張 月， 張 群， 趙方方， 韓丙軍， 黃海珠

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 分析測(cè)試中心，海南 ?？?，571101； 2.海南省熱帶果蔬產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?，571101； 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部熱作產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101)

甲基硫菌靈(Thiophanate-methyl)是日本曹達(dá)公司開(kāi)發(fā)的一種廣譜內(nèi)吸苯并咪唑類殺菌劑[1]，該藥劑被植物吸收后，通過(guò)一系列的生化反應(yīng)轉(zhuǎn)化為另一種苯并咪唑類殺菌劑多菌靈(Carbendazim)，進(jìn)而干擾菌類紡錘體的形成，使病菌萌發(fā)的芽管異常，從而起到殺菌作用?？捎糜诜乐喂麡?shù)和花卉黑星病、炭疽病，對(duì)玉米大、小斑病也具有良好的防效[2-6]。甲基硫菌靈降解速度慢，殘效期長(zhǎng)，隨著農(nóng)藥廣泛應(yīng)用到水果、蔬菜和菌類作物后，產(chǎn)生的環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留問(wèn)題也引起人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注[7-9]。國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)規(guī)定：甲基硫菌靈的殘留定義為甲基硫菌靈和多菌靈殘留量之和，我國(guó)還沒(méi)有甲基硫菌靈在芒果上的殘留限量值。目前，我國(guó)關(guān)于各類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法較多，主要有紫外分光光度法[10]、超高效液相色譜法[11-15]、固相微萃取法、TurboFlow在線凈化[16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17-18]等。但甲基硫菌靈及其代謝產(chǎn)物在芒果中的殘留降解尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，利用優(yōu)化后的QuEChERS前處理方法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析法，對(duì)甲基硫菌靈及代謝物多菌靈在芒果中的殘留進(jìn)行測(cè)定，對(duì)其消解規(guī)律以及最終殘留量進(jìn)行研究，并對(duì)甲基硫菌靈行進(jìn)膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以期為芒果質(zhì)量安全提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品種 供試芒果品種為臺(tái)農(nóng)與金鳳凰。

1.1.2 儀器 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters液相和AB Sciex質(zhì)譜)，高速冷凍離心機(jī)(HITACHI CR22N日本日立)，渦旋振蕩器XH-J型(南京東邁科技儀器有限公司)，IKAT25高速分散勻漿機(jī)(上海萬(wàn)捷科技有限公司)。

1.1.3 藥品與試劑 供試農(nóng)藥為500 g/L甲基硫菌靈懸浮劑。甲基硫菌靈(純度99.0%，Labor Dr. Ehrenstorfer- Schafers·Bgm)，多菌靈(純度99.5%，Labor Dr. Ehrenstorfer- Schafers·Bgm)，乙腈(HPLC，Thermofisher)，氯化鈉(AR，上海國(guó)藥)，PSA(美國(guó)安捷倫)，甲酸(Thermofisher)，超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

田間試驗(yàn)于2015和2016年分別在海南和云南進(jìn)行。其中海南種植芒果品種為臺(tái)農(nóng)，云南種植芒果品種為金鳳凰，按《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[19]和《農(nóng)藥登記殘留田間試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》[20]要求設(shè)置芒果試驗(yàn)小區(qū)，試驗(yàn)小區(qū)按施藥劑量(低劑量和高劑量)及施藥次數(shù)(2次，3次)設(shè)置，各處理3次重復(fù)，共12個(gè)小區(qū)，每小區(qū)種植4棵樹(shù)，小區(qū)間設(shè)置隔離區(qū)，另設(shè)空白對(duì)照小區(qū)。

1.2.1 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn) 在芒果果實(shí)生長(zhǎng)至一半大小時(shí)，采用噴霧法噴施500 g/L甲基硫菌懸浮劑937.5 mg/kg，施藥1次，施藥后2 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d、21 d和28 d采集芒果全果樣品，重復(fù)3次。以隨機(jī)方式在小區(qū)內(nèi)用采集樣品，在試驗(yàn)小區(qū)(樹(shù))的不同方向(不同部位)采集2 kg生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的芒果全果，裝入樣本容器中包扎妥當(dāng)，待用。

