凌阿茹,郭晉麗*,郭文博,楊俊花**,趙志輝
(1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海201306;2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所,上海201403)
玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是禾谷鐮刀菌在適宜的溫度和濕度條件下產(chǎn)生的一種真菌毒素,廣泛存在于霉變的玉米、小麥和高粱等谷類作物中[1]。大量研究證實(shí),ZEA及其代謝物能夠引起畜禽真菌毒素中毒[2],影響內(nèi)臟器官發(fā)育[3],還可導(dǎo)致動(dòng)物繁殖障礙[4]、消化系統(tǒng)功能紊亂[5],給養(yǎng)殖業(yè)造成極大危害。已有研究發(fā)現(xiàn),ZEA與內(nèi)源性雌激素在結(jié)構(gòu)上相似,可通過與雌激素受體(Estrogen receptor,ER)的競爭性結(jié)合,發(fā)生一系列擬雌激素效應(yīng)[6-7],產(chǎn)生毒性。此外,ZEA與ER結(jié)合生成的化合物會(huì)轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi),調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成,進(jìn)一步影響細(xì)胞分裂和生長[8]。
蛋雞作為養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分,每年因真菌毒素污染造成的經(jīng)濟(jì)損失不容忽視。目前,國內(nèi)外關(guān)于ZEA單一毒素污染對蛋雞毒性作用的研究報(bào)道非常少。Borutova等[9]通過給肉雞飼喂3.44 mg/kg DON(Deoxynivalend)和3.36 mg/kg ZEA混合污染的飼料,發(fā)現(xiàn)混合毒素可以誘導(dǎo)肉雞氧化應(yīng)激進(jìn)而影響免疫功能;伍宇超等[10]研究發(fā)現(xiàn),低劑量的ZEA并不會(huì)影響育成期蛋雞的生長性能,但會(huì)顯著影響其血清生化指標(biāo)和抗氧化指標(biāo)。然而,目前關(guān)于ZEA對蛋雞的生產(chǎn)性能、毒性作用、安全閾值等仍沒有明確定論。
本試驗(yàn)選用ZEA標(biāo)準(zhǔn)品,采用直接灌胃的方式研究不同劑量ZEA處理對蛋雞生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)、血常規(guī)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)和生殖激素水平的影響,觀察ZEA對蛋雞的臨床毒性效應(yīng),探究蛋雞對ZEA的安全劑量范圍,旨在為真菌毒素毒理學(xué)研究提供有價(jià)值的理論依據(jù)和參考。
ZEA標(biāo)準(zhǔn)品:淺褐色粉末,純度≥99%,Pribolab,新加坡,(北京普華仁生物技術(shù)開發(fā)有限公司);乙醇、乙腈:色譜純,(Merck,美國);氯化鈉(上海埃彼化學(xué)試劑有限公司);血清生殖激素ELISA試劑盒(上海潤裕生物科技有限公司)。
標(biāo)準(zhǔn)品先用乙醇∶乙腈(4∶1,v∶v)溶解,后用生理鹽水稀釋,其中乙醇∶乙腈的終體積濃度控制在1%以下。
EMT-7300型多功能蛋品分析儀(Robotmation,日本);EFG-0503型蛋殼強(qiáng)度測定儀(Robotmation,日本);Sorvall ST-16R型高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher,美國);HB型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(英諾華,中國);Au-5800型全自動(dòng)血液生化分析儀(Beckman,美國);Infinite M-200型多功能酶標(biāo)儀(Tecan,瑞士)。
隨機(jī)選取同一批次、同一品種、體況良好、產(chǎn)蛋率一致的34周齡海蘭蛋雞100只,隨機(jī)分為5組,每組設(shè)4個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)5只,于2017年10月10日至11月21日在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物房進(jìn)行飼養(yǎng)。采用直接灌胃的方式,對照組灌胃等量生理鹽水,試驗(yàn)組分別灌胃0.5 mg/kg、5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg ZEA(飼糧,每只雞按每天150 mg飼糧飼喂),預(yù)飼期2周,試驗(yàn)期4周,試驗(yàn)期間連續(xù)灌服ZEA,每天下午產(chǎn)蛋結(jié)束后進(jìn)行。選用3層階梯籠養(yǎng),每籠1只,按照封閉式蛋雞養(yǎng)殖場規(guī)定飼養(yǎng),保證每天充足光照16 h,室溫范圍16—20℃,濕度50%—60%。每日6:00喂料1次,自由采食、飲水。蛋雞飼喂基礎(chǔ)飼糧(表1)參照雞的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T 33—2004)并結(jié)合羅愛瓊等[11]的方法配制。
