豬偽狂犬病毒實時熒光定量PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

溫書香 安利民 趙協(xié)

摘要：為建立一種快速、特異、鑒別診斷豬偽狂犬病毒野毒感染與疫苗免疫株，參考GenBank上公布的豬偽狂犬病毒gE基因序列設(shè)計了1對引物，以豬偽狂犬病毒核酸作為模板，PCR方法將擴(kuò)增得到的核酸序列克隆到PEGM-18T載體上，將克隆載體轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，測序鑒定陽性重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品建立豬偽狂犬病毒熒光定量PCR檢測方法。結(jié)果表明，本研究所建立的豬偽狂犬病毒熒光定量PCR方法檢測靈敏度可達(dá)10拷貝，與藍(lán)耳病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和可重復(fù)性。此外，對33份疑似豬偽狂犬病料也作了檢測，結(jié)果表明，2份病料均為陽性。本研究建立的豬偽狂犬病毒實時熒光定量PCR檢測方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、不發(fā)生交叉反應(yīng)等優(yōu)點，可用于日常豬偽狂犬病毒野毒感染與疫苗免疫株的鑒別診斷。

關(guān)鍵詞：豬偽狂犬病毒;熒光定量PCR技術(shù);靈敏度;標(biāo)準(zhǔn)曲線

中圖分類號： S858.285.3 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0050-04

豬偽狂犬?。≒RV）是由稱豬皰疹病毒感染引起的一種高度接觸性、傳染性疾病。豬是本病的傳染源及自然宿主，本病的暴發(fā)?？梢鹑焉锬肛i的流產(chǎn)率增高、仔豬的神經(jīng)癥狀、公豬因睪丸炎喪失種用價值以及成年豬的呼吸系統(tǒng)疾病，每年給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。任何年齡段的豬感染PRV后均能形成潛伏感染，感染PRV的豬終身帶毒。在一定條件下PRV病毒可以被激活，引起隱性豬的復(fù)發(fā)性感染和散毒。因此，及時地診斷PRV是預(yù)防和控制該病的有效手段。在病原學(xué)診斷方法中，熒光定量PCR方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速高通量等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于多種動物疫病的診斷[4]。本研究根據(jù)PRV病毒核酸設(shè)計了1對特異性引物，建立了一種快速鑒別診斷PRV病毒的熒光定量PCR方法，為河南省漯河市豬偽狂犬病的早期鑒別診斷和病毒分離提供了一種快速檢測和定性的方法，為后續(xù)豬偽狂犬病的凈化提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料采集 漯河市問十鄉(xiāng)一散養(yǎng)戶母豬存欄量24頭，其中初產(chǎn)母豬8頭，經(jīng)產(chǎn)母豬16頭。2016年11月15日夜里該養(yǎng)豬場1頭經(jīng)產(chǎn)母豬產(chǎn)仔15頭，2 d晚上有4頭仔豬表現(xiàn)體溫升高、食欲不振、精神萎靡、站立不穩(wěn)等癥狀，3 d早上有5頭仔豬相繼死亡，另有5頭仔豬相繼發(fā)病并出現(xiàn)相似的臨床癥狀，1頭仔豬表現(xiàn)為典型的豬偽狂犬病臨床癥狀，犬臥姿勢、原地轉(zhuǎn)圈運動、叫聲嘶啞，隨后體溫下降很快死亡。根據(jù)臨床癥狀和剖檢結(jié)果判定為疑似豬偽狂犬病，對發(fā)病和死亡的仔豬進(jìn)行無菌采血，并采集心臟、肝臟、腎臟、腦、脾臟等組織進(jìn)行充分研磨，用于PRV病毒的鑒定。

1.1.2 毒株、試劑及儀器設(shè)備 本研究所用豬偽狂犬病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，由河南省疫控中心贈送;豬偽狂犬病毒gE、gB抗體檢測試劑盒，購于美國IDEX公司;豬偽狂犬病毒gE基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測試劑盒，購自上海之江生物科技股份有限公司;SYBR Green熒光染料、PMD-18T載體、DH5α，均購自TaKaRa;2×Taq Mix、質(zhì)粒提取試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司，14 mL搖菌管，購自美國BD公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 酶標(biāo)儀購自美國寶特公司，超低溫冰箱購自中科美菱，電熱恒溫水浴鍋購自上海樹立儀器儀表公司，PCR儀、電泳儀均購自美國伯樂，熒光定量PCR儀購自美國熱電公司，凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Protein Simple公司，臺式高速冷凍離心機(jī)購自德國艾本德股份公司（Eppendorf AG），掌上離心機(jī)購自美國賽洛捷克，生物安全柜購自上海力申。

