陳鐘 何艷△ 周國強 周泉

(1.長沙市第一醫(yī)院，湖南 長沙 410000；2.中南大學湘雅二醫(yī)院，湖南 長沙 410000)

艾滋病(AIDS/HIV)合并馬爾尼菲青霉菌(penicillium marneffei，PM)感染是由于艾滋病患者免疫缺陷而導致的一種廣泛播散性感染，病死率較高，早期診斷和治療直接影響其預(yù)后[1-2]。馬爾尼菲青霉菌病(penicilliosis marneffei，PSM)的診斷金標準主要是病原學培養(yǎng)，但血液病原培養(yǎng)陽性率并不高而且費時[3]；組織活檢可提高培養(yǎng)陽性率，但為有創(chuàng)性操作結(jié)果也需要數(shù)天，臨床操作有一定難度，因此有必要建立一種簡單快速的血清學檢測方法和指標用于早期診斷HIV-PSM，本文擬通過檢測不同階段艾滋病患者血清中的腺苷脫氨酶酶(adenosine，ADA)及其同工酶(ADA1和ADA2)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate amino transferase，AST)的活性；以探索早期診斷艾滋病合并馬爾內(nèi)菲青霉菌病的血清學指標，以便早期治療改善預(yù)后。

1 對象和方法

1.1研究對象 本研究納入2015年1月至2016年3月我院收治的艾滋病患者共158例，其中HIV感染組62例(無機會性感染)，其中男41例，女21例，年齡19～53歲，平均(32.51±5.23)歲；AIDS患者組43例(有機會性感染但非馬爾尼菲青霉菌)，其中男40例，女3例，年齡19-53歲，平均(31.47±7.12)歲；艾滋病合并馬爾尼菲青霉菌患者53例(HIV-PSM組)，其中男43例，女10例，年齡20～53歲，平均(37.94±11.25)歲；每例患者空腹靜脈采血10 mL，對HIV-PSM組患者治療2周后再次采血，分離血清存放于-20 ℃?zhèn)溆?。流式細胞計?shù)法檢測CD4+T細胞數(shù)量，RT-PCR檢測HIVRNA病毒載量；采用常規(guī)的酶偶聯(lián)速率法檢測腺苷脫氨酶(tADA)、腺苷脫氨酶的同工酶(ADA1和ADA2)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)；同時，針對該53例的艾滋病合并馬爾內(nèi)菲青霉菌病患者，在經(jīng)診斷并接受同等時間治療后，繼續(xù)對各患者情況進行跟蹤，結(jié)果有45例好轉(zhuǎn)，5例未愈，3例死亡，并對其中的50例樣本進行采血跟蹤測定指標。并采取擴大樣本的方式測定指標的相關(guān)性、特異性和靈敏度。所有HIV患者均由當?shù)厥』蚴屑壖膊】刂浦行膶嶒炇掖_認報告，診斷標準按《國家免費艾滋病抗病毒藥物治療手冊》。本研究得到長沙市第一醫(yī)院、中南大學湘雅二醫(yī)院倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1CD4+T細胞數(shù)的檢測和記錄 將患者靜脈血離心分離，將其細胞成分分裝于流式細胞儀專用管用于流式細胞儀(Accuri C6，BD，NJ in USA)進行CD4+T細胞的計數(shù)。

1.2.2AST和ALT的活性檢測 根據(jù)中山標佳生物科技有限公司的AST試劑盒(速率法)及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(速率法)的使用說明書進行操作，配套儀器為深圳邁瑞公司的BS-400全自動生化分析儀；參考值范圍：AST 12-39 U/L；ALT 7-48 U/L。

1.2.3馬爾尼菲青霉菌病的確認檢查 (1)使用專用檢測PSM的培養(yǎng)瓶對住院合并機會性感染的AIDS患者采集靜脈血，置于梅里埃公司的BACT/ALERT 3D培養(yǎng)系統(tǒng)中，設(shè)置對照組，七天內(nèi)該系統(tǒng)將有菌生長的培養(yǎng)瓶進行報警，即初步判定為PM陽性組；(2)將報警的培養(yǎng)瓶中的PM陽性結(jié)果菌群挑出，進行沙氏平板實驗，以進行PM二次確認。

1.2.4tADA、ADA1和ADA2的檢測 采用酶偶聯(lián)速率法測定血清總ADA(即tADA是ADA1和ADA2之和)，正常參考值4～18 U/L。本研究中采用的是深圳邁瑞公司的BS-400全自動生化分析儀，腺苷脫氨酶(總ADA)檢測試劑盒(AD7278)購自上海執(zhí)誠生物科技股份有限公司，按試劑盒說明書操作。而對ADA1和ADA2的含量測定，是根據(jù)紅-9-(2-羥基-3-壬烷基)腺嘌呤(EHNA，0.1 mM)(58337-38-5，Minneapolis，USA)能完全抑制ADA1活性，而ADA2對EHNA 抑制作用不敏感[20]的原理，通過加入EHNA測定總ADA含量和ADA2含量，兩者相減即得到ADA1的含量。

