郝洲華， 盧曉明， 孟 浦， 鐘嚴艷， 李曉南， 李 盛

(1華中科技大學醫(yī)院外科， 湖北 武漢 430074； 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院 2消化腫瘤外科， 3全科， 湖北 武漢 430022； 4華中科技大學醫(yī)院全科， 湖北 武漢 430074)

慢性腎疾病在成人中是一種發(fā)病率較高的疾病，糖尿病、炎癥和毒性物質(zhì)等因素均可導致慢性腎疾病的發(fā)生，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢[1-3]。慢性腎疾病的普遍特征為腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[4]，其中腎間質(zhì)纖維化的主要成因是肌成纖維細胞的增殖和激活所造成的細胞外基質(zhì)的過度產(chǎn)生，這是纖維化時疤痕組織的主要成分[5]。肌成纖維細胞是細胞外基質(zhì)發(fā)生沉積的主要效應分子。在適當刺激誘導下，多種細胞可以轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞，比如血管周細胞、平滑肌細胞、上皮細胞和成纖維細胞等[6-8]。因此，深入了解肌成纖維細胞的特性，尤其是其形成過程對于理解慢性腎疾病的發(fā)生和發(fā)展過程是一個十分必須而迫切的事件，也可以為慢性腎疾病的治療提供可能候選的靶點。

隨著對精準醫(yī)療認識的不斷深入，疾病診斷以及治療反應性的生物標志物的鑒定顯得至關重要[9]。微小RNA(microRNA，miRNA，miR)是一種大約為22 nt的非編碼小RNA，主要在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達[10]。研究表明，miRNAs廣泛參與到慢性腎疾病的發(fā)生和發(fā)展中，比如慢性腎疾病中常伴有miR-21的上調(diào)表達[10]；miR-148a的異常表達與腎移植后功能失調(diào)密切相關[11]；miR-328的上調(diào)表達可以抑制腎纖維化[12]。

miR-129的轉(zhuǎn)錄本有2個，分別為miR-129-1和miR-129-2。經(jīng)過在5’端和3’端的加工處理后可以形成2個成熟的miRNAs：miR-129-5p和miR-129-3p[13]。最近的研究發(fā)現(xiàn),miR-129-3p可通過促進細胞的侵襲和遷移等過程參與到各種腫瘤的發(fā)生過程中，而miR-129-5p卻無此效應[13-14]，但是miR-129在慢性腎疾病的功能研究資料卻相對匱乏。本研究中我們利用轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)誘導成纖維細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞模型，以評估m(xù)iR-129在此過程中所扮演的角色和相關分子機制。

材 料 和 方 法

1 腎組織樣本獲取

取腎癌患者經(jīng)過手術切除的腎癌組織旁的腎組織(距腎癌浸潤邊緣2.5 cm)；且該組病人在手術前經(jīng)過正常尿常規(guī)檢測，其結果均為正常。腎纖維化組織取自于糖尿病引起的腎纖維化患者。每組個體數(shù)均為8。

2 細胞和實驗試劑

小鼠成纖維細胞系NIH3T3購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。高糖DMEM培養(yǎng)基(12100046)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS;16000-044)和谷氨酰胺(35050-061)購自Gibco；MTT購自武漢博士德；TRIzol? Reagent(15596026)購自Invitrogen；dNTP Mix(D7295)購自Sigma-Aldrich；反應緩沖液和逆轉(zhuǎn)錄酶(EP0041)、M-PER哺乳動物蛋白提取液試劑盒(78503)和Lipofectamine 3000(L3000001)購自Thermo Fisher Scientific；SuperReal PreMix試劑盒(FP202-01)購自北京天根生化公司；miR-129-3p和miR-129-5p的引物均購自廣州市銳博生物科技有限公司；抗Ki-67(ab15580)和Smad3(ab40854)抗體購自Abcam；抗α-tubulin(AP0064)抗體購自Bioworld；雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炘噭┖?E1910)購自Promega。

3 實驗方法

3.1細胞培養(yǎng) NIH3T3細胞培養(yǎng)于含10% FBS和2 mmol/L谷氨酰胺的高糖DMEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)環(huán)境的溫度為37 ℃， CO2含量為5%，相對濕度為95%。

3.2MTT法檢測miR-129-3p對NIH3T3細胞活力的影響 當細胞處于對數(shù)生長期時，以每孔4 000個細胞的密度接種于96孔板中。細胞靜置貼壁后給予刺激，刺激結束后在每孔中加入10 μL濃度為5 g/L的溶液(PBS緩沖液為溶劑)，避光孵育4 h后，徹底去除上清，每孔加入100 μL DMSO溶液以充分溶解紫色甲臜結晶。利用多功能酶標儀在570 nm處檢測各孔吸光度(A)值。

