全球只有小于0.000 2%的噬菌體宏基因組已被采樣研究[48]。由此可見，我們對(duì)噬菌體基因組的了解只是冰山一角，噬菌體基因組上存在大量未知功能基因，這些片段是否與耐藥基因或耐藥基因轉(zhuǎn)移相關(guān)還須要深入研究。

目前報(bào)道的數(shù)據(jù)顯示，噬菌體很可能在抗生素耐藥基因傳播中發(fā)揮一定作用，但是與質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)元件相比其貢獻(xiàn)比例尚未明確。首先，環(huán)境中可培養(yǎng)的細(xì)菌不到1%，因此通過雙層培養(yǎng)所獲得的噬菌體數(shù)量將遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于噬菌體種類的1%;其次;目前國(guó)內(nèi)外還沒有噬菌體完整的基因信息數(shù)據(jù)庫(kù)，想要繞過培養(yǎng)障礙從基因?qū)用嫜芯渴删w和細(xì)菌的關(guān)系還存在困難;最后;噬菌體并不全是寬宿主，且難分離，這就導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室難以大規(guī)模進(jìn)行，無法積累足夠的數(shù)據(jù)證明轉(zhuǎn)導(dǎo)的直觀貢獻(xiàn)。噬菌體從發(fā)現(xiàn)至今已有百年歷史，但其生命規(guī)律及其在生態(tài)環(huán)境中的地位還未完全了解，噬菌體的研究道路還很長(zhǎng)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hvistendahl M. China takes aim at rampant antibiotic resistance[J]. Science，2012，336（6083）：795.

[2]Looft T，Johnson T A，Allen H K，et al. In-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（5）：1691-1696.

[3]Zhu Y G，Johnson T A，Su J Q，et al. Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，2013，110（9）：3435-3440.

[4]Sarmah A K，Meyer M T，Boxall A B. A global perspective on the use，sales，exposure pathways，occurrence，fate and effects of veterinary antibiotics （VAs） in the environment[J]. Chemosphere，2006，65（5）：725-759.

[5]孫 剛，袁守軍，計(jì) 峰，等. 畜禽糞便中抗生素殘留危害及其研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境與健康雜志，2009，26（3）：277-279.

[6]楊鳳霞，毛大慶，羅 義，等. 環(huán)境中抗生素抗性基因的水平傳播擴(kuò)散[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2013，24（10）：2993-3002.

[7]張 昊，王盼亮，楊清香. 畜禽糞便中多重耐藥細(xì)菌及耐藥基因研究[J/OL]. 北京：中國(guó)科技論文在線（2017-04-26）[2017-09-23]. http：//www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201704-606.

[8]Marta C L，Juan J，Maite M，et al. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of environmental samples[J]. PLoS One，2011，6（3）：e17549.

[9]Quiros P，Colomer-Lluch M，Martinez-Castillo A，et al. Antibiotic resistance genes in the bacteriophage DNA fraction of human fecal samples[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2014，58（1）：606-609.

[10]Lang A S，Zhaxybayeva O，Beatty J T. Gene transfer agents：phage-like elements of genetic exchange[J]. Nature Reviews Microbiology，2012，10（7）：472-482.

[11]Muniesa M，Imamovic L，Jofre J. Bacteriophages and genetic mobilization in sewage and faecally polluted environments[J]. Microbial Biotechnology，2011，4（6）：725-734.

[12]Parsley L C，Consuegra E J，Kakirde K S，et al. Identification of diverse antimicrobial resistance determinants carried on bacterial，plasmid，or viral metagenomes from an activated sludge microbial assemblage[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（11）：3753-3757.

[13]Breitbart M，Thompson L R，Suttle C A，et al. Exploring the vast diversity of Marine viruses[J]. Oceanography，2007，20（2）：135-139.

[14]Fuhrman J A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects[J]. Nature，1999，399（6736）：541-548.

[15]Letarov A，Kulikov E. The bacteriophages in human-and animal body-associated microbial communities[J]. Journal of Applied Microbiology，2009，107（1）：1-13.

[16]Liu B，Zhou F F，Wu S J，et al. Genomic and proteomic characterization of a thermophilic Geobacillus bacteriophage GBSV1[J]. Research in Microbiology，2009，160（2）：166-171.

[17]Rodriguez-Valera F，Martin-Cuadrado A-，Pasic L，et al. OPINION explaining microbial population genomics through phage predation[J]. Nature Reviews Microbiology，2009，7（11）：828-836.

[18]Hao X D，Wang Q L，Cao Y L，et al. Evaluating sludge minimization caused by predation and viral infection based on the extended activated sludge model No. 2d[J]. Water Research，2011，45（16）：5130-5140.

[19]Khan M A，Satoh H，Katayama H，et al. Bacteriophages isolated from activated sludge processes and their polyvalency[J]. Water Research，2002，36（13）：3364-3370.

[20]Brussow H，Canchaya C，Hardt W D. Phages and the evolution of bacterial pathogens：from genomic rearrangements to lysogenic conversion[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2004，68（3）：560-602.

[21]Colomer-Lluch M，Calero-Cáceres W，Jebri S，et al. Antibiotic resistance genes in bacterial and bacteriophage fractions of Tunisian and Spanish wastewaters as markers to compare the antibiotic resistance patterns in each population[J]. Environment International，2014，73：167-175.