表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels in basal diet(air dry basis) %
1.3.1 生產(chǎn)性能
每天詳細(xì)記錄各組的產(chǎn)蛋數(shù)、軟破殼蛋數(shù)、蛋重、采食量和死亡雞只數(shù),每周測雞體重,計(jì)算整個(gè)試驗(yàn)期不同組的平均蛋重、產(chǎn)蛋率、采食量、料蛋比。計(jì)算公式如下:
平均蛋重(g)=平均每日總蛋重/總蛋數(shù);
產(chǎn)蛋率=平均每日總蛋數(shù)/雞數(shù)×100%;
采食量(g/d)=每日消耗飼糧總量/雞數(shù);
料蛋比=采食量/產(chǎn)蛋重。
1.3.2 蛋品質(zhì)測定
試驗(yàn)結(jié)束前3 d(2017年11月19—21日),連續(xù)收集各試驗(yàn)組雞蛋,每組隨機(jī)選取30枚雞蛋用多功能蛋品分析儀和蛋殼強(qiáng)度測定儀檢測以下指標(biāo):蛋形指數(shù)、蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋白高度、哈氏單位、蛋黃顏色、蛋殼顏色等。
1.3.3 血常規(guī)指標(biāo)測定
試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(2017年11月21日),每只雞用真空管翅靜脈采血5 mL。其中,1 mL由加肝素鈉抗凝劑的真空管收集,30 min內(nèi)用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測定血常規(guī)指標(biāo):白細(xì)胞總數(shù)(WBC)、淋巴細(xì)胞總數(shù)(LY)、單核細(xì)胞數(shù)(MO)、中性粒細(xì)胞數(shù)(GR)、血紅蛋白濃度(HGB)、紅細(xì)胞壓積(HCT)、紅細(xì)胞總數(shù)(RBC)、紅細(xì)胞平均體積(MCV)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)、血小板總數(shù)(PLT);4 mL由不含抗凝劑的真空管收集,3 000 r/min離心15 min,吸取上層血清,-20℃冷凍保存,用于血液生化指標(biāo)分析及激素水平測定。
1.3.4 臟器系數(shù)
采血結(jié)束后,每個(gè)試驗(yàn)組每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選取3只雞,共60只進(jìn)行宰殺,手術(shù)分離心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、卵巢和子宮等器官,準(zhǔn)確稱重并根據(jù)如下公式計(jì)算:
臟器系數(shù)=臟器重量(g)/動(dòng)物體重(g)×100%。
1.3.5 血液生化指標(biāo)測定
用全自動(dòng)血液生化分析儀對以下指標(biāo)進(jìn)行測定:白蛋白(ALB)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素(UREA)、堿性磷酸酶(ALP)、總膽紅素(TBILI)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總蛋白(TP)、肌酐(CRE)、球蛋白(GLB)。
1.3.6 血清生殖激素水平分析
多功能酶標(biāo)儀對血清中以下激素水平進(jìn)行測定:促黃體素(Luteinizing hormone,LH)、卵黃蛋白原(Vitellogenin,VTG)、孕酮(Progesterone,P4)、β內(nèi)啡肽(β-endorphin,β-EP)、雌二醇(Estradiol,E2)、生長激素(Growth hormone,GH)和促卵泡素(Follicle-stimulating hormone,F(xiàn)SH)。
采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。差異顯著性檢驗(yàn)采用單因素方差分析(One-way ANOVA,LSD),其中P<0.05為差異顯著、P<0.01為差異極顯著,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。
