楊凱，Bazhanov Dmitry,2，李紅梅，李玲，李成云，李紀順，扈進冬，楊合同，陳相峰

(1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)生態(tài)研究所，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250103；2.聊城大學農學院，山東 聊城 272000；3.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)山東省分析測試中心，山東 濟南 250014)

阿特拉津(2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1,3,5-三嗪，Atraizne)是一種廣泛用于闊葉雜草和一些禾本科雜草防除的三嗪類除草劑.由于玉米體內具有相應的解毒酶，對其具有很強的耐受能力，常用于玉米田雜草的防除[1].阿特拉津在土壤中半衰期較長，易對小麥等后茬敏感作物產生藥害[2]，尤其是在小麥-夏玉米-小麥的輪作制度下，阿特拉津的應用，殘留及其污染土壤的修復受到了人們的廣泛關注.

阿特拉津溶淋性好，遷移率高，持效期長，已造成了許多國家的土壤、地表水和地下水污染[3].在我國，由于阿特拉津的廣泛使用及其水溶性強的特性，對于阿特拉津在水環(huán)境中的污染情況已有不少報道[4-6].土壤作為阿特拉津的重要儲存介質，是將其傳輸給農產品的重要媒介，土壤中阿特拉津的殘留直接影響著農產品產量及質量.而阿特拉津是一種潛在的致癌物和內分泌干擾物，且具有誘導腫瘤發(fā)生和減輕體重等慢性毒性，而有研究表明阿特拉津的脫烷基代謝產物的毒性與阿特拉津相當或更大[7-8].因此，如何對阿特拉津污染土壤進行有效修復，降低阿特拉津及其代謝產物在土壤中的殘留，減少阿特拉津及其代謝產物匯入水介質的機會，從而減少其對人們帶來的潛在威脅，是科學研究者的目標.

目前，眾多科研人員致力于阿特拉津污染土壤的修復，嘗試了各種的生物降解方法，包括植物、真菌以及細菌等[9].本課題組前期也篩選分離了大量的阿特拉津降解菌，如假單胞菌、諾卡氏菌、土壤桿菌以及節(jié)桿菌等[10].但微生物-植物聯(lián)合對阿特拉津降解的報道較少，敏感作物小麥與微生物聯(lián)合對阿特拉津降解的研究也是鮮有報道，而關于降解菌對于阿特拉津主要降解產物殘留方面的研究則未見報道.本課題組前期研究表明，產脲節(jié)桿菌(Arthrobacterureafaciens)DnL1-1具有很好的阿特拉津降解能力，且能在作物根際有效定殖，并與小麥及紫花苜蓿聯(lián)合作用對阿特拉津具有很好的降解效果[11].

因此，本研究在前期基礎上研究考察了小麥對不同阿特拉津含量土壤中產脲節(jié)桿菌-DnL1-1種群分布的影響，DnL1-1-與小麥聯(lián)合對阿特拉津的降解效果以及對其降解產物的影響，以期為阿特拉津污染土壤的修復提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和植物 產脲節(jié)桿菌-DnL1-1菌株為本實驗室從山東省玉米田土壤中分離并保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，登記編號為CGMCC 9667.試驗所用植物為‘濟麥14號’，盆栽試驗在光照培養(yǎng)箱中進行，溫度晝25 ℃，夜18 ℃.

1.1.2 供試土壤 供試土壤于2017年5月17日采自山東省科學院生物中心試驗基地，從未施用過阿特拉津，經(jīng)PCR檢測及富集培養(yǎng)，不含阿特拉津降解菌，自然風干后，過篩(5 mm)備用.

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑 試驗使用SM及SMY培養(yǎng)基[10].SM培養(yǎng)基：0.5 g K2HPO4、0.2 g MgSO4· 7H2O、0.1 g NaCl、0.02 g CaCl2、2 g 葡萄糖、10 mL阿特拉津原液(1 mL 吐溫-80、5 g 阿特拉津原藥、100 mL蒸餾水),5 mL ZnFe-citrate 原液(0.04 g ZnSO4· 7H2O、0.4 g FeSO4· 7H2O、10 g檸檬酸鈉、100 mL蒸餾水，121°C滅菌30 min；SMY培養(yǎng):基SM培養(yǎng)基中加入0.1 g/L酵母粉；試劑均為國產分析純或色譜純；阿特拉津原藥，純度為97%，由山東省濰坊科賽基農化工有限公司提供；5 mmol/L KH2PO4溶液(0.68 g KH2PO4、1000 mL蒸餾水)，阿特拉津原液(1 mL 吐溫-80、5 g 阿特拉津原藥、100 mL蒸餾水).