1.1.4 引物設(shè)計及合成 從NCBI上下載7個豬偽狂犬病毒保守基因gE基因核酸序列，用DNAMAN軟件將以上7種序列進(jìn)行比對，尋找突變率較低的區(qū)域用Primer 3在線軟件進(jìn)行引物設(shè)計，用Oligo 6對設(shè)計的多對引物進(jìn)行評價，最終選擇1對最優(yōu)的引物作為本次熒光定量PCR方法建立所用引物（表1）。

1.2 方法

1.2.1 PRV gE抗體檢測結(jié)果的判定 將無菌采集的6份豬血清用PRV gE/gB抗體檢測試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果判定依據(jù)試劑盒說明書：S/N值≤0.5判為抗體陽性;0.5 1.2.2 PMD-gE質(zhì)粒的構(gòu)建 以PRV全毒為模板，采用“1.1.5”節(jié)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min預(yù)變性;95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，30個循環(huán);最后72 ℃ 延伸 10 min。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳和切膠回收，將回收產(chǎn)物與PMD18-T載體連接2 h并全部轉(zhuǎn)入DH5α細(xì)胞中，加入無氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基，180 r/min搖菌1 h，取100 μL涂布到含有氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃溫箱過夜，挑取陽性單克隆菌落用PCR方法鑒定，并將鑒定為陽性的質(zhì)粒送測序。將測序正確的質(zhì)粒作為熒光定量PCR的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，用Nanodrop測定質(zhì)粒濃度并計算拷貝數(shù)，拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度×6.02×1023/（660×質(zhì)粒總長度）。

1.2.3 熒光定量PCR方法的建立和條件的優(yōu)化 熒光定量PCR反應(yīng)體系的組成：2×Mix 12.5 μL，PRV上下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，無菌蒸餾水6.5 μL，DNA 2.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min預(yù)變性;95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，30個循環(huán);最后72 ℃ 總延伸10 min。根據(jù)以上反應(yīng)條件，以PRV病毒株為模板，分別對引物濃度范圍（2.5～15.0 μmol/L）和退火溫度（52～60 ℃）進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將構(gòu)建的PRV陽性質(zhì)粒用無菌蒸餾水先稀釋至1×108，再10倍系列稀釋7個梯度，并且以每個稀釋度的稀釋液為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件按照優(yōu)化好的條件進(jìn)行。

1.2.5 熒光定量PCR特異性檢測 將筆者所在實驗室購買的豬瘟、豬藍(lán)耳、豬圓環(huán)、口蹄疫病毒核酸連同豬偽狂犬病毒核酸，采用本研究所建立的診斷方法一同檢測，以驗證該方法的特異性。

1.2.6 重復(fù)性試驗 分別取1×106、1×104、1×102拷貝/μL 質(zhì)粒進(jìn)行3次批內(nèi)和批間的重復(fù)試驗，計算本方法的變異系數(shù)，判定本檢測方法是否可重復(fù)。

1.2.7 臨床樣本的檢測 采用本研究所建立的PRV熒光定量PCR方法對6份豬偽狂犬病疑似病例進(jìn)行檢測，所得結(jié)果與PRV檢測試劑盒進(jìn)行對比，判定該方法是否能夠用于臨床樣本的檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRV gE/gB抗體檢測結(jié)果

本試驗將采集的6份仔豬血清做豬偽狂犬病毒抗體水平檢測，檢測結(jié)果見表2。由表2可知，發(fā)病豬場仔豬豬偽狂犬病gB抗體陽性數(shù)為0，gE抗體陽性數(shù)為6個。

2.2 引物擴(kuò)增結(jié)果

使用設(shè)計好的引物，以PRV全病毒進(jìn)行擴(kuò)增，獲得約 200 bp 的核酸條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符合。

2.3 PMD18-T-gE陽性克隆的鑒定

用設(shè)計的引物對克隆的載體進(jìn)行陽性鑒定，結(jié)果見圖2。由圖2可知，該引物成功克隆出約200 bp條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。將PCR鑒定陽性的樣品進(jìn)行測序，測序結(jié)果正確。

2.4 熒光定量PCR反應(yīng)條件的確定

為選擇最優(yōu)的熒光定量PCR反應(yīng)條件，本研究同時設(shè)立在不同引物濃度和退火溫度的條件下進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)引物濃度為0.02 μmol/L、退火溫度為58 ℃時，電泳核酸條帶豐度最好，無非特異擴(kuò)增。

