翹嘴鲌精子生理特性及超低溫冷凍的研究

程順 顧志敏 劉士力

摘要：采用試驗生態(tài)——顯微觀察方法對翹嘴鲌精子的生理特性進行了研究，并用兩步降溫法超低溫冷凍保存翹嘴鲌精子，篩選出適宜的稀釋液與抗凍劑配方。結(jié)果表明，翹嘴鲌適宜的鹽度范圍為0～0.4%，pH值為5.5～8.0時，精子激活率較高，其中pH值為5.5時，精子運動時間與壽命最長;翹嘴鲌精子在4 ℃條件下保存84 h仍有48.33%的激活率，在25 ℃條件下保存84 h時精子死亡。以D-15為稀釋液、10%乙二醇（EG）為抗凍劑，采用兩步降溫法超低溫冷凍保存翹嘴鲌精子，解凍后精子活力最高。

關(guān)鍵詞：翹嘴鲌;精子;生理特性;超低溫冷凍;激活率

中圖分類號： S961.2 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0175-04

翹嘴鲌屬鯉科鲌亞科，為我國重要淡水名優(yōu)經(jīng)濟魚類。由于近親繁殖、環(huán)境污染等原因，養(yǎng)殖翹嘴鲌的性狀已出現(xiàn)不同程度的衰退。鑒于此，相關(guān)學者已對翹嘴鲌的耗氧率和窒息點[1]、生長特征[2-3]、個體生殖力[4]及營養(yǎng)需求[5-6]等進行研究，但關(guān)于翹嘴鲌精子生理特性及精子的超低溫冷凍保存方面的研究尚未見報道。隨著翹嘴鲌養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，精子生物學特性的研究顯得尤為重要，將有助于加速其育種進程和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。與此同時，翹嘴鲌的遺傳育種與優(yōu)良種質(zhì)資源的保存日益引起人們的重視，開展翹嘴鲌的精子冷凍保存研究，探索并改進保存方法，是其種質(zhì)資源保護的有效途徑之一，也能為翹嘴鲌遺傳育種的研究提供優(yōu)良種質(zhì)材料。在鲌亞科魚類中，此方面的研究未能引起足夠重視，僅有對黑尾近紅鲌（Ancherythroculter nigrocauda）精子的相關(guān)研究，王貴英等以精子活力為指標，進行了黑尾近紅鲌精子低溫保存方法的研究，認為黑尾近紅鲌精子最適的保存液配方為葡萄糖 2.90 g、KCl 0.05 g、CaCl2 0.02 g、NaHCO3 0.21 g、蒸餾水 100 mL、青霉素2.0×104 IU/mL，此配方可以使精子在4 ℃條件下保存156 h后活力仍達80%;并對黑尾近紅鲌精子在不同鹽度、不同水體及不同離體時間情況下的活力進行研究，篩選出黑尾近紅鲌精子的最適鹽度為0.5%，蒸餾水作為激活液好于自來水和池塘水，采用蒸餾水激活離體精子1～15 h發(fā)現(xiàn)，隨著時間的延長，精子快速運動時間無顯著差異，而精子成活率顯著降低，但這些試驗均未涉及超低溫冷凍保存方面[7-8]。在鯉科魚類中，此方面的研究工作較多，除了有精子的生理特性[9]、超微結(jié)構(gòu)觀察[10]等方面的研究，也有關(guān)于精子超低溫冷凍保存方面的探索。陳松林等以D-15為稀釋液、8%～12%的二甲基亞砜為抗凍劑，超低溫冷凍保存草魚（Ctenopharyngodon idellus）、鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）、鯉魚（Cyprinus carpio）和團頭魴（Megalobrama amblycephala）的精子，獲得的冷凍精子的活力分別為75%、75%、65%和65%[11]。丁淑燕等則選用Ringer液為稀釋液、8%二甲基亞砜為抗凍劑，超低溫冷凍興國紅鯉（Cyprinus carpio var. singuonesis）的精子，解凍激活后精子的活力達到了接近鮮精的水平[12]。

