五福飲含藥血清對大鼠軟骨細(xì)胞腫瘤壞死因子-α 誘導(dǎo)凋亡軟骨細(xì)胞活性及基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響

汪燦鋒 葉正從 沈欽榮 韓 雷 曹國平

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是指由多種因素引起關(guān)節(jié)軟骨纖維化、脫落而導(dǎo)致的以關(guān)節(jié)疼痛為主要癥狀的一種退行性關(guān)節(jié)疾病，屬中醫(yī)“痹證”范疇，治療主要以活血通絡(luò)、溫經(jīng)散寒、滋補(bǔ)肝腎等法為主。五福飲為明代醫(yī)家張景岳治療五臟氣血不足的代表方，通過前期臨床研究證實，其治療膝OA 療效確切，但具體作用機(jī)制尚不明確[1]。本實驗采用五福飲含藥血清培養(yǎng)退變關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，研究五福飲對大鼠退變關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的影響，探討其防治關(guān)節(jié)軟骨退變的可能作用機(jī)制?，F(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級雌性Wistar 大鼠30 只，體質(zhì)量150～180g。由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2013-0016。飼養(yǎng)條件：所有大鼠均飼養(yǎng)在屏障環(huán)境內(nèi)，每籠飼養(yǎng)6只，溫度（22±2）°C，濕度50%～60%，光照每12h 明暗交替，換風(fēng)次數(shù)15～20 次/h。由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心飼養(yǎng)。實驗飼養(yǎng)室許可證號SYXK（浙）2013-0184。本實驗經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物管理與倫理委員會審核通過。

1.2 主要儀器與試劑 細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific，型號BB150），流式細(xì)胞儀（美國Becton，Dickinson and Company，型號Accuri C6），酶標(biāo)儀（美國SpectiaMax，型號CMaxPius），電泳儀（天能，型號EPS300），電泳槽（天能，型號VE 180C），轉(zhuǎn)膜儀（天能，型號VE186），普通PCR 儀（德國Eppendorf，型號Mastercycler），核酸定量儀（美國Thermo Fisher Scientific，型號Nanodrop one），實時熒光定量PCR 儀（瑞士Roche，型號LightCycler）。

Anti-Rat TNF-α（美國PeproTech，貨號500-P72，批號AD36532623），Collagen II（英國Abcam，貨號ab34712，批號GR221316-10），DMEM 高糖培養(yǎng)基（ 美 國 Hyclone， 貨 號 SH30243.01， 批 號AD24464275），胎牛血清（四季青，貨號11011-8611，批號20171203），MTT 試劑盒（BBI LIFE SCIENCES，貨號BS6334-500T，批號DB30FA0005），PBS 磷酸鹽 緩 沖 液（pH7.2 -7.4）（美 國 Hyclone 貨 號SH30256.01，批號AD22391274 ），二抗Alexa flour（594 美國Abcam，貨號ab150076，批號GR235615-2），DAPI（SIGMA，貨號D9542，批號NC45325V），RIPA 裂解液（Beyotime，貨號P0013D，批號10352），蛋白酶抑制劑（康為世紀(jì)，貨號60237，批號50321），BCA 蛋白定量試劑盒（Solarbio，貨號pc0020，批號20180328），化學(xué)發(fā)光檢測試劑（Solarbio，貨號PE0010，批號20181220），10%APS（Biosharp，貨號A600072-0025，批號DC20BA1005），PVDF 膜（瑞典GE Healthcare Life Sciences，貨號10600023，批號A16954279），Anti-collagen Ⅱ（美國abcam，貨號ab34712，批號GR198512-4），Anti-actin（華安，貨號EM21002，批號HK0824），Trizol（Sangon Biotech，貨號B548124-0500，批號E108KA7471），SYBR Green qPCR 試劑盒（康為世紀(jì)，貨號CW2601，批號H7825250），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（康為世紀(jì)，貨號cw2569m，批號30251）。