2.5 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用含有目的片段質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 109 拷貝/μL 的質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋8個梯度，每個稀釋度的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。由圖4、圖5可知，每個稀釋度的擴(kuò)增曲線之間的距離均勻，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為3.42，R2值為0.998，擴(kuò)增效率為102.426，每個稀釋度的3個重復(fù)之間的標(biāo)準(zhǔn)差為0.243，說明定量結(jié)果精密度高、重復(fù)性好，本研究所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)優(yōu)越于標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，可用于豬偽狂犬病的定量檢測。

2.6 熒光定量PCR方法的特異性和準(zhǔn)確性

本研究將豬瘟、豬藍(lán)耳、豬圓環(huán)、口蹄疫和豬偽狂犬病毒核酸作為模板進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，除了豬偽狂犬病毒外，其余病毒的擴(kuò)增曲線均為直線且在基線以下，豬偽狂犬病毒的擴(kuò)增曲線為典型的S形（圖6、圖7）。說明本研究所建立的熒光PCR檢測方法具有良好的特異性和準(zhǔn)確性。

2.7 熒光PCR檢測方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性

分別抽取1×106、1×104、1×102拷貝/μL質(zhì)粒進(jìn)行3次批內(nèi)和批間的重復(fù)試驗，由表3可知，每個梯度的最終實測值數(shù)量級不變，常數(shù)在0.99～1.01之間，對應(yīng)的CTsd值和變異系數(shù)見表3，同一批次3個濃度梯度3次重復(fù)試驗的CT值變異系數(shù)<5%，說明本研究所建立的熒光PCR檢測方法重復(fù)性好、穩(wěn)定性高。

2.8 熒光PCR檢測方法的靈敏度

由圖8可知，擴(kuò)增曲線各個稀釋度間距均勻，線性范圍在100～109 拷貝/μL，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.243，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.998，擴(kuò)增效率為102.426，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度達(dá)到1×101 拷貝/μL時認(rèn)可以看到明顯的擴(kuò)增曲線，對應(yīng)的CT為2.46個，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度達(dá)到1×100 拷貝/μL 時，仍有擴(kuò)增曲線，CT為35.43個，拷貝數(shù)為2.158拷貝，已超出可信范圍，所以本研究所建立的熒光PCR檢測方法最低檢測范圍為10拷貝/μL。

2.9 熒光PCR檢測方法的應(yīng)用

本研究用所建立的熒光PCR檢測方法對將從門診和豬場采集的35份疑似豬偽狂犬病病料進(jìn)行檢測。其中標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線的斜率為-3.18，R2為0.996，擴(kuò)增效率為101.273。對檢測結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，有2份樣品的CT和拷貝數(shù)均在檢測限內(nèi)，判定為陽性，其他33份樣品的CT超出檢測限，或者拷貝數(shù)小于10拷貝，或者兩者均在檢測限外，判定為陰性。與此同時，筆者用上海之江和洛陽萊普生公司生產(chǎn)的試劑盒作對比，發(fā)現(xiàn)三者之間的符合率達(dá)到100%。3 討論與結(jié)論

實時熒光定量PCR技術(shù)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、反應(yīng)時間短、定量準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，它克服傳統(tǒng)PCR假陽性高和定量不準(zhǔn)確等缺點，已成為病原學(xué)檢測中重要的方法[5-6]。本研究所建立的熒光PCR檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)對豬偽狂犬病毒的定量檢測。相關(guān)研究表明，熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物多在100～200 bp，一般不超過300 bp[7]，本研究設(shè)計的引物擴(kuò)增片段大小為165 bp，擴(kuò)增片段適中，有利于提高該檢測方法的效率。本研究所建立的熒光PCR方法以構(gòu)建的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，每個梯度間的間距均勻，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值均在0.99以上，擴(kuò)增效率在90%～110%之間，說明所測結(jié)果的準(zhǔn)確性較高。此外，對建立的熒光檢測方法進(jìn)行靈敏性、特異性和重復(fù)性試驗，結(jié)果顯示，本研究建立的檢測方法靈敏度可以達(dá)到10拷貝/μL;對豬瘟、豬藍(lán)耳、豬圓環(huán)、口蹄疫等病毒均無交叉反應(yīng)現(xiàn)象，充分證明了該檢測方法具有良好的特異性;不同稀釋度的模板進(jìn)行批內(nèi)和批間試驗，其CT值變異系數(shù)均不超過5%，說明其重復(fù)性比較好。用本研究建立的熒光PCR檢測方法和購買的2個商家試劑盒對臨床35份樣本同時進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)3種檢測結(jié)果的符合率為100%。本研究所建立的豬偽狂犬病熒光定量PCR方法為規(guī)模化豬場豬偽狂犬病的快速檢測奠定了基礎(chǔ)，為筆者所在實驗室病原學(xué)檢測標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了參考依據(jù)。

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