1.2 方法

1.2.1 接種液制備 將產脲節(jié)桿菌DnL1-1菌種活化后，用接種環(huán)挑取單菌落接種于50 mL液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)24 h，之后按照不同比例稀釋制成菌懸液，備用.

1.2.2 小麥-產脲節(jié)桿菌DnL1-1對不同濃度阿特拉津的降解影響 試驗用容器為500 mL的塑料盆，每盆中添加供試土壤300 g，每盆加70 mL 5 mmol/L KH2PO4溶液，或阿特拉津質量濃度為25、2、0.5 μg/mL的5 mmol/L KH2PO4溶液.將催芽后的小麥種子分別在不同稀釋倍數(shù)的菌懸液中浸種1 h，得到不同濃度的接種種子.選取長勢一致、均勻飽滿的小麥種子種植于盆內，非浸種的對照種子同樣處理.設置3種阿特拉津添加濃度的土壤：1 750，140，35 μg/盆.對不同濃度阿特拉津污染土壤進行5種不同處理：①只種植小麥(小麥)；②種植小麥+接菌(小麥+DnL1-1)；③只接菌(DnL1-1)；④對照，無小麥，未接菌；⑤對照，未培養(yǎng).每個處理4個重復，每盆種植小麥10粒.之后錫箔紙包盆，模擬土壤黑暗環(huán)境，置于托盤上，放于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，期間定期澆水.28 d后收集土壤，對產脲節(jié)桿菌DnL1-1的定殖情況，以及土壤中阿特拉津及其降解產物的含量進行測定.

1.2.3 接種濃度及定殖濃度檢測 浸種后，取10粒小麥種子于2 mL離心管中，分別用1 mL和2.5 mL SM鹽緩沖液洗滌，在渦旋振蕩器上最大速度震蕩10 min，懸液為0稀釋度，然后分別對懸液進行10倍梯度稀釋，不同稀釋度的菌懸液涂布到SM平板上，28 ℃培養(yǎng)4 d，對平板上產生降解圈的菌落進行計數(shù)[11-12].

28 d后收獲，取每個重復3根小麥主根系及1 g非根際土，分別用3.5 mL和10 mL SM鹽緩沖液洗滌，在渦旋振蕩器上最大速度震蕩10 min，懸液為0稀釋度，然后分別對懸液進行10倍梯度稀釋，不同稀釋度的菌懸液涂布到SM平板上，28 ℃培養(yǎng)4 d，對平板上產生降解圈的菌落進行計數(shù)[11-12].

1.2.4 樣品萃取與測定 土壤樣品的前處理使用渦旋振蕩的方法[13]；使用優(yōu)化后的高效液相色譜-質譜聯(lián)用的方法對土壤中萃取的阿特拉津及其降解產物進行測試分析，高效液相色譜-質譜采用Utimate 3000 HPLC-Thermo TSQ-Vantage液相色譜/質譜聯(lián)用儀[13]，色譜條件：柱溫28 ℃；流速0.6 mL/min；進樣量10 μL；流動相：A甲醇，B水(0.1%甲酸)；二元梯度分離，梯度順序：0～6 min，95%B；6～20 min，10%B；20～25 min，10%B；25～25.1 min，95%B；25.1～30 min，95%B.質譜條件：電噴霧電離(ESI+)離子源；離子源溫度：350°C；毛細管電壓：3.5 kV；脫溶劑溫度：350°C；脫溶劑氣(氮氣)氣壓：60 arb；輔助氣(氮氣)氣壓：30 arb；碰撞氣壓(氬氣)：0.2 Pa；多反應監(jiān)測(MRM)模式.ATZ及其降解產物的質譜優(yōu)化參數(shù)列于表1.阿特拉津及其降解產物羥基阿特拉津(HA)、脫乙基阿特拉津(DEA)、脫異丙基阿特拉津(DIA)和脫乙基脫異丙基阿特拉津(DAA)的標準品信息及測試分析方法參照文獻[14].