由表2可見,各試驗(yàn)組蛋雞體重均未見顯著變化。與對照組相比,只有5 mg/kg組產(chǎn)蛋率顯著提高,且顯著高于其他各組(P<0.01);同時(shí)50 mg/kg組的產(chǎn)蛋率還顯著低于0.5 mg/kg組(P<0.05)。此外,5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg組的采食量均顯著高于對照組(P<0.05或P<0.01),200 mg/kg組還顯著高于0.5 mg/kg組(P<0.05)。與對照組相比,0.5 mg/kg、5 mg/kg和50 mg/kg組平均蛋重顯著提高(P<0.05或P<0.01),200 mg/kg組卻顯著降低(P<0.01);與0.5 mg/kg組相比,5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg組平均蛋重均極顯著降低,且呈劑量效應(yīng)關(guān)系(P<0.01)。與對照組相比,0.5 mg/kg組料蛋比無顯著變化(P>0.05),5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg組均顯著提高(P<0.05或P<0.01),其中200 mg/kg組料蛋比顯著高于5 mg/kg和50 mg/kg組(P<0.05)。
表2 不同劑量ZEA對蛋雞生產(chǎn)性能的影響Table 2 Effects of ZEA with different doses on laying performance in laying hens
由表3可見,各試驗(yàn)組蛋殼強(qiáng)度、蛋殼厚度、蛋白高度、哈氏單位均未見顯著變化。與對照組相比,0.5 mg/kg、5 mg/kg和50 mg/kg組蛋形指數(shù)均無顯著變化,只有200 mg/kg組顯著提高(P<0.05);0.5 mg/kg和50 mg/kg組蛋黃顏色顯著降低,而5 mg/kg和200 mg/kg組無顯著變化。0.5 mg/kg組蛋殼顏色較對照組顯著降低(P<0.05),其余各組均無顯著變化,而與0.5mg/kg組相比,50mg/kg組蛋殼顏色顯著提高(P<0.05)。
表3 不同劑量ZEA對蛋品質(zhì)的影響Table 3 Effects of ZEA with different doses on egg quality
由表4可見,各試驗(yàn)組心、肝、脾、肺和子宮的臟器系數(shù)均無顯著差異。與對照組相比,50 mg/kg和200 mg/kg組腎臟系數(shù)顯著提高(P<0.05)。隨著ZEA灌胃劑量的增加,卵巢系數(shù)有降低趨勢,但在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異,只有200 mg/kg組顯著低于對照組(P<0.05)。
表4 不同劑量ZEA對蛋雞各組織臟器系數(shù)的影響Table4 Effects of ZEA with different doses on organ indexes in laying hens %
由表5可見,各試驗(yàn)組HGB、HCT、RBC、MCV、MCHC和PLT均未見顯著變化。與對照組相比,0.5 mg/kg組WBC和LY數(shù)量均無顯著變化,5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg組的WBC和LY數(shù)量均顯著增加(P<0.01),且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系;同時(shí),50 mg/kg和200 mg/kg組WBC和LY數(shù)量顯著高于5 mg/kg組(P<0.01)。隨著ZEA灌胃劑量的增加,MO和GR數(shù)量逐漸增加,也呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,其中50 mg/kg和200 mg/kg組均顯著高于對照組(P<0.01)。
表5 不同劑量ZEA對蛋雞血常規(guī)的影響Table 5 Effects of ZEA w ith different doses on hematological indices in laying hens
由表6可見,各試驗(yàn)組除了UREA和CRE外,其他生化指標(biāo)均未呈現(xiàn)顯著差異。與對照組相比,0.5 mg/kg組UREA濃度無顯著變化,5 mg/kg和50 mg/kg組顯著升高(P<0.05),200 mg/kg組極顯著升高(P<0.01)。隨著ZEA灌胃劑量的增加,CRE濃度有上升的趨勢,與對照組相比,只有50 mg/kg和200 mg/kg組CRE濃度顯著升高(P<0.05)。
表6 不同劑量ZEA對蛋雞血液生化指標(biāo)的影響Table 6 Effects of ZEA w ith different doses on serum biochem ical parameter in laying hens