1.3 實驗藥品 硫酸氨基葡萄糖膠囊：本院藥劑科提供，商品名為伊索佳，浙江海正藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號71805311，規(guī)格：0.314g/粒。五福飲制劑：根據(jù)《景岳全書》卷五十的方藥制備：黨參、熟地各30g，炒白術(shù)、當(dāng)歸各20g，炙甘草10g，藥液濃縮至1mL 含生藥4g，由本院中藥制劑室提供。

2 實驗方法

2.1 動物分組及血清制備 2 月齡大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為生理鹽水組（生理鹽水灌胃）、硫酸氨基葡萄糖組（硫酸氨基葡萄糖灌胃）、五福飲組（五福飲灌胃），每組10 只。硫酸氨基葡萄糖成人的每天劑量依照說明書定為1.5g。按人-大鼠體表面積比值折算成相當(dāng)于人臨床劑量20 倍量，給予大鼠口飼劑量，每100g 大鼠灌胃2mL 計算給藥濃度。隔天稱重算出相應(yīng)劑量給藥物組灌胃，2 次/天，連續(xù)灌胃7 天。第7天，在灌胃2h 后予以眼球取血。經(jīng)離心、滅活、過濾除菌后，4mL 每瓶分裝，貼好各組別血清標(biāo)簽，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 軟骨細(xì)胞提取及培養(yǎng) 取2 只2 月齡雌性大鼠，脫頸處死，酒精消毒后移入超凈臺，提前備好含有1%雙抗的無菌PBS。在無菌條件下切取大鼠雙側(cè)髖、膝關(guān)節(jié)，經(jīng)PBS 液漂洗后裝入無菌離心管并迅速轉(zhuǎn)移至細(xì)胞房生物柜。清理軟骨周圍的軟組織，刀片削取關(guān)節(jié)軟骨，再次經(jīng)PBS 液清洗，剪碎至1mm3大小，裝入培養(yǎng)皿，加入膠原酶Ⅱ（0.3U/mL），37℃下恒溫消化4h。將消化后的細(xì)胞懸液經(jīng)100μm 細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，經(jīng)1000r/min 離心5min，棄上清液，分別加入含10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)液以1×105/mL 接種于培養(yǎng)瓶，置于5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)用于后續(xù)實驗。

2.3 軟骨細(xì)胞干預(yù) 培養(yǎng)第2 代軟骨細(xì)胞，分為以下四組進(jìn)行藥物處理。參考文獻(xiàn)[2]采用20μg/L 腫瘤壞死因子-α 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。分為四組：空白組采用0μg/L TNF-α+10%生理鹽水組血清；模型組采用20μg/L TNF-α+10%生理鹽水組血清；對照組采用20μg/L TNF-α+10%硫酸氨基葡萄糖組血清；觀察組采用20μg/L TNF-α+10%五福飲組血清，干預(yù)48h 后檢測相關(guān)指標(biāo)。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 Collagen II 表達(dá)檢測 細(xì)胞生長至指數(shù)期時，消化后制備細(xì)胞混懸液并計數(shù)，準(zhǔn)備鋪板。具體方法如下：6 孔板每個孔中放入無菌高潔凈度蓋玻片，以60%～70%細(xì)胞密度即每孔5×105個細(xì)胞接種于蓋玻片上，每孔體積2mL。加入1～2mL 預(yù)冷的4%多聚甲醛（PFA），固定10min 后PBS 漂洗3 次，每次5min；每孔加入1mL 0.1% Triton X-100，處理2min，2mL PBS 漂洗3 次，每次5min；每孔加入2mL 3%BSA 室溫封閉30min；每個蓋玻片上滴加80μL Collagen II 一抗（稀釋比例1:50，稀釋液5% goat serum 溶液），4℃過夜孵育；一抗孵育結(jié)束后，經(jīng)漂洗后每個蓋玻片上加入80μL 二抗（二抗稀釋比例為1：500，用5% goat serum 稀釋），室溫避光下孵育30min。后續(xù)步驟需避光操作；每孔加入2mLPBS，漂洗3 次，每次5min；每孔加入核染試劑1μg/mL DAPI 染色2min。經(jīng)PBS 漂洗后保持濕潤，放入載玻片中在顯微鏡下觀察拍照。檢測各組細(xì)胞中Collagen II 的表達(dá)。

