100種中草藥對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌體外抑殺研究

崔淼, 劉茹, 張輝杰, 葉長鵬, 許德麟, 張其中

100種中草藥對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌體外抑殺研究

崔淼, 劉茹, 張輝杰, 葉長鵬, 許德麟, 張其中*

暨南大學(xué)水生生物研究所, 廣東省高校水體富營養(yǎng)化與赤潮防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州 510632

無乳鏈球菌()和海豚鏈球菌()給羅非魚(sp.)養(yǎng)殖帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失, 而抗生素等藥物的使用會造成細(xì)菌的耐藥性和環(huán)境污染, 因此, 研究了100種中草藥對羅非魚鏈球菌體外抑殺效果, 以篩選出替代抗生素的綠色中草藥。其中16種中草藥具有較好的抑菌作用, 但將其pH 值調(diào)至7.0±0.04后, 大部分中草藥的抑菌效果會顯著下降(<0.01), 只有桑白皮()、藿香()、豨薟草()、槐角()的抑菌效果比較明顯。將pH 值調(diào)至7.0±0.04后, 采用二倍梯度稀釋法測定這4種中草藥的最低抑菌濃度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)和最小殺菌濃度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC), 結(jié)果顯示, 桑白皮抑殺無乳鏈球菌的效果最好, MIC和MBC均為0.3906 mg·mL-1; 豨薟草抑殺無乳鏈球菌的效果次之, MIC為0.3906 mg·mL-1, MBC為0.7813 mg·mL-1; 藿香、豨薟草、槐角抑殺海豚鏈球菌的效果最好, MIC和MBC均為0.3906 mg·mL-1。

中草藥; 無乳鏈球菌; 海豚鏈球菌; 最低抑菌濃度; 最小殺菌濃度

0 前言

由無乳鏈球菌()和海豚鏈球菌()引起的羅非魚鏈球菌病[1], 給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重的損失[2], 因此, 羅非魚鏈球菌病的生態(tài)防治是一個(gè)重要的研究課題。無乳鏈球菌和海豚鏈球菌都是革蘭氏陽性球菌, 也是人畜共患的致病菌, 對人體和養(yǎng)殖羅非魚都有危害。目前在羅非魚養(yǎng)殖中, 主要利用抗生素等化學(xué)藥物對鏈球菌病進(jìn)行防治, 但長時(shí)間的化學(xué)防治不僅會誘導(dǎo)出耐藥菌株, 降低治療效果, 同時(shí)也會對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生不良的影響。而中草藥含有的次級代謝復(fù)合物, 具有抗病菌、不易誘導(dǎo)出耐藥菌株、毒副作用小、不易殘留等優(yōu)點(diǎn), 是一種環(huán)保型的抗生素替代物[3], 具有很好的開發(fā)利用價(jià)值。另外, 中草藥還可以作為一種免疫增強(qiáng)劑, 增強(qiáng)魚體對外界致病菌的抵抗力[4]。已有研究表明, 不同中草藥抑殺水產(chǎn)致病菌的效果存在較大的差異, 因此, 篩選出對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌具有較好抑殺效果的中草藥, 具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本文研究了100種中草藥對羅非魚無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的體外抑殺效果, 研究結(jié)果將為羅非魚鏈球菌病的生態(tài)防控提供重要的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

無乳鏈球菌ATCC13813、海豚鏈球菌ATCC 29178均為中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所惠贈并保存。