由表7可見,各試驗(yàn)組血清中VTG、E2、GH和FSH水平均無顯著差異。與對照組相比,0.5 mg/kg組LH和P4水平均無顯著變化,5 mg/kg、50 mg/kg和200 mg/kg組LH水平均顯著降低(P<0.01),P4水平均顯著提高(P<0.05),呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。此外,0.5 mg/kg和5 mg/kg組β-EP水平無顯著變化(P>0.05),50 mg/kg和200 mg/kg組較對照組顯著提高(P<0.05或P<0.01),且200 mg/kg組顯著高于50 mg/kg組(P<0.01)。
表7 不同劑量ZEA對蛋雞血液生殖激素水平的影響Table 7 Effects of ZEA w ith different doses on reproductive hormone levels in laying hens
Jia等[12]研究發(fā)現(xiàn),ZEA污染量為0.2602 mg/kg的日糧對蛋雞產(chǎn)蛋量和采食量均無顯著影響。本試驗(yàn)中,當(dāng)ZEA劑量不高于0.5 mg/kg時(shí),與對照組相比產(chǎn)蛋率和采食量均無顯著變化,與Jia等[12]研究結(jié)果一致。當(dāng)ZEA劑量達(dá)到5 mg/kg時(shí),產(chǎn)蛋率、采食量和料蛋比較對照組均顯著提高,表明低劑量的ZEA能夠提高蛋雞產(chǎn)蛋性能。有研究顯示,禽類的產(chǎn)蛋性能與卵巢卵泡的生長發(fā)育密切相關(guān)[13],筆者推測ZEA作為一種類雌激素,當(dāng)劑量為5 mg/kg時(shí)可促進(jìn)蛋雞性腺和卵泡發(fā)育,進(jìn)而提高蛋雞的產(chǎn)蛋率,但其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探究。本研究中,0.5 mg/kg的ZEA可以使蛋重顯著提高,當(dāng)ZEA劑量達(dá)到200 mg/kg時(shí),蛋重顯著降低,表明高劑量的ZEA會(huì)產(chǎn)生過雌激素毒性作用,對卵巢造成損傷,降低蛋雞產(chǎn)蛋性能,有研究發(fā)現(xiàn),ZEA會(huì)抑制肉雞、豬、狗和大鼠等雌性動(dòng)物的卵巢發(fā)育[14-17]。
蛋品質(zhì)作為評價(jià)雞種優(yōu)劣的重要指標(biāo),本試驗(yàn)中,對照組蛋形指數(shù)在正常值范圍內(nèi),200 mg/kg組較對照組顯著提高,這可能與高劑量的ZEA影響蛋雞生殖功能和器官發(fā)育有關(guān)。ZEA與雌激素受體結(jié)合表現(xiàn)出弱雌激素活性,會(huì)造成動(dòng)物體內(nèi)生殖激素紊亂,生殖器官損傷,對動(dòng)物繁殖機(jī)能造成嚴(yán)重的影響[15]。有研究顯示,蛋殼顏色不僅與遺傳有關(guān),還與殼上膜的量及其中所含色素的量有關(guān),殼上膜是蛋殼的最外層,母雞殼上膜的分泌量不隨年齡的變化而提高,但在蛋重增大時(shí),有限的殼上膜分布不到擴(kuò)大的蛋殼上,因此蛋殼顏色變淺[18]。在本研究中,與對照組相比,只有0.5 mg/kg組蛋殼顏色顯著降低,因此推測與其蛋重顯著提高有關(guān)。另外,與對照組相比,0.5 mg/kg和50 mg/kg組蛋黃顏色顯著降低,這可能與ZEA影響卵泡發(fā)育,導(dǎo)致色素沉積不充分有關(guān)。因?yàn)樯爻练e會(huì)隨卵巢中卵泡的發(fā)育而增強(qiáng),而卵泡發(fā)育通常需要5—10 d,因此蛋黃完全著色需要5—10 d[13],推測在此過程中ZEA破壞蛋雞的生殖發(fā)育系統(tǒng),影響了卵泡發(fā)育,進(jìn)而影響色素沉積最終導(dǎo)致蛋黃顏色變淺,但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。
臟器系數(shù)能夠直觀地反映不同濃度外源性有毒有害物質(zhì)作用后的蛋雞內(nèi)臟器官生長發(fā)育或病變情況。臟器系數(shù)增大,提示臟器充血、水腫或增生肥大等變化;臟器系數(shù)減小,提示臟器萎縮及其他退行性疾病。Salem等[19]研究發(fā)現(xiàn),40mg/kg b.w.的ZEA可使小鼠腎臟細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)細(xì)胞死亡,從而對腎臟產(chǎn)生毒性作用。本研究中,隨著ZEA灌胃劑量的增加,各試驗(yàn)組的腎臟臟器系數(shù)逐漸增加,呈劑量-效應(yīng)關(guān)系,當(dāng)ZEA灌胃劑量高于50 mg/kg,腎臟臟器系數(shù)較對照組均顯著提高,表明ZEA灌胃劑量高于50 mg/kg時(shí),會(huì)誘導(dǎo)腎臟水腫充血,增生肥大,對腎臟造成明顯損傷。Jia等[20]研究發(fā)現(xiàn),給妊娠母豬飼喂被ZEA污染的飼糧后,腎臟發(fā)生腫大,與本試驗(yàn)結(jié)果一致。