2.4.2 細(xì)胞增殖檢測 細(xì)胞生長至指數(shù)期時，消化后培養(yǎng)基制備單個細(xì)胞混懸液并計數(shù)，以每孔1000個細(xì)胞接種到96 孔板，每孔體積200μL。細(xì)胞單層貼壁鋪滿孔底后，按照上述分組給藥分別干預(yù)24、48、72h 后，每組3 個復(fù)孔。使用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值（酶標(biāo)儀在490nm）。

2.4.3 細(xì)胞凋亡檢測 取對數(shù)生長期的軟骨細(xì)胞種植于放有無菌高潔凈度蓋玻片6 孔板，每孔2mL 工作體積，細(xì)胞接種密度為1.2×106，按上述分組分別與藥物共培養(yǎng)。各組干預(yù)后，棄培養(yǎng)液，取出蓋玻片，4%多聚甲醛室溫固定30min，PBS 清洗3 次，每次5min，1μg/mL DAPI 進(jìn)行細(xì)胞核染色2min，染色結(jié)束后PBS 清洗并用指甲油封片。顯微鏡下觀察、計軟骨細(xì)胞的凋亡數(shù)量。

2.4.4 MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA 檢測 用漩渦振蕩器將管中溶液徹底混合均勻，短暫低速離心。反應(yīng)條件：95℃，10min 變性；95℃，15s；60℃，60s；40 次循環(huán)。將以上步驟中混合好的液體加入孔板中，每個樣本的每個基因保證3 個復(fù)孔。Real time PCR儀使用ABI7500 實時熒光定量PCR 儀，PCR 程序已優(yōu)化。將以上已點好樣的8 連管板置于Realtime PCR 儀上進(jìn)行PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃，10min 變性；95℃，15s；60℃，60s；40 次循環(huán)。內(nèi)參引物均由上海生工生物有限公司設(shè)計及合成，引物設(shè)計序列：MMP -3：5' -ATGCAGGGAAAGTGACCCAC -3'，5' -CGACGCCCTCCATGAAAAGA -3'；MMP -9：5' -GTGCCCTGGAACTCACACAAC-3'，5'-CCAGAAGTA -TTTGTCATGGCAGAA -3'；MMP -13：5' -TGCTGC -ATACGAGCATCCAT-3'，5'-TGTCCTCAAAGTGAACCGCA -3'；ACTB：5' -GGGAAATCGTGCGTGACA -TT-3'，5'-GCGGCAGTGGCCATCTC-3'。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，作圖采用GraphPad Prism 6.2 軟件。兩組間比較采用兩個獨(dú)立樣本的t 檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 含藥血清對大鼠軟骨細(xì)胞Collagen II 熒光表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組、對照組和觀察組大鼠軟骨細(xì)胞Collagen II 平均熒光表達(dá)強(qiáng)度均降低（P<0.01，P<0.05）；與模型組比較，對照組和觀察組大鼠軟骨細(xì)胞Collagen II 熒光表達(dá)升高（P<0.05，P<0.01）。觀察組大鼠軟骨細(xì)胞Collagen II 熒光表達(dá)低于對照組（P<0.01），見表1，插頁圖1。

表1 各組大鼠軟骨細(xì)胞Collagen II 免疫熒光表達(dá)量比較

表1 各組大鼠軟骨細(xì)胞Collagen II 免疫熒光表達(dá)量比較

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與對照組比較，▲P<0.01；空白組：采用0μg/L TNF-α+10%生理鹽水組血清；模型組：采用20μg/L TNF-α+10%生理鹽水組血清；對照組：采用20μg/L TNF-α+10%硫酸氨基葡萄糖組血清；觀察組：采用20μg/L TNF-α+10%五福飲組血清；Collagen II：膠原蛋白II