1.1.2 中草藥物

100種中草藥從廣州市天河區(qū)石牌佰康源大藥房購得: 夾竹桃()根、莖; 牽牛子()成熟果實(shí); 牛心樸子()根、莖; 川谷()核; 蝙蝠葛()根; 北沙參()根; 莨菪籽()種子; 黃花煙草()全株; 木鱉子()種子; 千金子()種子; 雷丸()核; 阿魏()樹脂; 大風(fēng)子()成熟種子; 辣椒()成熟種子; 濱蒿()地上部分; 地錦草()全部; 佛手()果實(shí); 槐角()干燥花及花蕾、成熟果實(shí); 積殼()成熟果實(shí); 羅布麻()干燥根; 刺毛黧豆()果實(shí); 大蒜()鱗莖; 洋甘菊()花蕾; 響鈴草()全草; 茶條槭()葉、芽; 桉葉()葉; 百里香()全草; 巖椒草()全草; 羊角藤()根或根皮; 斬龍劍()全草; 枳殼()果實(shí); 梓木草()全草; 相思子()果實(shí); 纈草()根及根莖; 望江南子()種子; 無爺藤()全草; 烏毛蕨()根莖; 水線草()全草; 松蘿()地衣體; 石楠()葉、根; 青風(fēng)藤()藤莖; 牛筋果()葉; 貓須草()莖、葉; 爵床()全草; 苦石蓮()根、莖、葉、種仁; 蛇舌草()全草; 墨旱蓮()全草; 威靈草()根莖; 藿香()莖枝; 海金沙()孢子; 桑白皮()根皮; 麥冬()根; 沙棘()果實(shí); 赤小豆()果實(shí); 瓜蔞子()種子; 豨薟草()地上部分; 藁本()根莖; 白茅根()根莖; 水牛角()犀角; 金蕎麥()根莖; 木榧子()成熟果實(shí); 火麻仁()種子; 千里光()地上部分; 北鶴虱()果實(shí); 鴉膽子()成熟果實(shí); 黃參()根; 馬勃()實(shí)體; 爐甘石()礦物; 九節(jié)茶()枝葉; 生地黃()塊根; 大血藤()藤莖; 槐花()花蕾及花; 女貞子()果實(shí); 萹蓄()莖、葉混樣; 樟腦()結(jié)晶; 苦楝()根皮、樹皮; 烏藥()根; 鎖陽()肉質(zhì)莖; 莪術(shù)()莖陀; 側(cè)柏()枝梢和葉; 石楠藤()枝葉; 山梔()果實(shí); 苦丁()葉; 青黛()莖或葉; 商路()根; 狗脊()根莖; 雞冠花()花; 老鸛草()全草; 川烏()根; 積雪草()全草; 雞骨草()全株; 路路通()果實(shí); 金錢草()干燥全草; 紫荊花()花; 黃連()根莖; 訶子()果實(shí); 布渣葉()葉; 小通草()莖髓; 絲瓜絡(luò)()果實(shí); 浮小麥()果實(shí)。

1.1.3 培養(yǎng)基

腦心浸萃液體培養(yǎng)基(BHI)37 g, 超純水1000 mL, 高溫高壓(121 ℃, 0.5 MPa, 20 min)滅菌。固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中加瓊脂粉(13 g·L-1)。

1.2 方法

1.2.1 菌液的制備

將無乳鏈球菌和海豚鏈球菌分別接種于BHI液體培養(yǎng)基中, 在28 ℃恒溫?fù)u床中(200 r·min–1)培養(yǎng)24 h, 再用平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù), 并用液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至1×107cfu·mL–1, 存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 中草藥的制備

將100種中草藥烘干粉碎后各稱取20 g, 加入450 mL乙醇(100%)過夜浸泡, 濃縮、干燥后調(diào)濃度為0.2 μg·mL-1, 存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.3 體外抑菌研究

用瓊脂擴(kuò)散法[5]測定100種中草藥物抑殺無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的效果。即首先用移液器取100 μL的菌液于BHI固體培養(yǎng)基上, 用涂布棒涂布均勻后靜置至無液體流動, 然后用6 mm的打孔器在上面均勻打出四個(gè)孔。在一個(gè)孔中加入30 μL的乙醇作為對照孔, 其余三個(gè)孔中各加入等量的中草藥液, 用封口膜封口后放于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24個(gè)小時(shí), 之后用游標(biāo)卡尺測量并記錄抑菌圈直徑。選取有效抑菌的中草藥物, 測定其原始pH值后, 通過邊滴加稀釋配制的5 mol·L-1的氫氧化鈉溶液, 邊測定中草藥液的pH值, 將其pH值調(diào)至7.0左右(7.0±0.04), 再測量其抑菌直徑。中草藥抑菌效果的標(biāo)準(zhǔn)為: 抑菌圈直徑≥20 mm 為強(qiáng)抑菌作用; 15 mm— 20 mm為中等抑菌作用; 10 mm—15 mm 為弱抑菌作用; <10 mm 為無抑菌作用[6]。