當(dāng)ZEA灌胃劑量達(dá)到200 mg/kg時(shí),卵巢臟器系數(shù)顯著降低,表明200 mg/kg的ZEA會(huì)使蛋雞卵巢萎縮,造成損傷,進(jìn)一步證明了高劑量ZEA對蛋雞卵巢的損傷作用。Zwierzchowski等[21]也發(fā)現(xiàn),0.2 mg/kg.b.w.的ZEA處理母豬后,會(huì)抑制其卵巢卵泡的生長發(fā)育,提示與ZEA誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡有關(guān)。這些毒性作用,一方面與ZEA發(fā)揮類雌激素作用,與細(xì)胞質(zhì)雌激素受體結(jié)合、進(jìn)入細(xì)胞核導(dǎo)致染色體異常,抑制DNA和蛋白質(zhì)合成有關(guān),另一方面與ZEA誘導(dǎo)細(xì)胞氧化損傷進(jìn)而發(fā)生凋亡相關(guān)[22]。
伍宇超等[10]通過在育成期蛋雞基礎(chǔ)日糧中添加0.4 mg/kg的ZEA發(fā)現(xiàn),蛋雞血液中性粒細(xì)胞數(shù)顯著提高;Maaroufi等[23]發(fā)現(xiàn),給雌性大鼠腹膜注射1.5—5.0 mg/kg的ZEA,48 h后大鼠血液白細(xì)胞數(shù)量顯著提高。本研究也發(fā)現(xiàn)當(dāng)ZEA灌胃劑量高于5 mg/kg時(shí),蛋雞血液中WBC、LY和GR數(shù)量均顯著提高;當(dāng)劑量高于50 mg/kg時(shí),MO數(shù)量顯著提高,可見當(dāng)ZEA高于5 mg/kg時(shí)可誘導(dǎo)蛋雞發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。
尿素(UREA)和肌酐(CRE)水平是體現(xiàn)腎臟腎小球的濾過功能的重要指標(biāo),當(dāng)腎臟受損時(shí)會(huì)引起UREA和CRE濃度升高。本試驗(yàn)中,當(dāng)ZEA灌胃劑量高于50mg/kg時(shí),血清中UREA和CRE濃度較對照組均顯著提高,表明ZEA濃度在高于50 mg/kg時(shí)會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷蛋雞腎臟。孫真真等[24]給蛋雞灌胃ZEA后也發(fā)現(xiàn)血清中UREA和CRE濃度顯著提高,與本研究結(jié)果一致,進(jìn)一步證明腎臟是ZEA毒性作用的另一靶標(biāo)器官。
研究顯示,創(chuàng)傷后血漿內(nèi)β-EP水平升高,推測β-EP水平也是反應(yīng)創(chuàng)傷早期炎癥變化的重要標(biāo)志物之一[25]。本試驗(yàn)中,當(dāng)ZEA灌胃劑量高于5 mg/kg時(shí),與對照組相比β-EP水平顯著提高,進(jìn)一步表明ZEA誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。促黃體素(LH)能誘導(dǎo)排卵前的卵泡生長發(fā)育并觸發(fā)排卵,促進(jìn)黃體形成同時(shí)分泌孕酮(P4)。在本研究中隨著ZEA灌胃劑量的增加,LH水平逐漸降低,且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)ZEA劑量高于5mg/kg時(shí),與對照組相比各試驗(yàn)組LH水平均極顯著降低,這可能與ZEA的類雌激素作用有關(guān),由于雌激素對下丘腦和垂體發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用,當(dāng)ZEA進(jìn)入蛋雞體內(nèi)后代替雌激素發(fā)揮作用,誘導(dǎo)垂體促性腺激素分泌水平降低,進(jìn)一步導(dǎo)致LH水平降低。而P4水平的極顯著提高,進(jìn)一步證明了ZEA是通過持續(xù)發(fā)揮類雌激素作用來誘導(dǎo)P4分泌水平提高的。
①當(dāng)ZEA劑量高于5 mg/kg時(shí),會(huì)降低平均蛋重、增加料蛋比,影響蛋雞的生產(chǎn)性能,同時(shí)對蛋殼和蛋黃顏色沉積也有一定的干擾作用。
②ZEA灌胃劑量高于5 mg/kg時(shí),蛋雞血液中WBC、LY、GR、MO數(shù)量及內(nèi)分泌激素β-EP水平均顯著提高,表明ZEA誘導(dǎo)蛋雞產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。
③高劑量ZEA灌胃導(dǎo)致蛋雞腎臟水腫充血、臟器系數(shù)顯著提高,血液UREA和CRE含量提高,提示腎臟是ZEA對蛋雞毒性作用的另一靶標(biāo)器官。
④高劑量的ZEA不僅誘導(dǎo)蛋雞卵巢萎縮,而且會(huì)干擾性激素β-EP、LH、P4等的分泌。
上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)2019年4期