組別空白組模型組對照組觀察組孔數(shù)3 3 3 3平均熒光強(qiáng)度值70.92±3.72 43.39±1.52**62.92±5.32*△△53.33±2.33**△▲

3.2 含藥血清對大鼠軟骨細(xì)胞增殖能力的影響 與空白組比較，24、48 和72h 給藥時間點的模型組大鼠軟骨細(xì)胞OD 值均顯著降低（P<0.01），給藥24h 后，對照組和觀察組大鼠軟骨細(xì)胞OD 值也顯著低于空白組（P<0.01）；與模型組比較，對照組和觀察組大鼠軟骨細(xì)胞OD 值稍有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。給藥48h 后，對照組和觀察組大鼠軟骨細(xì)胞OD 值均低于空白組，高于模型組（P<0.05，P<0.01）。給藥72h 后，對照組和觀察組大鼠軟骨細(xì)胞OD 值均低于空白組（P<0.05）；與模型組比較，對照組和觀察組大鼠軟骨細(xì)胞OD 值顯著升高（P<0.01）；24、48和72h 時間點觀察組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 給藥24、48、72h 各組大鼠軟骨細(xì)胞OD 值比較

表2 給藥24、48、72h 各組大鼠軟骨細(xì)胞OD 值比較

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；空白組：采用0μg/L TNF-α+10%生理鹽水組血清；模型組：采用20μg/L TNF-α+10%生理鹽水組血清；對照組：采用20μg/L TNF-α+10%硫酸氨基葡萄糖組血清；觀察組：采用20μg/L TNF-α+10%五福飲組血清；OD 值：吸光度值

組別空白組模型組對照組觀察組孔數(shù)3 3 3 3 24h 0.396±0.017 0.297±0.014**0.342±0.021**0.316±0.028**48h 0.470±0.018 0.333±0.021**0.414±0.029*△△0.394±0.028**△72h 0.570±0.031 0.361±0.014**0.510±0.035*△△0.493±0.030*△△

3.3 含藥血清對大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)DAPI 熒光染色后，熒光顯微鏡下觀察可得，空白組細(xì)胞核圓潤完整，分布均勻熒光明亮，模型組細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂，有較多不完整的細(xì)胞核，局部染色質(zhì)出現(xiàn)的熒光高度集中。對照組和觀察組的細(xì)胞核部分出現(xiàn)凝聚，有少量的核碎片。見插頁圖2。

3.4 含藥血清對大鼠軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA 水平的影響 與空白組比較，模型組、觀察組大鼠軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9、MMP-13及對照組MMP-9 mRNA 水平顯著升高（P<0.01，P<0.05）。與模型組比較，對照組和觀察組大鼠軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA 水平顯著下降（P<0.01，P<0.05）。與對照組比較，觀察組大鼠軟骨細(xì)胞MMP-3 顯著升高（P<0.05），MMP-9、MMP-13 表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA水平比較

表3 各組大鼠軟骨細(xì)胞MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA水平比較

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與對照組比較，▲P＜0.05；空白組：采用0μg/L TNF-α+10%生理鹽水組血清；模型組：采用20μg/L TNF-α+10%生理鹽水組血清；對照組：采用20μg/L TNF-α+10%硫酸氨基葡萄糖組血清；觀察組：采用20μg/L TNF-α+10%五福飲組血清；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

組別空白組模型組對照組觀察組孔數(shù)3 3 3 3 MMP-3 1.003±0.091 2.610±0.328**1.313±0.335△△1.994±0.134**△▲MMP-9 1.033±0.300 2.519±0.195**1.866±0.151*△2.000±0.053**△MMP-13 1.012±0.200 2.491±0.300**1.449±0.289△1.688±0.012**△