1.2.2 最終殘留試驗(yàn) 試驗(yàn)設(shè)低劑量和高劑量2個(gè)處理，低劑量為625 mg/kg(800倍液)，高劑量為937.5 mg/kg(533.3倍液)，不同劑量處理均分別施藥2次和3次，3次重復(fù)，小區(qū)間設(shè)保護(hù)隔離區(qū)，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)間開(kāi)始第1次施藥，施藥間隔期為7 d，最后1次施藥后5 d、7 d和10 d分別采集不同處理不同小區(qū)的芒果全果進(jìn)行測(cè)定。

1.3 樣品前處理

1.3.1 樣品提取 稱取5.0 g已打碎的芒果全果樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，勻漿2 min，再加入7 g的氯化鈉，于渦旋儀上渦旋振蕩至完全混勻后，置于離心機(jī)上，以4 000 r/min的速度離心3 min，待凈化。

1.3.2 凈化過(guò)程 分別吸取5 mL樣品乙腈提取液加入到15 mLPSA管中，再置于10 000 r/min的高速冷凍離心機(jī)上離心3 min，過(guò)0.22 μm濾膜后用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.4 儀器分析條件

1.4.1 液相色譜分析條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱溫35 ℃，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣體積2.0 μL，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源ESI正離子模式掃描，MRM模式檢測(cè)，參數(shù)設(shè)置：碰撞氣CAD=6，氣簾氣(CUR)=20 psi，霧化氣(GS1，GS2)=50 psi，噴霧電壓(IS)=5 500 V，離子源溫度(TEM)=600.0℃。選擇性離子監(jiān)測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2。

1.4.3 方法檢出限及定量限 基于最小線性質(zhì)量濃度的基質(zhì)標(biāo)樣色譜圖，按3倍信噪比計(jì)算得出甲的檢出限(LOD，S/N=3)，以最小添加水平為定量限(LOQ)。

表2 串聯(lián)質(zhì)譜監(jiān)測(cè)模式下待測(cè)化合物的檢測(cè)條件

1.4.4 方法學(xué)考察 稱取芒果空白樣品，每組5個(gè)重復(fù)，在空白樣品中添加甲基硫菌靈和多菌靈的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01 mg/kg、0.10 mg/kg和1.0 mg/kg進(jìn)行添加回收率試驗(yàn)，按照1.3、1.4.1和1.4.2的方法進(jìn)行分析。

1.5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

根據(jù)文獻(xiàn)[21-22]，甲基硫菌靈的毒理學(xué)數(shù)據(jù)，ADI為0.08 mg/(kg·bw·d)，甲基硫菌靈在芒果中的最大殘留限量是1.0 mg/kg。

1.5.1 長(zhǎng)期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 長(zhǎng)期膳食攝入評(píng)估是在毒理學(xué)和殘留化學(xué)評(píng)估的基礎(chǔ)上，對(duì)居民因膳食攝入帶來(lái)的農(nóng)藥殘留對(duì)身體健康造成的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。我國(guó)的膳食攝入量主要依據(jù)衛(wèi)生部2002年發(fā)布的《中國(guó)不同人群消費(fèi)膳食分組食譜》[23]規(guī)定了一般人群某種食品的消費(fèi)量，包括蔬菜、糧谷類、薯類、千豆及豆制品、水果、畜禽類、奶及奶制品、蛋及蛋制品、魚(yú)奸類、植物油、動(dòng)物油、糖及淀粉、食鹽、醬油等各種食品的每人每日允許攝入量。確定人群的膳食結(jié)構(gòu)和食品消費(fèi)量，再分別結(jié)合殘留化學(xué)評(píng)估推薦的規(guī)范STMR或己制定的MRL，計(jì)算出國(guó)家估算每日攝入量(NEDI)，結(jié)合本試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)甲基硫菌靈進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

NEDI=∑Fi×CMRL-i

(1)

風(fēng)險(xiǎn)概率=∑NEDI/(ADI×63)×100%

(2)

式中，NEDI為農(nóng)藥的國(guó)家估算每日攝入量[m g /(kg·bw·d)]，CMRL-i為第i類農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留最大限量值(mg/kg)，F(xiàn)i為第i類農(nóng)產(chǎn)品的每人每日平均攝入量[23]。