本研究以浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合試驗基地養(yǎng)殖的翹嘴鲌精子為試驗材料，探討不同鹽度范圍、不同pH值范圍、不同保存溫度及保存時間對翹嘴鲌精子活力的影響，旨在為其科學研究和生產(chǎn)實踐提供基礎數(shù)據(jù)。并以0.25 mL麥細管為凍存管、兩步降溫法研究了稀釋液種類、抗凍劑種類與濃度對翹嘴鲌精子超低溫冷凍保存效果的影響，旨在為翹嘴鲌精子超低溫凍存技術(shù)的改進提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

翹嘴鲌取自浙江省淡水水產(chǎn)研究所綜合試驗基地，于2017年6月在此基地進行試驗，挑選健康狀況良好、體表無傷、無病且性成熟的雄魚作為試驗材料。

1.2 激活液配制

（1）不同鹽度溶液的配制。用純水配制鹽度分別為0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%的NaCl溶液;（2）不同pH值溶液的配制。用NaOH或HCl調(diào)節(jié)純水的pH值，分別配制pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的溶液。

1.3 稀釋液配制

（1）CCSE2。用電子天平稱取NaCl 0.342 7 g、蔗糖 3.431 4 g 溶于100 mL純水。（2）D-15。用電子天平稱取NaCl 0.80 g、KCl 0.05 g、葡萄糖1.50 g溶于100 mL純水。（3）魚用任氏液。用電子天平稱取NaCl 0.780 g、CaCl2 0.021 g、KCl 0.02 g、NaHCO3 0.20 g溶于100 mL純水。（4）Hanks液。用電子天平稱取NaCl 0.801 g、KCl 0.04 g、CaCl2 0.014 g、NaHCO3 0.035 g、KH2PO4 0.006 g、葡萄糖0.034 g溶于100 mL純水。（5）HBSS。用電子天平稱取NaCl 0.789 6 g、KCl 0.039 6 g、MgSO4·7H2O 0.0 195 g、Na2HPO4·12H2O 0.007 2 g、KH2PO4 0.005 4 g、NaHCO3 0.034 5 g、葡萄糖 0.099 0 g 溶于100 mL純水。以上5種稀釋液保存于 4 ℃ 冰箱中待用。

1.4 抗凍液（稀釋液+抗凍劑）配制

選取甲醇、乙二醇、二甲基亞砜和甘油4種抗凍劑，濃度梯度分別為5%、10%、15%，與5種稀釋液混合共形成60組抗凍液配方。以上60種抗凍液保存于4 ℃冰箱中待用。

1.5 方法

1.5.1 精液采集 采精前10 h對雄魚注射絨毛膜促性腺激素（HCG）和促黃體釋放激素（LRH-A2），以促進其精子成熟。采集精子時用干毛巾擦干魚腹部體表，輕壓魚腹使精液流出于離心管中，精子與抗凍液的比例為1 ∶ 5，4 ℃低溫保存。

1.5.2 精子活力的檢測 精液與激活液混合后在顯微鏡下觀察精子活力（激活率、活動時間和壽命）。激活率是指精子與激活溶液混合后立即于顯微鏡下觀察同一視野中運動精子的數(shù)量占全部精子數(shù)量的比例;運動時間是指精子自被激活開始至90%原地顫動為止的時間;壽命是指精子自被激活開始至90%停止運動所經(jīng)歷的時間。試驗重復3次。

1.5.3 不同激活液對精子活力的影響 用移液槍吸取微量精液于事先滴加激活液的離心管中，迅速將其攪勻后滴加于載玻片上，在光鏡下觀測精子的激活率;離心管保存于4 ℃環(huán)境下，每隔一定時間滴加于載玻片上，在光鏡下觀測精子的運動時間及壽命。