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 19.0軟件處理數(shù)據(jù)，并進行繪圖、分析和統(tǒng)計，并采用Duncan法(新復極差法)進行顯著性分析.

表1 阿特拉津及其降解產物的質譜優(yōu)化條件

*定量離子 Quantitative ion.

2 結果與分析

2.1 產脲節(jié)桿菌DnL1-1在小麥根際的定殖效果

本試驗對小麥與DnL1-1聯(lián)合修復阿特拉津過程中DnL1-1的定殖情況進行了分析(表2).結果表明，不同接菌濃度處理，DnL1-1在小麥根際的定殖濃度均顯著高于在非根際土里的定殖濃度.隨著阿特拉津濃度的逐漸降低，小麥根際及非根際土中DnL1-1定殖濃度也逐漸降低，在阿特拉津濃度為5 833.3 μg/kg時定殖效果最好，而當接菌濃度相同時，阿特拉津濃度為466.7 μg/kg的處理中DnL1-1在土壤及小麥根際的種群密度均顯著高于阿特拉津濃度為116.7 μg/kg的處理，說明阿特拉津作為DnL1-1的唯一氮源，對DnL1-1種群密度的增長影響顯著.種植小麥土壤中DnL1-1數(shù)量明顯高于未種植小麥土壤，均達到顯著水平，說明小麥根系促進了DnL1-1的增殖，其原因可能與小麥生長過程中產生的根系分泌物有關.

當阿特拉津濃度為116.7 μg/kg時，小麥并不能顯著促進DnL1-1的種群生長，但卻能在接種DnL1-1一定濃度的前提下顯著促進阿特拉津的降解.根據(jù)前期研究[14]，在高濃度阿特拉津時，DnL1-1能快速建立種群，符合R策略的種群生長規(guī)律，而在低濃度阿特拉津或無阿特拉津時，DnL1-1的種群密度不能維持增長，甚至逐漸減退，說明阿特拉津對于DnL1-1的快速繁殖，建立優(yōu)勢種群密度是不可或缺的.因此，若要使DnL1-1形成優(yōu)勢種群，DnL1-1的接菌濃度必須足夠高，以建立不低于105CFU/g根重的根際種群密度以及不低于104CFU/g土重的土壤種群密度，如此才能更好地發(fā)揮DnL1-1優(yōu)勢菌群的作用.

2.2 小麥對產脲節(jié)桿菌DnL1-1降解阿特拉津的影響

由圖1可知，經(jīng)HPLC-MS/MS分析，當阿特拉津濃度為5 833.3、466.7、116.7 μg/kg時，28 d后，DnL1-1與小麥協(xié)同對阿特拉津的降解率依次為98.4%、92.0%、75.5%和84.5%，均顯著高于相應的DnL1-1單獨使用對阿特拉津的降解率，降解率依次為93.0%、72.0%、64.3%和77.2%.隨著阿特拉津濃度的逐漸降低，DnL1-1與小麥協(xié)同對阿特拉津的降解效率隨之逐漸降低.阿特拉津濃度為116.7 μg/kg時，接菌濃度5.7 lg CFU/粒時，DnL1-1與DnL1-1+小麥兩種處理對阿特拉津的降解率均顯著高于接菌濃度為4.9 lg CFU/粒的處理(圖1-C,1-D)，說明小麥與DnL1-1協(xié)同明顯有助于阿特拉津降解率的提高，同時DnL1-1接菌濃度的高低，也直接影響著對阿特拉津的降解率.

表2 產脲節(jié)桿菌DnL1-1在土壤及植物根際的種群密度

NA：未檢測到；大寫字母表示每行之間的比較，小寫字母表示每列之間的比較，字母不同表示差異顯著(P<0.05).