1.2.4 最低抑菌濃度(Minimum Inhibitory Concen-tration, MIC)

比較并選取調(diào)pH值至7.0±0.04后, 能有效抑菌的中草藥物, 用二倍梯度稀釋法[7]測定其最低抑菌濃度(MIC值)和最小殺菌濃度(MBC值)。選用的中草藥各為一組, 每組取11支試管并進(jìn)行編號, 向編號1的試管中加入液體培養(yǎng)基740 μL和中草藥提取物60 μL, 再向其余各管中加入液體培養(yǎng)基800 μL, 各管充分混勻后, 用移液器取1號試管中的混合液800 μL于2號試管中, 再次充分混勻。以此重復(fù), 吸取最后一支試管中的800 μL丟棄, 再向各管中加入菌液各200 μL。另向?qū)φ展?中加入1 mL的液體培養(yǎng)基, 對照管2中加入800 μL的液體培養(yǎng)基和200 μL的菌液。然后置于28 ℃恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)24 h, 混勻后吸取100 μL培養(yǎng)液涂布在相應(yīng)的培養(yǎng)基上, 再置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h, 觀察各培養(yǎng)基上無菌生長的最高稀釋管所對應(yīng)的藥物濃度即是最低抑菌濃度(MIC)。

1.2.5 最小殺菌濃度(Minimum Bactericidal Concen-tration, MBC)

在測定最低抑菌濃度MIC的試驗(yàn)基礎(chǔ)上再培養(yǎng)24 h, 無菌生長的最高稀釋濃度為最小殺菌濃度MBC。之后進(jìn)行驗(yàn)證, 即取MBC和更高稀釋濃度各100 μL, 涂布在相應(yīng)培養(yǎng)基上于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h, 此時(shí)MBC所對應(yīng)的培養(yǎng)基無菌生長即驗(yàn)證正確, 否則失敗需要重新測定。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS 22.0的成對樣本T檢驗(yàn)(Paired-Samples T Test)分析數(shù)據(jù), 其檢驗(yàn)水平是0.01<<0.05為差異顯著,<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 100種中草藥物的抑菌效果

測定的100種中草藥物中能有效抑菌的中草藥有16種(表1)。其中有效抑制無乳鏈球菌的中草藥物有3種, 效果最好的分別為黃連()、積殼()、桑白皮(); 有效抑制海豚鏈球菌的中草藥物有6種, 效果最好的分別為槐角()、藿香()、豨薟草()、桑白皮()、槐花()、訶子()。將中草藥提取物pH值調(diào)至7.0±0.04后, 其抑菌效果均顯著性減弱(<0.05)或極顯著性減弱(<0.01) (表1)。

表1 16種中草藥對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的抑菌效果

注: *表示調(diào)節(jié)藥液pH前后抑菌圈直徑差異顯著, 0.01<<0.05; **表示調(diào)節(jié)藥液pH前后抑菌圈直徑差異極顯著,<0.01。抑菌圈直徑用平均數(shù)(Mean)和方差(SD)表示。

2.2 最低抑菌濃度和最小殺菌濃度

根據(jù)調(diào)pH值前后的抑菌效果挑選出4種抑菌效果好的中草藥, 用二倍梯度稀釋法測得其對兩種鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC), 結(jié)果如表2所示。將中草藥提取物pH值調(diào)至7.0± 0.04后, 桑白皮抑殺無乳鏈球菌的效果最好, MIC和MBC均為0.3906 mg·mL-1; 豨薟草抑殺無乳鏈球菌的效果次于桑白皮, 其MIC為0.3906 mg·mL-1, MBC為0.7813 mg·mL-1; 藿香和槐角抑殺無乳鏈球菌的效果次于豨薟草, 其MIC和MBC均為0.7813 mg·mL-1。而藿香、豨薟草、槐角抑殺海豚鏈球菌的效果最好, 其MIC和MBC均為0.3906 mg·mL-1;桑白皮抑殺海豚鏈球菌的效果次于藿香、豨薟草、槐角, 其MIC為0.3906 mg·mL-1, MBC為0.7813 mg·mL-1。