4 討 論

軟骨破壞是OA 的主要病理特征。關(guān)節(jié)軟骨破壞包括軟骨細(xì)胞自身降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)和炎癥滑膜、血管翳組織、浸潤的炎癥細(xì)胞通過關(guān)節(jié)滑液（synovialfluid，SF）破壞軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，兩種途徑中酶性降解細(xì)胞外基質(zhì)是軟骨破壞的主要原因[3]。研究表明，在各種蛋白酶中，MMPs 在關(guān)節(jié)軟骨破壞中起重要作用，主要表現(xiàn)為：（1）通過阻斷蛋白聚糖和Ⅱ型膠原，使得關(guān)節(jié)軟骨纖維結(jié)構(gòu)遭到破壞；（2）MMPs特異性裂解膠原分子，膠原網(wǎng)損傷，炎性因子能直接攻擊軟骨細(xì)胞，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎[4]。MMPs 家族龐大，按其作用底物，主要分為膠原酶（MMP-1、MMP-8 和MMP-13）、基質(zhì)溶解素（MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11）和明膠酶（MMP-2 和MMP-9）等亞家族，其中MMP-3、MMP-9、MMP-13 是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解中最重要的酶[5-7]。目前一些OA 的治療研究中[8-9]，通過下調(diào)MMPs 的表達(dá)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞形成，起到治療目的。通過調(diào)控MMPs 將可以延緩OA 進(jìn)展，可作為OA 中重要的治療靶點以作研究。

目前中醫(yī)藥治療OA 仍是主要的保守治療方式[10]，根據(jù)《中醫(yī)骨傷科常見病診療指南》，目前OA 中藥治療主要以活血化瘀法，溫經(jīng)散寒、養(yǎng)血通脈法，滋補(bǔ)肝腎法為主。筆者通過前期臨床治療總結(jié)，結(jié)合明代醫(yī)家張景岳《傳忠錄·治形論》中“中年修復(fù)”觀點，認(rèn)為中老年OA 的診治，需要注重強(qiáng)形體，補(bǔ)五臟氣血，遂用五福飲治療膝OA。五福飲見于張景岳的《景岳全書》，該方藥性平和，五味藥歸五臟，主治五臟氣血虧損。筆者前期在臨床取得滿意療效[1]，但其具體作用機(jī)制尚未完全清晰，本研究通過五福飲含藥血清培養(yǎng)凋亡軟骨，觀察相關(guān)指標(biāo)，探究五福飲治療OA 相關(guān)作用機(jī)制。

本研究以TNF-α 誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡為OA 的細(xì)胞模型[2]，檢測五福飲含藥血清對模型下的Collagen II 熒光表達(dá)、軟骨細(xì)胞軟骨細(xì)胞增殖、凋亡及MMPs的影響。實驗結(jié)果顯示，經(jīng)五福飲血清作用后觀察組大鼠軟骨細(xì)胞Collagen II 表達(dá)較空白組低，但較模型組高（P<0.05），與陽性藥物對照組比較，Collagen II 表達(dá)降低（P<0.05）；在軟骨細(xì)胞增殖和凋亡方面，與空白組比較，模型組細(xì)胞OD 值均顯著降低（P<0.01）而與模型組比較，對照組和觀察組細(xì)胞OD 值稍有升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；熒光染色后，顯微鏡下可觀察到空白組的細(xì)胞核圓潤完整，分布均勻熒光明亮，模型組細(xì)胞核出現(xiàn)碎裂，有較多不完整的細(xì)胞核，局部染色質(zhì)出現(xiàn)的熒光高度集中，對照組和觀察組的細(xì)胞核部分出現(xiàn)凝聚，有少量的核碎片。對照組和觀察組MMP-3、MMP-9、MMP-13 mRNA 水平較模型組顯著下降（P<0.01 或P<0.05），MMP-9、MMP-13 mRNA 表達(dá)同對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

綜上所述，通過降低軟骨細(xì)胞MMPs 的表達(dá)來延緩OA 軟骨細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，可能是五福飲治療OA 的作用機(jī)制之一。[本文受到杭州市蕭山區(qū)重大科技項目資助（No.2017213）]