NA：Not analysed；The different capital letters mean significant difference in the same row (P<0.05)；The different small letters mean significant difference in the same column(P<0.05).

A～D：阿特拉津濃度依次為5 833.3、466.7、116.7、116.7 μg/kg；C、D：DnL1-1接菌濃度分別為4.9、5.7 lg CFU/粒；處理：未培養(yǎng)(C1)，未接菌，無植物(C2)，小麥(C3)，DnL1-1(I1)，DnL1-1+小麥(I2).The atrazine rate of A～D：5 833.3,466.7,116.7,116.7 μg/kg;The inoculum levels of C,D:4.9,5.7 lg CFU/seed;Treatments：not incubated pots (C1),not inoculated not planted pots (C2),wheat (C3),DnL1-1(I1),DnL1-1+wheat (I2)).圖1 產脲節(jié)桿菌DnL1-1對小麥根部阿特拉津的降解效果Figure 1 Root-associated degradation of atrazine by A.ureafaciens DnL1-1

2.3 小麥-DnL1-1協(xié)同對阿特拉津及其代謝產物殘留的影響

目前已有不少研究對土壤中阿特拉津的殘留進行了報道[15-18]，其中于曉斌[17]對吉林省不同玉米種植區(qū)阿特拉津的殘留進行檢測，其中阿特拉津最大殘留量變化范圍為169～295 μg/kg，該殘留量對水稻、小麥、大白菜、黃瓜、番茄等均是不安全的，對后茬作物的種植存在著較高風險[18].本實驗室在前期研究的基礎上，選擇阿特拉津濃度為116.7 μg/kg，DnL1-1接菌濃度為5.7 lg CFU/粒時對阿特拉津及其降解產物的殘留積累量進行分析.由表3可知，未接菌、無植物的處理對阿特拉津的降解率可達67.9%.對阿特拉津降解產物的分析結果顯示DEA是阿特拉津的主要代謝產物，HA、DIA、DAA則為次要代謝產物(圖2).小麥與DnL1-1協(xié)同對阿特拉津的降解率可達84.5%，與未接菌、無植物的對照相比有效減少了其降解產物DEA、DAA、HA和DIA(61.6%、52.2%、9.7%和24.4%).與單獨接菌DnL1-1的處理相比，DEA、DAA和DIA的積累量則減少46.3%、49.2%和15%，差異顯著，而HA的積累量則變化不大.未接菌小麥處理與對照相比，阿特拉津降解產物DEA、DAA和DIA的殘留積累量減少50.0%、59.7%和20.0%.在未接菌+無植物及未接菌+小麥的處理中，阿特拉津及其降解產物的總摩爾質量分別為0.07、0.04 μmol/kg，是空白土壤對照中總摩爾質量的64.2%、38.9%(圖2，表3).而DnL1-1與小麥 + DnL1-1處理的總摩爾質量分別為0.05、0.03 μmol/kg，占起始總摩爾質量的48.6%、31.9%.以上數(shù)據(jù)表明，小麥+DnL1-1處理不僅能高效降解阿特拉津，還可以減少其降解產物HA、DEA、DAA等的積累，降低阿特拉津及其降解產物對小麥的藥害，而未接菌+小麥處理對阿特拉津降解產物DEA、DAA和DIA殘留積累量的降低同樣效果顯著，對HA效果不顯著，因此對于小麥對阿特拉津及其降解產物的作用機制仍需進一步探索.

表3 土壤中阿特拉津及其降解產物的定量檢測

LOD：檢出限；LOQ：定量限.

LOD：Limit of detection；LOQ：Limit of quantity.

3 討論

目前，關于植物對阿特拉津降解方面的研究已有相關報道.Lin等[19]研究發(fā)現(xiàn)，風傾草能夠降解80%以上的阿特拉津.Merini等[20]研究了多花黑麥草對阿特拉津的植物降解作用及機制.Singh等[21]研究植物對阿特拉津的降解作用，結果顯示狼尾草根際的分泌物可刺激阿特拉津的降解，同時植物的根系可幫助微生物在土壤中擴散，因此降解菌可進入深土層，可更好地加速阿特拉津的降解.陳建軍等[22]研究發(fā)現(xiàn)皇竹草可促進土壤中阿特拉津的降解.王繪磚等[23]及斯華敏等[24]就轉基因煙草對阿特拉津的生物降解進行了研究，且效果顯著.但關于植物與微生物聯(lián)合修復阿特拉津污染土壤研究報道的仍屬少數(shù).