1.5.4 不同抗凍液對精子冷凍保存的影響 將精液與抗凍液按1 ∶ 5比例混勻，于4 ℃下平衡5～10 min后分裝入體積為0.25 mL的麥細管中（每支裝約0.2 mL），將盛精麥細管平放于自制簡易降溫裝置的液氮面上方3～4 cm處3～5 min后迅速轉(zhuǎn)入液氮中保存。解凍時將麥細管從液氮中快速取出，立即置于40 ℃水浴中搖動溶化。用純水激活后，在顯微鏡下檢測凍精活力。試驗重復3次。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)分析采用SPSS完成，統(tǒng)計結(jié)果以“平均值±標準差”（x±s）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度對翹嘴鲌精子活力的影響

鹽度為0～0.4%時，精子活力較高。精子激活率均在89%以上，其中在鹽度為0.3%時達到最高值（91.33%）;精子激活后運動時間與壽命則區(qū)別明顯，鹽度為0.3%時明顯比其他鹽度的精子運動時間（198.00 s）與壽命（353.67 s）更長。鹽度為0.5%時，精子活力開始受明顯到抑制;鹽度為0.7%時，精子呈不活動狀態(tài)，并失去運動能力，但是用吸管繼續(xù)向溶液中加1滴淡水后精子可被激活（圖1、圖2）。因此適宜翹嘴鲌精子的鹽度范圍為0～0.4%，其中最適鹽度為0.3%。

2.2 pH值對翹嘴鲌精子活力的影響

pH值為4.5～10.0時，翹嘴鲌精子可被激活，但在pH值為4.5～5.5及9.0～10.0時，精子激活后的活力較低。pH值為5.5～8.0時，精子激活率較高，均超過88%，最高峰出現(xiàn)在pH值為7時，達到90.33%;pH值為5.5時，精子激活后的運動時間和壽命最長，明顯超過其他pH組，達到 259.67 s 和400.33 s，之后隨著pH值升高，精子激活后的運動時間和壽命逐漸下降（圖3、圖4）。

2.3 精子在不同保存時間與保存溫度下的活力變化

翹嘴鲌精子活力隨保存時間的延長而下降。在4 ℃條件下，精子在0～8 h中運動時間與壽命下降明顯，從0 h的運動時間、壽命120.67、331.67 s急速下降至8 h的54.33、119.33 s，之后降速減緩，至84 h運動時間與壽命為8.33、14.67 s;激活率則始終緩慢下降，在44 h內(nèi)激活率仍能保持70%以上，84 h的激活率為48.33%。在25 ℃條件下，精子在0～8 h 中運動時間與壽命下降明顯，至8 h下降為49.33、89.33 s，之后降速減緩，至84 h精子死亡;激活率則始終逐步下降，在44 h內(nèi)激活率仍能保持70%以上，至50 h活力下降相對明顯，84 h死亡（圖5、圖6）。

2.4 翹嘴鲌精子超低溫保存

將5種稀釋液（CCSE2、D-15、魚用任氏液、Hanks液及HBSS）與4種抗凍劑（甲醇、乙二醇、二甲基亞砜及甘油）的3種濃度（5%、10%、15%）兩兩混合，配制成60種不同的抗凍液，研究其對翹嘴鲌精子超低溫冷凍的影響。結(jié)果表明，當抗凍劑為10%乙二醇時，凍精活力比其他抗凍劑組分高（圖7、圖8）;當稀釋液為D-15時，凍精的活力比其他稀釋液組分高。當抗凍劑為10%乙二醇時，以D-15為稀釋液的凍精活力最高（圖9、圖10）;當稀釋液為D-15時，以10%乙二醇為抗凍劑凍精活力最高（圖7、圖8）。因此，適宜翹嘴鲌精子冷凍保存的抗凍劑為10%乙二醇、稀釋液為D-15，凍精激活率、運動時間和壽命分別為62.67%、63.33 min和 83.67 min。