[22]Colomer-Lluch M，Jofre J，Muniesa M. Quinolone resistance genes （qnrA and qnrS） in bacteriophage particles from wastewater samples and the effect of inducing agents on packaged antibiotic resistance genes[J]. Journal of Antimicrobial Chemotherapy，2014，69（5）：1265-1274.

[23]Marti E，Variatza E，Balcazar J L. Bacteriophages as a reservoir of extended-spectrum β-lactamase and fluoroquinolone resistance genes in the environment[J]. Clinical Microbiology and Infection，2014，20（7）：O456-O459.

[24]Colomer-Lluch M，Imamovic L，Jofre J，et al. Bacteriophages carrying antibiotic resistance genes in fecal waste from cattle，pigs，and poultry[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2011，55（10）：4908-4911.

[25]Calero-Cáceres W，Muniesa M. Persistence of naturally occurring antibiotic resistance genes in the bacteria and bacteriophage fractions of wastewater[J]. Water Research，2016，95：11-18.

[26]Calero-Caceres W，Melgarejo A，Colomer-Lluch M A，et al. Sludge as a potential important source of antibiotic resistance genes in both the bacterial and bacteriophage fractions[J]. Environmental Science and Technology，2014，48（13）：7602-7611.

[27]Ross J，Topp E. Abundance of antibiotic resistance genes in bacteriophage following soil fertilization with dairy manure or municipal biosolids，and evidence for potential transduction[J]. Applied and Environmental Microbiology，2015，81（22）：7905-7913.

[28]Minot S，Sinha R，Chen J，et al.The human gut virome：inter-individual variation and dynamic response to diet[J]. Genome Research，2011，21（10）：1616-1625.

[29]Liu B，Pop M. ARDB—Antibiotic resistance genes database[J]. Nucleic Acids Research，2009，37（S1）：D443-D447.

[30]Modi S R，Lee H H，Spina C S，et al. Antibiotic treatment expands the resistance reservoir and ecological network of the phage metagenome[J]. Nature，2013，499（7457）：219.

[31]Enault F，Briet A，Bouteille L，et al. Phages rarely encode antibiotic resistance genes：a cautionary tale for virome analyses[J]. ISME Journal，2017，11（1）：237-247.

[32]Fard R，Barton M D，Heuzenroeder M W. Bacteriophage-mediated transduction of antibiotic resistance in enterococci[J]. Letters in Applied Microbiology，2011，52（6）：559-564.

[33]Haase A T，Retzel E F，Staskus K A . Amplification and detection of lentiviral DNA inside cells[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，1990，87（13）：4971-4975.

[34]Kenzaka T，Tani K，Sakotani A，et al. High-frequency phage-mediated gene transfer among Escherichia coli cells，determined at the single-cell level[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（10）：3291-3299.

[35]Kenzaka T，Tani K，Nasu M. High-frequency phage-mediated gene transfer in freshwater environments determined at single-cell level[J]. The ISME Journal，2010，4（5）：648-659.

[36]McDaniel L D，Young E，Delaney J，et al. High frequency of horizontal gene transfer in the oceans[J]. Science，2010，330（6000）：50.

[37]Beumer A，Robinson J B. A broad-host-range，generalized transducing phage （SN-T） acquires 16S rRNA genes from different genera of bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology，2005，71（12）：8301-8304.

[38]Schmieger H，Schicklmaier P. Transduction of multiple drug resistance of Salmonella enterica serovar typhimurium DT104[J]. FEMS Microbiology Letters，1999，170（1）：251-256.

[39]Taniashin V I，Zimin A A，Shliapnikov M G，et al.Transduction of plasmid antibiotic resistance determinants with pseudo-T-even bacteriophages[J]. Genetika，2003，39（7）：914-926.

[40]Kenzaka T，Tani K，Sakotani A，et al. High-frequency phage-mediated gene transfer among Escherichia coli cells，determined at the single-cell level[J]. Applied and Environmental Microbiology，2007，73（10）：3291-3299.

[41]Zhang Y F，Lejeune J T. Transduction of blaCMY-2，tet（A），and tet（B） from Salmonella enterica subspecies enterica serovar Heidelberg to S. typhimurium[J]. Veterinary Microbiology，2008，129（3/4）：418-425.

[42]Battaglioli E J，Baisa G A，Weeks A E，et al. Isolation of generalized transducing bacteriophages for uropathogenic strains of Escherichia coli[J]. Applied and Environmental Microbiology，2011，77（18）：6630-6635.

[43]Marinus M G，Poteete A R. High efficiency generalized transduction in Escherichia coli O157：H7[J]. F1000 Research，2013，2（7）：1-7.

[44]Bearson B L，Allen H K，Brunelle B W，et al. The agricultural antibiotic carbadox induces phage-mediated gene transfer in Salmonella[J]. Frontiers in Microbiology，2014，5（52）：1-8.

[45]Bearson B L，Brunelle B W. Fluoroquinolone induction of phage-mediated gene transfer in multidrug-resistant Salmonella[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2015，46（2）：201-204.

[46]Duran A E，Muniesa M，Mendez X，et al. Removal and inactivation of indicator bacteriophages in fresh waters[J]. Journal of Applied Microbiology，2002，92（2）：338-347.

[47]Breitbart M，Salamon P，Andresen B，et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2002，99（22）：14250-14255.

[48]Rohwer F. Global phage diversity[J]. Cell，2003，113（2）：141.陳 園，趙淑娟. 微生物莽草酸代謝途徑的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（7）：19-23.