孫冬梅

(長(zhǎng)春醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部組胚教研室，吉林 長(zhǎng)春 130031)

阿爾茨海默病(AD)是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性退行性病變，也是一種神經(jīng)毒性損傷病變〔1,2〕。臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性精神狀態(tài)衰變，包括記憶障礙、情感障礙、認(rèn)知障礙及社交障礙等，發(fā)病近年呈上升趨勢(shì)〔3,4〕。目前西醫(yī)對(duì)AD尚無(wú)有效治療藥物且西藥長(zhǎng)期服用副作用顯著〔1，5〕，因此本實(shí)驗(yàn)研究采用姜黃素治療，探究姜黃素對(duì)AD小鼠記憶能力、腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷程度、凋亡程度、腦組織中β-淀粉樣(Aβ)和磷酸化tau(Ptau)蛋白的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度及mRNA水平的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源及分組 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物野生C57BL/6和轉(zhuǎn)基因APP/V717雌性小鼠，體質(zhì)量(23.4±1.2)g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司提供，合格證SCXK(遼)2015-0001。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組(C57BL/6野生雌性小鼠，n=10)、AD模型組(APP/V717轉(zhuǎn)基因雌性小鼠，n=10)和姜黃素治療組(APP/V717轉(zhuǎn)基因雌性小鼠，n=10)，三組均給予正常飲食。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備 姜黃素購(gòu)于上海遠(yuǎn)慕生物科技公司；鼠抗Aβ和Ptau蛋白抗體購(gòu)于Abcam公司；SP9710和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購(gòu)于福州邁新生物技術(shù)有限公司；Tunnel熒光凋亡試劑盒購(gòu)于長(zhǎng)春鼎國(guó)生物有限公司；Trizol購(gòu)于Invitrogen公司；Taq酶、DL 2000 marker和RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于塔克拉公司；引物由上海生物工程有限公司提供。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7300，Biotek公司，美國(guó))；Biometra PCR擴(kuò)增儀(Biotek公司，美國(guó))；Morris水迷宮(Panlab公司，西班牙)；OLYMPUS BX51和BX53顯微鏡(OLYMPUS公司，日本)。

1.3給藥方式和劑量 對(duì)照組和模型組每天灌胃一次生理鹽水0.1 ml，姜黃素治療組每天灌胃一次姜黃素0.1 ml(50 mg/kg)，共治療8 w。

1.4實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集和檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1各組小鼠記憶能力 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前5 d，通過(guò)Morris水迷宮連續(xù)訓(xùn)練4 d，第5天測(cè)試潛伏期，觀察小鼠記憶能力是否有改善。

1.4.2各組小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷程度 三組小鼠在治療12 w結(jié)束后，處死取腦組織，常規(guī)石蠟包埋，制備3.5 μm切片4張，一張通過(guò)蘇木素-伊紅(HE)染色普通光學(xué)顯微鏡下觀察腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷程度及攝取圖片。

1.4.3各組小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度 3.5 μm石蠟切片一張，通過(guò)Tunnel染色熒光顯微鏡下觀察腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度及攝取圖片，連續(xù)觀察200倍5個(gè)視野，計(jì)數(shù)神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分率。

1.4.4各組小鼠腦組織中Aβ和Ptau mRNA水平 Trizol提取腦組織總RNA，每個(gè)樣本基因擴(kuò)增3次，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)Aβ和Ptau mRNA水平，取Ct值均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.4.5各組小鼠腦組織中Aβ和Ptau蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度 3.5 μm石蠟切片兩張，分別通過(guò)免疫組織化學(xué)染色觀察Aβ和Ptau蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色斑塊，細(xì)胞核用蘇木精復(fù)染為藍(lán)色。通過(guò)連續(xù)觀察200倍5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性斑塊。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組Morris水迷宮測(cè)試潛伏期比較 與對(duì)照組比較，模型組潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.05)；姜黃素治療組潛伏期略延長(zhǎng)(P>0.05)，但較模型組明顯縮短(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.2各組腦組織神經(jīng)細(xì)胞損傷程度比較 HE染色可見(jiàn)對(duì)照組小鼠腦組織無(wú)神經(jīng)胞損傷，姜黃素治療組小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞固縮壞死較模型組明顯減輕，見(jiàn)圖1。