3 結(jié)論與討論

100種中草藥提取物的初始pH值在4.07—6.84之間, 藥液呈酸性, 但調(diào)pH值至7.0±0.04后, 結(jié)果顯示部分中草藥物的抑菌效果減弱, 這與陳輝[8]和華亞南[9]研究的中草藥體外抑菌結(jié)論相符。推測其原因可能是: 無乳鏈球菌和海豚鏈球菌都是革蘭氏陽性菌, 其適宜生長在pH值為7—8的環(huán)境中[10], 而中草藥初始提取物的酸性性質(zhì), 則抑制了無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的生長繁殖[11]。因此將中草藥物的pH值調(diào)至7.0±0.04, 可以避免中草藥物的酸性性質(zhì)帶來的干擾[12]。將中草藥物的pH值調(diào)至7.0±0.04后, 能更加準(zhǔn)確而有效地篩選出抑菌效果強(qiáng)的中草藥。

無乳鏈球菌和海豚鏈球菌是羅非魚的主要致病菌, 本文比較了100種中草藥對兩種病原菌的抑菌圈直徑, 其中桑白皮、藿香、槐角和豨薟草對兩種羅非魚鏈球菌均有明顯的抑殺效果。有研究顯示, 補(bǔ)骨脂、博落回、五倍子、三顆針、紫草、田七須等中草藥物對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌均有較好的抑殺作用[13], 這是否表明它們抑殺兩種鏈球菌的中草藥活性成分具有相同或相似性, 有待進(jìn)一步深入研究。本研究結(jié)果顯示, 桑白皮和豨薟草對無乳鏈球菌的抑殺效果最佳, 藿香、槐角、豨薟草對海豚鏈球菌的抑殺效果最佳。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明抑殺兩種羅非魚鏈球菌的最佳中草藥有一定的差異, 推測此可能與不同中草藥本身含有的不同的抑菌成分有關(guān)。

桑白皮提取物中含有多糖、黃酮、甾醇等中草藥成分, 已有研究顯示桑白皮提取物甾醇對大腸桿菌有一定的抑殺作用[14], 本研究的桑白皮乙醇提取物對無乳鏈球菌的抑殺效果最佳, 但目前對桑白皮的抑菌成分研究還較少, 尚需進(jìn)一步研究其抑菌機(jī)理及機(jī)制。豨薟草抑殺無乳鏈球菌的效果僅次于桑白皮, 其主要抑菌活性成分是二萜類和苷類, 豨薟草的甲醇提取物能抑殺金黃色葡萄球菌, 可以特異性地抑殺革蘭氏陽性菌[15], 而無乳鏈球菌和海豚鏈球菌都是兼性厭氧型的革蘭氏陽性菌, 這也就解釋了豨薟草醇提物對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌均能有效抑殺的原因。藿香提取物中的主要成分含有甲基胡椒酚、烯、醇、酮等, 可以有效抑制蠟樣芽孢桿菌和變形鏈球菌[16], 這些活性成分類似于細(xì)胞膜上的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu), 根據(jù)相似相溶原理, 其胞內(nèi)物質(zhì)很容易外泄而造成細(xì)菌死亡[17], 本研究結(jié)果表明, 藿香對無乳鏈球菌的抑殺效果最佳?；苯堑囊掖继崛∥镏兄饕悬S酮, 其在pH值為7.0左右的條件下可以破壞細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu), 使胞內(nèi)物質(zhì)泄出而造成細(xì)胞代謝紊亂, 從而抑制細(xì)菌的生長繁殖[18-19],因此槐角的醇提物也可以有效抑殺海豚鏈球菌。