3 討論與結(jié)論

黃辨非等觀察了興國紅鯉精子在鹽度為0～5%的溶液中的運動情況，結(jié)果表明在鹽度0.5%的溶液中，精子的快速運動時間和壽命最長;隨后受到抑制，至鹽度為1%時，精子完全不動[9]。王貴英等進行的黑尾近紅鲌精子活力研究的結(jié)果也顯示，在鹽度0～0.5%范圍內(nèi)，精子活力隨鹽度的增加而延長，鹽度0.5%時，活力最佳;而鹽度>0.5%時，精子活力受到抑制;在鹽度0.9%以上時則完全不動[8]。本研究中翹嘴鲌精子在不同鹽度范圍內(nèi)的活力變化曲線與興國紅鯉、黑尾近紅鲌基本一致，首先隨著鹽度的增加，活力逐漸加強，至最適鹽度后，精子活力開始受到抑制。不同的地方是翹嘴鲌精子最適鹽度為0.3%和鹽度為0.5%時，活力開始受到抑制，鹽度為0.7%時精子呈不活動狀態(tài)。造成這些差異的原因，主要與不同魚類精液的生理特性不同有關(guān)，雖然翹嘴鲌與黑尾近紅鲌同為鲌亞科，與興國紅鯉同為鯉科，但翹嘴鲌體內(nèi)精子的滲透壓環(huán)境可能與其他鯉科魚類略有不同，造成適鹽范圍不同。pH值是影響鯉科魚類精子活力的重要參數(shù)[13]。翹嘴鲌精子在pH值為4.5～10.0范圍內(nèi)可被激活，激活率峰值出現(xiàn)在pH值為7.0時，運動時間和壽命峰值出現(xiàn)在pH值為5.5時。在鯉科魚類中，精子激活率可能在一個較寬的pH值范圍內(nèi)影響不大，但運動能力最強的點一般出現(xiàn)于某個pH值[14]。在本研究中，pH值為5.5～8.0時，翹嘴鲌精子激活率均較高，此范圍內(nèi)激活率差異不大，而運動時間和壽命最長的pH值為5.5，明顯高于其他pH值組。翹嘴鲌精子在pH值為5.5時表現(xiàn)出最長的運動時間和壽命，可能是由于當精子處于弱酸性環(huán)境中時，自身活動會被一定程度地抑制，從而減少運動消耗，有利于運動時間與壽命的延長，且pH值為5.5時對激活率的抑制效果不明顯，精子仍能正常運動。溫度對魚類精子的活力具有重要影響，高溫條件下精子運動能力較強，而低溫條件下精子運動能力減弱、消耗的ATP減少。本研究結(jié)果表明，翹嘴鲌精子在 4 ℃ 下保存的效果明顯比在25 ℃好，因此在低溫條件下，精子的保存時間可以延長。另外，精子在保存前期，運動時間和壽命快速下降，而激活率則緩慢下降，說明精子離體后，與活力相關(guān)的指標中，激活率起初能保持一段時間的相對穩(wěn)定，而運動時間和壽命會快速降低，提示在人工授精時，精子被擠出后要盡快受精或在特定稀釋液中低溫保存，以免精子的運動時間和壽命下降至精卵不能及時相遇。本試驗顯示，繁殖過程中擠出的精液在未進行人工授精時，可以通過鹽度為0.7%或以上的溶液稀釋置于4 ℃條件下低溫保存;進行人工授精時，可采用鹽度為0.5%或pH值為5.5的溶液稀釋精液，在時間上為精卵相遇提供更多的機會，以利于受精率的提高。