3.3劃痕實驗檢測miR-129-3p對NIH3T3細胞遷移能力的影響 細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，給予相應處理后使用200 μL移液槍槍頭直接在中部劃直線，并做好標記以確定相對位置。在細胞培養(yǎng)48 h后，在顯微鏡(Nikon， CKX53)下直接觀察細胞重新覆蓋空白區(qū)域的范圍以評估其遷移能力。

3.4RT-qPCR法檢測miR-129-3p和miR-129-5p的表達 按照TRIzol?試劑說明書提取組織或者細胞中總RNA。使用DEPC處理過的ddH2O將上述RNA溶解，測定濃度后以1 μg總RNA 20 μL體系進行逆轉(zhuǎn)錄反應。具體為將總RNA、Oligo dT和DEPC水共13 μL充分混合均勻，在65 ℃反應5 min。之后分別加入dNTP Mix、反應緩沖液和逆轉(zhuǎn)錄酶共7 μL，再次混勻，42 ℃反應60 min后在70 ℃反應10 min以終止反應。使用此過程獲得的cDNA，按照SuperReal PreMix試劑盒說明書進行實時定量PCR以檢測相應基因的mRNA表達水平。miR-129-5p的正向引物序列為5′-GGATGGCTGCTGTCTCCTT-3′，反向引物序列為5′-GGGCTTCCTGACTACTGTTGA-3′； miR-129-3p的正向引物序列為5′-AGGGTTCGGAGACATCCTG-3′，反向引物序列為5′-GGCTTCCGGCTATTGAGTTA-3′；U6 的正向引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列為 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應程序參數(shù)為95 ℃預變性10 min后，進入以下循環(huán)：95 ℃反應10 s、62 ℃反應30 s、72 ℃反應10 s；經(jīng)歷40次循環(huán)后緩慢升溫至95 ℃。反應結束后，按照2-ΔΔCt法計算各個基因相對表達量。

3.5Western blot法檢測Ki-67和Smad3的蛋白表達水平 細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，給予相應處理后按照M-PER哺乳動物蛋白提取液試劑盒說明書提取細胞總蛋白質(zhì)。利用BCA法將各組樣品定量至相同濃度后，分別取15 μg蛋白質(zhì)進行SDS-PAGE。之后利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫以5%脫脂奶粉封閉1 h后，加入相應 I 抗4 ℃條件下封閉過夜。次日洗滌后室溫孵育相應 II 抗1 h，之后利用化學發(fā)光成像法進行成像。

3.6瞬時轉(zhuǎn)染法檢測miR-129-3p的功能 NIH3T3細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，細胞貼壁后以轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染miR-129-3p的模擬物或者抑制劑片段。按照說明書進行操作，在細胞中加入miR-129-3p 模擬物或者抑制劑片段與Lipofectamine RNAiMAX的混合物后，6～8 h后更換為新鮮培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。后續(xù)給予相應刺激以驗證miR-129-3p的功能。

3.7雙螢光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-129-3p靶基因Smad3將Smad3基因3’-UTR中與miR-129-3p結合的部位克隆至pGL3質(zhì)粒，或?qū)⑵浣Y合位點進行突變后再克隆至pGL3質(zhì)粒；上述操作將獲得pGL3-Smad3野生型或者突變型載體。NIH3T3細胞接種于24孔板中貼壁后以Lipofectamine 3000共轉(zhuǎn)染pGL3-Smad3各種質(zhì)粒載體和miR-129-3p模擬物質(zhì)粒。共同培養(yǎng)48 h后，根據(jù)試劑盒說明書操作以檢測相應螢光素酶活性。

4 統(tǒng)計學處理

各項實驗均進行獨立重復3次或者以上，利用Graphpad Prism軟件進行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計。實驗數(shù)據(jù)符合方差齊，用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。2組實驗比較采用成組t檢驗，多組定量數(shù)據(jù)之間倆倆比較的差單因素方差分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 miR-129-3p在腎纖維化患者腎組織樣本中的表達顯著下調(diào)

RT-qPCR結果顯示， miR-129-3p在腎纖維化患者腎組織中的表達量下降至腎癌旁組織對照組的38%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1A。而與腎癌旁組織相比，miR-129-5p在腎纖維化患者腎組織樣本中的相對表達量，差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖1B。進一步分析發(fā)現(xiàn)，腎癌旁組織對照組的miR-129-5p與miR-129-3p的表達量具有正相關性(r=0.598)，腎纖維化組織miR-129-5p與miR-129-3p的表達量具有負相關性(r=-0.310)。

Figure 1.miR-129-3p (A), but not miR-129-5p (B), was down-regulated in the renal tissues from the patients with diabetic nephrofibrosis. RT-qPCR was used to detect the relative expression levels of miR-129-3p and miR-129-5p in the renal tissues from the renal cell carcinoma (RCC)-adjacent tissues of control subjects and the patients with diabetic nephrofibrosis. Mean±SD.n=8.**P<0.01vsRCC-adjacent tissues.