植物對阿特拉津的降解主要是通過植物的吸收、累積及根際礦化作用等途徑，而植物與微生物聯(lián)合可通過植物改變微生物區(qū)系結構，增加其數(shù)量或提高其活性從而加快阿特拉津的降解[22].Kirk等[25]研究發(fā)現(xiàn)，黑麥草、紫花苜蓿的根系活動能提高根際環(huán)境中微生物的種類、數(shù)量，促進石油烴的降解.陳建軍等[22]發(fā)現(xiàn)皇竹草能增加土壤中的細菌、放線菌的數(shù)量，促進對阿特拉津的降解.本研究中也發(fā)現(xiàn)小麥能夠促進阿特拉津降解菌DnL1-1的種群數(shù)量，從而提高對阿特拉津的降解率，這些研究結果都說明可能是在植物-微生物系統(tǒng)中，小麥生長過程中釋放的根系分泌物為DnL1-1生長提供了豐富的影響物質，而阿特拉津的存在則為DnL1-1提供了氮源物質，能促進DnL1-1的活性和生物轉化作用.植物還可通過根系擴大微生物活動范圍來增強微生物活性[26].Zhang等[27]研究表明，阿特拉津降解菌DNS10與狼尾草聯(lián)合使用，30 d可降解土壤中98.1%的阿特拉津，修復效果顯著.Gaskin等[28]研究表明在外部根際菌群與宿主植物松樹共存時，對土壤中的阿特拉津其修復效率比單獨的植物修復高3倍.這些結果都相互驗證了植物-微生物聯(lián)合可促進對阿特拉津的降解這一結果.因此，對于阿特拉津降解菌與植物的聯(lián)合應用對提高阿特拉津的降解效果，減少阿特拉津及其降解產物的殘留積累，實現(xiàn)阿特拉津污染土壤的原位修復，從而降低對作物的藥害，提高作物產量和質量具有一定的實踐指導意義.Ibrahim等[1]曾研究發(fā)現(xiàn)，與小麥相比，玉米對阿特拉津的耐受能力要高2 024倍.因玉米體內具有阿特拉津解毒酶，能有效地減少阿特拉津的積累，與玉米相比，小麥屬于敏感作物.多項研究結果表明高濃度阿特拉津對小麥具有明顯藥害，但在本研究結果中當阿特拉津濃度為116.7 μg/kg時，小麥本身亦能有效地促進阿特拉津的降解，減少其降解產物的殘留積累，因此對于低濃度阿特拉津時，小麥本身對阿特拉津的降解修復機制還有待進一步研究.

圖2 阿特拉津濃度為116.7 μg/kg時，阿特拉津及其降解產物在土壤中的摩爾平衡質量Figure 2 Molar balance of atrazine and its degradation products in soil exposed to the 116.7 μg/kg dose of the herbicide

4 結論

1) 相同接菌濃度時，阿特拉津濃度越高，DnL1-1在土壤中的定殖效果越好，隨著阿特拉津濃度的逐漸降低，DnL1-1在土壤中的定殖濃度逐漸降低；不同阿特拉津濃度處理，種植小麥土壤中DnL1-1的種群數(shù)量顯著高于未種植小麥土壤，在小麥根際的定殖濃度顯著高于非根際土.

2) 不同阿特拉津濃度處理(5 833.3、466.7、116.7μg/kg)下，小麥與DnL1-1協(xié)同對阿特拉津的降解率(98.4%、92.0%、84.5%)均顯著高于DnL1-1單獨作用(93.0%、72.0%、77.2%).

3) 阿特拉津濃度為116.7 μg/kg時，小麥與DnL1-1能夠有效減少阿特拉津降解產物DEA、DAA、HA和DIA的殘留積累量，依次減少61.6%、52.2%、9.7%和24.4%.