魚類精子超低溫凍存的抗凍液由稀釋液及抗凍劑兩部分組成。翹嘴鲌精子超低溫冷凍的結(jié)果表明，當稀釋液為 D-15、抗凍劑為10%乙二醇時，凍精活力最高。D-15作為稀釋液最初即應用到了鯉科魚類精子冷凍的研究中，陳松林等對我國主要淡水鯉科養(yǎng)殖魚類草魚、鰱魚、鯉魚和團頭魴等精子的超低溫冷凍保存試驗中研制出了理想的稀釋液配方 D-15，并以8%～12%二甲基亞砜為抗凍劑，獲得冷凍精子 65%～75% 的激活率[11]。此后，D-15作為稀釋液普遍應用在了鯉科魚類精子的超低溫冷凍研究中[15-16]。不同魚類精子超低溫冷凍保存時所需的適宜抗凍劑的種類及濃度也有所差異。王曉愛等采用稀釋液D-15，篩選出了適合軟鰭新光唇魚（Neolissochilus benasi）精子超低溫冷凍保存的2種抗凍劑為10%甲醇和15%乙二醇[15]。王曉愛等以D-15溶液為稀釋液，檢測二甲基亞砜、甘油、乙二醇和甲醇對暗色唇魚（Semilabeo obscurus）精子超低溫冷凍保存效果的影響，認為二甲基亞砜和甘油并不適合作為暗色唇魚精子冷凍的抗凍劑，甲醇和乙二醇具有相似的保護作用，適宜暗色唇魚精子冷凍保存，并推測甲醇和乙二醇在暗色唇魚精子冷凍復蘇過程中對細胞膜起到了良好的保護作用[16]。在非鯉科魚類精子冷凍中，也有EG作為抗凍劑效果較好的案例，孟令寀等以HBSS為稀釋液，將二甲基亞砜、丙二醇、甘油、甲醇、乙二醇稀釋成10%、20%、30%，對大瀧六線魚（Hexagrammos otakii）的精子進行超低溫冷凍試驗，結(jié)果表明，乙二醇各組的精子活力都較高，其中20%乙二醇組的抗凍保護效果最好[17]。但也有許多研究認為，二甲基亞砜與甲醇對鯉科魚類精子抗凍保護效果較好[18]。Lahnsteiner等在對9種鯉科魚類精子冷凍保存的研究中發(fā)現(xiàn)，二甲基亞砜表現(xiàn)出更好的抗凍保護效果。Chew等在對穗須原鯉（Probarbus jullieni）精子超低溫冷凍的研究中發(fā)現(xiàn)，乙二醇不適宜穗須原鯉的精子保存，最適抗凍劑為甲醇[19]。Dietrich等以Volckaerts液為稀釋液、10%二甲基亞砜或10%甲醇為抗凍劑，對湖鯽（Eupallasella percnurus）精子進行超低溫冷凍試驗，得到了50%的凍精復活率[20]。可見，由于種的特異性，精子超低溫凍存中適宜的抗凍劑不同。不同抗凍劑對不同物種細胞的通透性存在差異，一般認為采用對精子細胞滲透性大的抗凍劑可以獲得較高的精子冷凍復活率[21]。根據(jù)本研究的結(jié)果推測，造成10%乙二醇成為最優(yōu)抗凍劑的原因可能是乙二醇分子量相對較小，其滲透能力比二甲基亞砜、甲醇及甘油更強，因此可以更快速高效地進入翹嘴鲌精子細胞內(nèi)，與水結(jié)合以弱化結(jié)晶過程，減少冰晶的產(chǎn)生，提高精子的激活率;且乙二醇濃度為10%時，既能起到良好抗凍保護效果，又不會因其濃度過高對精子產(chǎn)生毒害。因此，翹嘴鲌精子冷凍保存宜選用10%乙二醇為抗凍劑。

參考文獻：

[1]朱華平，黃樟翰，謝 剛，等. 翹嘴紅鲌魚苗耗氧率和窒息點的初步研究[J]. 水利漁業(yè)，2003，23（4）：10-11.

[2]戰(zhàn)培榮，趙吉偉，董崇智，等. 興凱湖翹嘴鲌（Culter albarnus）的生長特性[J]. 海洋與湖沼，2005，36（2）：146-151.