當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)概率小于100時(shí)，提示風(fēng)險(xiǎn)是可接受的，保護(hù)水平高。當(dāng)風(fēng)險(xiǎn)概率大于100時(shí)，對(duì)消費(fèi)者健康有不可接受的風(fēng)險(xiǎn)，提示保護(hù)水平低。農(nóng)藥的ADI值引用自GB 2763-2016及CAC標(biāo)準(zhǔn)。63為成年人平均體重(kg)[24]。

1.5.2 急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 用公式(3)計(jì)算國(guó)家估計(jì)短期攝入量，公式(4)和(5)計(jì)算農(nóng)藥急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)(%ARfD)。

(3)

(4)

(5)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)，芒果單果重Ue 取0.288 8 kg，芒果個(gè)體之間變異因子v取值為3[25]。式中NESTI為國(guó)家估計(jì)短期攝入量[mg/(kg· bw·d)]；LP為芒果消費(fèi)的大份餐(kg/d),HR為最高殘留量(mg/kg),Ue為芒果單果質(zhì)量(kg),v為芒果個(gè)體之間變異因子。ARfD為急性參考劑量[mg/(kg·bw·d)]。當(dāng)%ARfD≤100%時(shí)，表示急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)可以接受，%ARfD越小，風(fēng)險(xiǎn)越?。环粗?，當(dāng)%ARfD>100%時(shí)，表示有不可接受的急性風(fēng)險(xiǎn)，%ARfD越大，風(fēng)險(xiǎn)越大。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍、檢出限及定量限

從表3可知，甲基硫菌靈和多菌靈的定量離子色譜峰面積(y)均分別與進(jìn)樣質(zhì)量濃度(x)呈線性相關(guān)。甲基硫菌靈和多菌靈在芒果中的定量限(LOQ)和檢出限(LOD)均分別為0.01 mg/kg和4.0 pg。

表3 甲基硫菌靈和多菌靈的線性方程、定量限和檢出限

2.2 方法學(xué)考察

從表4可知，甲基硫菌靈和多菌靈平均回收率分別為84.7%～112.0%和79.2%～103.0%，RSD分別為2.7%～5.8%和3.0%～4.4%。根據(jù)《農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則》[19]，0.01<農(nóng)藥殘留量≤0.1，回收率在70%～120%，RSD≤20%，0.1<農(nóng)藥殘留量≤1，回收率在70%～110%，RSD≤15%，測(cè)定方法的回收率和RSD均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)，說(shuō)明該檢測(cè)方法可靠，適用于芒果中的甲基硫菌靈和多菌靈的檢測(cè)。

表4甲基硫菌靈和多菌靈在芒果樣品中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

Table 4 Recovery and relative standard deviation of thiophanate-methyl and carbendazim in mango samples (n=5)

化合物Compounds添加水平/(mg/kg)Adding level平均回收率/%Averagerecovery rateRSD/%甲基硫菌靈 Thiophanate methyl0.0184.74.20.10112.002.71.00104.005.8多菌靈 Carbendazim0.01103.004.40.1079.203.01.0087.103.8

2.3 甲基硫菌靈在芒果中的消解動(dòng)態(tài)

種植于海南的芒果甲基硫菌靈(以多菌靈計(jì))的消解半衰期在2015和2016年分別為9.5 d和9.9 d，消解動(dòng)態(tài)方程分別為y=1.254 5e-0.073x和y=0.609 8e-0.07x，相關(guān)系數(shù)分別為0.930 7和0.856 1；種植于云南的芒果甲基硫菌靈(以多菌靈計(jì))的消解半衰期在2015和2016年分別為12.6 d和9.8 d，消解動(dòng)態(tài)方程分別為y=3.013 4e-0.055x和y=1.679 5e-0.071x，相關(guān)系數(shù)分別為0.969 4和0.859 1，甲基硫菌靈(以多菌靈計(jì))在芒果中的消解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。

2.4 最終殘留

由表5可知，在海南、云南試驗(yàn)點(diǎn)，芒果中的甲基硫菌靈殘留量均表現(xiàn)為高劑量殘留量高于低劑量殘留量，3次施藥高于2次施藥，施藥后7 d，采收時(shí)，甲基硫菌靈在芒果中的殘留中值為 0.410 mg/kg，殘留最大值為0.993 mg/kg，低于歐盟中甲基硫菌靈在芒果上的MRL值1.0 mg/kg。