圖1 腎纖維化患者腎組織中miR-129-3p表達量顯著下調(diào)

2 miR-129-3p在肌成纖維細胞中表達下調(diào)

為了探討miR-129-3p的下調(diào)在腎纖維化過程中的意義，根據(jù)文獻[4]我們在NIH3T3細胞中給予10 μg/L TGF-β1誘導成纖維細胞NIH3T3 48 h后使其轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞。接下來，我們采用RT-qPCR方法對miR-129-3p和miR-129-5p的表達分別進行檢測，結果顯示TGF-β1處理48 h后，miR-129-3p的表達水平呈現(xiàn)下降趨勢(P<0.01)，見圖2A；與在腎纖維化組織樣本中的檢測結果類似，miR-129-5p的表達也沒有明顯改變，見圖2B。

Figure 2.miR-129-3p (A), but not miR-129-5p (B), was down-regulated in the NIH3T3 cells treated with TGF-β1 at 10 μg/L for 48 h. The relative expression of miR-129-3p and miR-129-5p was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2 TGF-β1處理的NIH3T3 細胞中存在miR-129-3p的表達下調(diào)

3 上調(diào)miR-129-3p的表達在TGF-β誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞過程中抑制細胞活力

為了探討miR-129-3p的表達是否與腎纖維化直接相關，我們在NIH3T3細胞給予TGF-β1誘導的同時給予miR-129-3p模擬物(使miR-129-3p水平升高，見圖3A)以觀察其對TGF-β誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞過程中細胞活力的影響。MTT結果顯示，在給予miR-129-3p模擬物之后，不管是否存在TGF-β刺激，細胞活力均有所下降(P<0.05)，見圖3B。由于在各處理組中并沒有觀察到明顯的細胞死亡現(xiàn)象，于是我們推測miR-129-3p模擬物對NIH3T3細胞活力的抑制作用可能與其抑制細胞增殖有關。為了驗證以上設想，我們對Ki-67的表達進行了檢測。與上述MTT結果一致，給予miR-129-3p模擬物后，不管是否存在TGF-β1刺激，Ki-67的表達均明顯減少，見圖3C。以上結果說明在腎纖維化過程中，上調(diào)miR-129-3p表達在TGF-β誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)分為肌成纖維細胞過程中可抑制細胞活力。

4 上調(diào)miR-129-3p表達在TGF-β誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞過程中抑制細胞遷移

劃痕實驗結果顯示，給予miR-129-3p的模擬物之后，細胞的遷移行為被明顯抑制。單獨給予miR-129-3p模擬物可以使得NIH3T3細胞的遷移能力下降；而NIH3T3細胞被TGF-β1誘導后，其遷移能力受到抑制，miR-129-3p模擬物和TGF-β1同時存在時則被進一步抑制，見圖4。

5 miR-129-3p負調(diào)控靶基因Smad3表達

利用在線生物信息學軟件TargetScan對miR-129-3p的靶點進行了預測。由于TGF-β/Smad3信號通路在成纖維細胞轉(zhuǎn)化為肌纖維細胞過程中發(fā)揮著重要作用[15-16]，于是我們推測miR-129-3p可以作用于Smad3從而參與肌成纖維細胞的增殖和遷移。如圖5A所示,miR-129-3p與Smad3的3′-UTR存在結合位點。圖5B顯示,雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灤_定Smad3為miR-129-3p的直接作用靶點：在共同轉(zhuǎn)染pGL3-Smad3質(zhì)粒與miR-129-3p前體質(zhì)粒時，螢光素酶活性顯著下降；而在共同轉(zhuǎn)染Smad3 3′-UTR突變質(zhì)粒與miR-129-3p前體質(zhì)粒時，螢光素酶活性與對照組的差異無統(tǒng)計學顯著性。最后，我們在NIH3T3細胞中分別瞬時轉(zhuǎn)染miR-129-3p的模擬物和抑制劑，并對Smad3的蛋白質(zhì)表達水平進行了檢測，發(fā)現(xiàn)miR-129-3p的抑制劑可以增加Smad3的表達水平(P<0.01)；而miR-129-3p的模擬物可使得Smad3的表達水平下降，見圖5C～E。