不同中草藥含有的抗菌物質(zhì)不同, 其抑菌機(jī)理也各有差異, 每種中草藥對不同細(xì)菌的抑菌效果也不盡相同, 因此需要通過試驗(yàn)篩選出抑菌效果最佳的中草藥。已有研究表明, 不同中草藥物含有的不同抑菌成分可以共存以形成協(xié)同效應(yīng), 從而增強(qiáng)抑殺致病菌的作用[20], 這就需要進(jìn)行復(fù)方篩選試驗(yàn)以優(yōu)化抗菌中草藥的防治效果。利用綠色環(huán)保的中草藥物可以代替抗生素等化學(xué)藥物有效抑菌, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 中草藥提取物在體外表現(xiàn)出明顯的抑菌作用, 但中草藥是否可以直接應(yīng)用于實(shí)際的水產(chǎn)養(yǎng)殖, 還需要進(jìn)行體內(nèi)抑菌試驗(yàn)。中草藥物的抑菌成分在實(shí)際應(yīng)用中會受到環(huán)境因素和生物體因素的影響, 因此中草藥物的開發(fā)還需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究。

表2 四種中草藥對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)

中草藥的抑菌效果好、綠色環(huán)保, 可以被開發(fā)為綠色生態(tài)漁藥, 具有較好的應(yīng)用前景。通過100種中草藥的體外抑菌試驗(yàn), 探究了抑殺無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的不同中草藥效果, 為篩選出有效抑殺無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的中草藥提供了重要的參考資料。

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Efficacy of 100 Chinese herbal medicines againstandin vitro

CUI Miao, LIU Ru, ZHANG Huijie, YE Changpeng, XU Delin, ZHANG Qizhong*

Institute of Hydrobiology,Jinan University, Key Laboratory of Eutrophication and Red Tide Prevention of Guangdong Higher Education Institutes, Guangzhou 510632, China

With the development of selective and intensive culture, tilapia have been reported to be severely infected by pathogenicand. The resultant streptococcosis outbreak is one of the key fish diseases with high mortality rates, and results in severe economic losses as high as ten billion dollars annually. Chinese herbal medicines have been widely acknowledged as a promising strategy owing to multiple advantages in environment, ecology and safety aspects. In this study, extracts of 16 Chinese herbal medicines were discovered to show anti-Streptococcus activities in vitro, after the pH values were adjusted to 7.0±0.04, the antibacterial effect of most Chinese herbal medicines decreased significantly (<0.01), only,,,, which had well antibacterial efficacy.had the best effect against, with the minimal inhibitory concentration (MIC) and the minimal bactericidal concentration (MBC) of 0.3906 mg·mL-1. The efficacy ofagainstwas second, with MIC of 0.3906 mg·mL-1and MBC of 0.7813 mg·mL-1;,,had the best efficacy against, with both MIC and MBC of 0.3906 mg·mL-1.

Chinese herbal medicine;;; Minimum Inhibitory Concentration (MIC); Minimum Bactericidal Concentration (MBC)

10.14108/j.cnki.1008-8873.2019.04.011

Q939.1

A

1008-8873(2019)04-071-06

2019-05-17;

0000-00-00

廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新重大專項(xiàng)民生科技專題 (201604020029, 201804010494); 廣東省海洋與漁業(yè)廳科技項(xiàng)目 (A201601B05, SDYY-2018-08)

崔淼(1979—), 男, 博士, 副研究員, 主要從事水產(chǎn)動物免疫學(xué)研究, E-mail: cuisanshui@163.com

張其中, 男, 博士, 教授, 主要從事分子免疫學(xué)研究, E-mail: Zhangqzdr@126.com

崔淼, 劉茹, 張輝杰,等. 100種中草藥對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌體外抑殺研究[J]. 生態(tài)科學(xué), 2019, 38(4): 71-76.

CUI Miao, LIU Ru, ZHANG Huijie, et al. Efficacy of 100 Chinese herbal medicines againstandin vitro[J]. Ecological Science, 2019, 38(4): 71-76.