2.3各組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度比較 Tunnel染色可見(jiàn)姜黃素治療組小鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量較模型組明顯減少，較對(duì)照組略有增多；通過(guò)連續(xù)觀察200倍5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞百分率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；見(jiàn)圖2，表1。

表1 各組Morris水迷宮潛伏期、腦組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分率及Aβ和Ptau蛋白陽(yáng)性斑塊數(shù)比較

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05

圖1 各組腦組織病理學(xué)觀察(HE，×200)

圖2 各組腦組織Tunnel染色(×200)

2.4各組腦組織Aβ和Ptau mRNA水平比較 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)可見(jiàn)姜黃素治療組小鼠腦組織中Aβ mRNA(9.38±2.24)和Ptau mRNA(7.53±2.39)水平均較模型組Aβ mRNA(27.56±6.19)和Ptau mRNA(16.86±6.47)明顯降低，較對(duì)照組Aβ mRNA(3.12±0.98)和Patu mRNA(2.09±0.82)略有增多,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.5各組腦組織中Aβ和Ptau蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度比較 免疫組織化學(xué)染色可見(jiàn)姜黃素治療組小鼠腦組織中Aβ和Ptau蛋白陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度均較模型組明顯降低，較對(duì)照組略有增多；通過(guò)連續(xù)觀察200倍5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性斑塊差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見(jiàn)圖3，表1。

圖3 各組腦組織Aβ、Ptau蛋白免疫組織化學(xué)染色(DAB，×200)

3 討 論

隨著社會(huì)進(jìn)步人口老齡化、生活壓力及日常不良生活習(xí)慣的增加，AD死亡率和發(fā)病率都在逐年的上升〔6,7〕。姜黃素是從草本植物姜黃根莖中提取出的一種多酚類(lèi)化合物，以往研究表明姜黃素具有較好的生理活性，能夠降血脂、抗炎、抗腫瘤、清除自由基及在癡呆領(lǐng)域里有著潛在意義〔2，8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明姜黃素在提高AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力方面作用顯著。

AD的病理基礎(chǔ)是Aβ在腦組織神經(jīng)元細(xì)胞外的異常沉積和tau蛋白Ptau增多引起的神經(jīng)纖維纏結(jié)〔9,10〕。Aβ和Tau蛋白的異常，尤其是Tau蛋白的異常與AD發(fā)病機(jī)制緊密相關(guān)〔11〕。Aβ是一種神經(jīng)毒性物質(zhì)，它可引起氧化應(yīng)激，刺激腦組織產(chǎn)生4-羥基壬烯酸和過(guò)氧化氫(H2O2)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡；Aβ的沉積會(huì)形成老年斑，老年斑中的大量銅、鐵等金屬離子與Aβ作用又產(chǎn)生H2O2，進(jìn)一步介導(dǎo)AD患者腦組織的氧化損傷〔12〕。Tau蛋白在神經(jīng)退行性病變的誘導(dǎo)中最為關(guān)鍵，它與細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，是一種微管相關(guān)蛋白，通常以磷酸化和去磷酸化兩種形式存在，二者保持平衡狀態(tài)〔3，13～15〕；Tau蛋白位于17染色體長(zhǎng)臂，是一種磷酸基蛋白，通常含有2～3個(gè)磷酸基，當(dāng)Tau蛋白異常過(guò)度磷酸化時(shí)常含有5～9個(gè)磷酸基，喪失刺激微管聚集的生物學(xué)功能成為毒性分子，這些過(guò)度磷酸化的Tau蛋白破壞正常微管系統(tǒng)，自身聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)，引起神經(jīng)元功能損傷發(fā)生腦神經(jīng)退行性病變〔16,17〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明姜黃素能顯著提高AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力；它可能通過(guò)降低腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡程度及Aβ和Ptau基因水平對(duì)AD小鼠具有明顯的治療效果，其作用機(jī)制和作用通路有待于進(jìn)一步探討。