接下來我們直接驗證了miR-129-3p是否可以通過靶向Smad3抑制TGF-β誘導的肌成纖維細胞的生長和遷移能力。首先，NIH3T3細胞中，在TGF-β1的刺激下，給予scrambled miRNA、miR-129-3p抑制劑或miR-129-3p抑制劑+Smad3干擾片段，結果顯示，在給予miR-129-3p抑制劑之后，不管是細胞增殖標志物Ki-67的表達水平還是劃痕實驗所示的細胞遷移能力均有所增加；而在同時給予Smad3的干擾片段可以明顯取消miR-129-3p抑制劑的效應，見圖6。

Figure 3.Up-regulation of miR-129-3p inhibited the viability of NIH3T3 cells during TGF-β-induced transformation into myofibroblasts. A: the over-expression efficacy of miR-129-3p mimic; B: MTT assay showing the decreased viability of TGF-β1-stimulated NIH3T3 cells after co-incubation with miR-129-3p mimic; C: Western blot for determining the protein expression of Ki-67 in the NIH3T3 cells after TGF-β1 treatment with or without transfection with miR-129-3p mimic. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscrambled miRNA group;#P<0.05vsTGF-β1+scrambled miRNA group.

圖3 上調(diào)miR-129-3p在TGF-β誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞過程中抑制細胞活力

Figure 4.Up-regulation of miR-129-3p inhibited NIH3T3 cell migration during TGF-β-induced transformation of into myofibroblasts. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsscrambled miRNA group;#P<0.05vsTGF-β1+scrambled miRNA group.

圖4 上調(diào)miR-129-3p表達在TGF-β誘導NIH3T3細胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞過程中抑制細胞遷移

Figure 5.miR-129-3p directly targeted 3’-UTR of Smad3 and negatively regulated its expression. A: TargetScan software predicting binding sites between Smad3 3’-UTR and miR-129-3p; B: dual-luciferase reporter assay showing the relative luciferase activity of Smad3-WT and Smad3-mutant; C: knock-down efficacy of miR-129-3p inhibitor; D and E: miR-129-3p inhibitor increased the expression of Smad3 at protein level, whereas miR-129-3p mimic had the opposite effect. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsscrambled miRNA group;##P<0.01vspGL3-control group.

圖5 miR-129-3p直接靶向于Smad3 3’UTR并負性調(diào)控其表達

討 論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在腎纖維化患者腎組織樣本以及成纖維細胞NIH3T3轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細胞的過程中，miR-129-3p均呈現(xiàn)下調(diào)表達的趨勢；在給予miR-129-3p的模擬物之后可以顯著抑制(肌)成纖維細胞的活力和遷移行為。因此，我們的數(shù)據(jù)提示，在慢性腎疾病的病理進程中，miR-129-3p的下

Figure 6.miR-129-3p inhibited the growth and migration of myofibroblasts by directly targeting Smad3. miR-129-3p inhibitor promoted the protein expression of Ki-67 (A) and migration ability (B), which was reversed by knock-down ofSmad3expression. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsTGF-β1+scrambled miRNA group;#P<0.05vsTGF-β1+miR-129-3p inhibitor group.

圖6 miR-129-3p通過靶向Smad3抑制TGF-β誘導的肌成纖維細胞的生長和遷移

調(diào)表達與腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展相關。本研究為慢性腎疾病的分子病理機制提供了新的解釋，同時也為其治療提供了可能候選靶點。

miR-129轉(zhuǎn)錄本的另一成熟體miR-129-5p盡管是其主要產(chǎn)生形式[14]，但在本研究模型中我們并沒有發(fā)現(xiàn)其表達有顯著改變，且在各組樣本中miR-129-5p的相對表達量均高于miR-129-3p。除此之外，我們的數(shù)據(jù)也顯示在腎癌旁正常腎組織中，miR-129-5p與miR-129-3p表達量的相關性(r=0.598)強于腎纖維化組織(r=-0.310)中，這提示我們除了miR-129-3p的下調(diào)參與到了慢性腎疾病的病理進程中，miR-129-5p與miR-129-3p的表達比例失調(diào)可能也是其中一個因素。

TGF-β在纖維化疾病[17]以及在細胞活力過程[18]中扮演至關重要的角色。我們的數(shù)據(jù)顯示miR-129-3p可通過抑制TGF-β下游信號分子Smad3的表達調(diào)控細胞的活力和遷移行為。同時，在給予TGF-β刺激后，miR-129-3p對細胞增殖和遷移行為的抑制進一步加劇。最近研究表明miR-129-3p與miR-129-5p都可以通過調(diào)控細胞周期進而起到抑制細胞生長作用[19]。我們推測，miR-129-3p也可能通過調(diào)控TGF-β信號通路從而發(fā)揮抑制細胞活力和遷移的效應。

綜上所述，我們的研究表明miR-129-3p的下調(diào)表達是慢性腎疾病病理進程中的一個重要事件，這為理解慢性腎疾病的分子機制提供了新途徑，也為其干預治療提供了可能靶點。