[3]朱其廣，王 健，楊少榮，等. 三峽庫區(qū)木洞江段翹嘴鲌早期生長特征研究[J]. 水生生物學報，2015，39（5）：983-988.

[4]覃 亮，熊邦喜，呂光俊. 徐家河水庫翹嘴鲌的個體生殖力[J]. 應用生態(tài)學報，2009，20（8）：1952-1957.

[5]崔中倩，宋洪建，尹海富. 翹嘴鲌營養(yǎng)需要研究進展[J]. 中國飼料，2012（23）：12-15.

[6]宋 林，樊啟學，胡培培，等. 飼料蛋能比對翹嘴鲌幼魚生長性能、腸道和肝胰臟消化酶活性的影響[J]. 動物營養(yǎng)學報，2013，25（7）：1480-1487.

[7]王貴英，張 涵，李 清，等. 黑尾近紅鲌精子低溫保存方法研究與應用[J]. 淡水漁業(yè)，2016，46（6）：3-7，32.

[8]王貴英，李 清，祝東梅，等. 黑尾近紅鲌精子活力研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學，2016，55（8）：2062-2065.

[9]黃辨非，羅靜波. 氯化鈉溶液對興國紅鯉精子活力的影響[J]. 湖北農(nóng)學院學報，2000，20（1）：62-64.

[10]趙維信，姜仁良，劉修英，等. 幾種鯉科魚類精子和胚胎冷凍損傷的掃描電鏡研究[J]. 淡水漁業(yè)，1992（5）：3-5.

[11]陳松林，劉憲亭，魯大椿，等. 鰱、鯉、團頭魴和草魚精液冷凍保存的研究存[J]. 動物學報，1992，38（4）：413-424.

[12]丁淑燕，嚴維輝，郝 忱，等. 興國紅鯉精液超低溫冷凍保存及效果分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2016，44（2）：277-279.

[13]Alavia S M H，cosson J. Sperm motility in fishes. Ⅰ. Effects of temperature and pH：a review[J]. Cell Biology International，2005（29）：101-110.

[14]Chantzaropoulos A，Nathanailides C，Kokokiris L，et al. A brief exposure to low pH prior to refrigerated storage reduces the motility and viability of goldfish sperm （Carassius auratus，Linnaeus，1758）[J]. Journal of Applied Ichthyology，2015（31）：89-93.

[15]王曉愛，楊君興，陳小勇，等. 軟鰭新光唇魚精子的超低溫冷凍保存[J]. 動物學研究，2012，33（3）：283-289.

[16]王曉愛，楊君興，陳小勇，等. 4種滲透性抗凍劑對暗色唇魚精子冷凍保存的影響[J]. 水生態(tài)學雜志，2012，33（5）：88-93.

[17]孟令寀，溫海深，韓龍江. 大瀧六線魚精液超低溫冷凍保存效果分析[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（22）：262-264.

[18]Lahnsteiner F B B，Horvath A E A. Cryopreservation of spermatozoa in cyprinid fishes[J]. Theriogenology，2000（54）：1477-1498.

[19]Chew P C，Hassan R，Rashid Z A，et al. The current status of sperm cryopreservation of the endangered Probarbus jullieni （Sauvage） in Malaysia[J]. Journal of Applied Ichthyology，2010，26（5）：797-805.

[20]Dietrich G J，Wolnicki J，Slowinska M，et al. Short-term storage and cryopreservation of lake minnow[Eupallasella percnurus （Pallas，1814）]sperm[J]. Journal of Applied Ichthyology，2015，31（1，SI）：75-78.

[21]Gilmore J A，Liu J，Gao D Y，et al. Determination of optimal cryoprotectants and procedures for their addition and removal from human spermatozoa[J]. Human Reproduction，1997，12（1）：112-118.遲美麗，賈永義，王雨辰，等. 不同規(guī)格的河川沙塘鱧夏花生長及生理生化研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2019，47（7）：179-182.