表5施藥后7d甲基硫菌靈在芒果中的殘留量

Table 5 Residues of thiophanate-methyl in mango after seven days of application

年份Year地點(diǎn) Location施藥劑量/(mg/kg) Dosage施藥次數(shù)/次Application frequency殘留量/(mg/kg)Residue2015年海南62520.15330.239937.520.58730.5472016年海南62520.39430.290937.520.48030.8062015年云南62520.57630.789937.520.83130.9932016年云南62520.12030.200937.520.19130.206

2.5 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

2.5.1 長(zhǎng)期膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 在對(duì)甲基硫菌靈(以多菌靈計(jì))現(xiàn)有MRL標(biāo)準(zhǔn)對(duì)消費(fèi)者的保護(hù)水平進(jìn)行評(píng)估時(shí)，其MRL值優(yōu)先取值我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)GB 2763—2016食品中農(nóng)藥最大殘留限量[22]及《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》的統(tǒng)計(jì)，制定的甲基硫菌靈(以多菌靈計(jì))殘留限量的食物種類、相應(yīng)MRL和限量來(lái)源(表6)，結(jié)合中國(guó)農(nóng)藥登記情況和中國(guó)居民人均膳食結(jié)構(gòu)，得到普通人群甲基硫菌靈的每日理論最大攝入量為2.020 970 9 mg，占日允許攝入量的5.04%，風(fēng)險(xiǎn)概率為40.10%，表明現(xiàn)行甲基硫菌靈MRL標(biāo)準(zhǔn)對(duì)消費(fèi)者在長(zhǎng)期攝入風(fēng)險(xiǎn)方面的保護(hù)程度高，通常不會(huì)對(duì)一般人群健康產(chǎn)生不可接受的風(fēng)險(xiǎn)。

2.5.2 農(nóng)藥殘留急性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 試驗(yàn)最高殘留量采用所有處理中殘留量的最大值 0.993 mg/kg，芒果單個(gè)食品質(zhì)量取 WHO (世界衛(wèi)生組織)提供的各國(guó)的平均值 0.288 8 kg[23]，甲基硫菌靈的ARfD值采用 2017年JMPR報(bào)告確定的1 mg/(kg ·bw·d)[25]進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果 (表7)表明,芒果中甲基硫菌靈殘留對(duì)中國(guó)各類人群的短期膳食攝入暴露量為 0.002 5～0.013 0 mg/(kg ·bw·d)，雖然不同人群的評(píng)估結(jié)果有差異，兒童 (≤ 6歲)的暴露量高于其他人群，但總體均較低，僅占急性參考劑量ARfD的 0.25%～1.30%，遠(yuǎn)低于 100%，說(shuō)明急性風(fēng)險(xiǎn)很低，而且基于殘留試驗(yàn)獲得的甲基硫菌靈殘留水平均遠(yuǎn)低于芒果中甲基硫菌靈殘留在一般人群和兒童中的安全界限。

表7 甲基硫菌靈的急性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用高效液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)法對(duì)芒果中甲基硫菌靈及代謝產(chǎn)物多菌靈額殘留進(jìn)行測(cè)定，該方法重現(xiàn)性良好，靈敏度高，準(zhǔn)確度與精確度均符合農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析的要求。甲基硫菌靈在芒果中的消解動(dòng)態(tài)符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，海南芒果甲基硫菌靈半衰期2015年和2016年分別為 9.5 d和9.9 d，云南芒果甲基硫菌靈半衰期分別為12.6 d和9.8 d；最終殘留試驗(yàn)結(jié)果表明，2015年和2016年施藥后間隔期7 d，采收時(shí)，甲基硫菌靈在芒果中的殘留中值為 0.410 mg/kg，低于歐盟中甲基硫菌靈在芒果上的MRL值(1.0 mg/kg)。芒果中甲基硫菌靈殘留帶來(lái)的膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)和急性膳食攝入風(fēng)險(xiǎn)均很低，在可接受范圍內(nèi)。以上結(jié)果可為制定甲基硫菌靈在芒果中的使用規(guī)程、規(guī)范甲基硫菌靈在芒果中的使用、制定其MRL值及其加強(qiáng)對(duì)甲基硫菌靈殘留的監(jiān)管提供理論基礎(chǔ)和依據(jù)。