2 結(jié) 果

2.1CD4+細胞數(shù)測定 由表1中測定所得CD4+T細胞計數(shù)情況可知，在AIDS組中CD4+T細胞數(shù)比較高，平均值為1055.6個/μL，HIV感染組平均值為534.44個/μL，而HIV-PSM組的平均值為21.84個/μL；與HIV感染組相比，AIDS組和HIV-PSM組的CD4+細胞數(shù)均明顯降低(P<0.05)，且降低幅度較大；統(tǒng)計分析顯示：HIV-PSM組、AIDS組及HIV感染組之間均是差異顯著的(P<0.05)。

表1 AIDS組、HIV感染組和HIV-PSM組的對應(yīng)CD4+細胞數(shù)的測定結(jié)果分析

注：a是HIV感染組和AIDS組之間比較，b是AIDS組和HIV-PSM組之間比較，c是HIV感染組和HIV-PSM組之間比較。

2.2各組血清中AST和ALT的活性檢測結(jié)果分析 血清AST和ALT的活性在AIDS組和HIV-PSM組中均有增加，如表2所示，但AST的改變更明顯；HIV-PSM組血清AST、AST活性明顯高于其他兩組(P均<0.05)，而ALT的變化差異不顯著，說明結(jié)果指向性并不明顯。

組別nASTU/LtPALTU/LtPHIV感染組6213.2±2.15.122a0.037a22.5±3.415.627a0.289aAIDS組4324.9±4.08.141b0.022b34.8±5.37.364b0.126bHIV-PSM組53124.6±12.63.228c0.034c52.1±8.710.347c0.224c

注：a是HIV感染組和AIDS組之間比較，b是AIDS組和HIV-PSM組之間比較，c是HIV感染組和HIV-PSM組之間比較。

2.3各組中tADA、ADA1和ADA2活性分析 tADA的值是ADA1和ADA2兩值之和，tADA在HIV-PSM組中明顯升高，其中以ADA2同工酶升高最明顯，且組間比較差異顯著(p均<0.05)，而ADA1同工酶的差異并不顯著(p>0.05)。見表3。

組別ntADAU/LtPADA2U/LtPADA1U/LtPHIV感染組624.9±1.210.341a0.046a1.5±1.46.384a0.048a3.4±0.95.322a1.237aAIDS組439.4±2.54.127b0.031b4.9±1.71.249b0.039b4.5±2.02.834b0.628bHIV-PSM組5331.7±17.92.834c0.044c26.1±12.84.571c0.042c5.1±8.56.924c0.640c

注：a是HIV感染組和AIDS組之間比較，b是AIDS組和HIV-PSM組之間比較，c是HIV感染組和HIV-PSM組之間比較；數(shù)據(jù)是以平均值±SD的形式呈現(xiàn)的。

2.4tADA、ADA1、ADA2和AST在HIV-PSM患者治療前后的分析評價 治療后，HIV-PSM組患者tADA、ADA2及AST水平均下降，與治療前相比，差異有統(tǒng)計學差異。見圖1。

注：與治療前比較，**P<0.01。

圖1治療前后各指標(tADA、ADA1、
ADA2和AST)的數(shù)值變化比較

2.5各指標放大樣本后的相關(guān)性分析 由圖2A中的相關(guān)性分析圖可知，在所有的樣本中，包括HIV感染組、AIDS組及HIV-PSM組的所有數(shù)據(jù)，隨著樣本CD4+細胞數(shù)的上升，其tADA的活性是下降的，兩者呈負相關(guān)(R=-0.784，P=0.006)；同時，如圖2B所示，隨著樣本CD4+細胞數(shù)的上升，其ADA2的活性是下降的，亦呈負相關(guān)(R=-0.742，P=0.002)；而對ADA1活性與CD4+細胞數(shù)的相關(guān)性分析顯示，兩者之間的反向相關(guān)性較低(R=-0.09，P<0.05)。另外，如圖2C所示，發(fā)現(xiàn)隨著樣本tADA活性上升，ADA2活性亦增加，兩者呈正相關(guān)(R=0.957，P=0.045)；而ADA1活性與tADA活性的相關(guān)性亦較低，此處并未將數(shù)據(jù)展示出來。由上圖數(shù)據(jù)綜合分析，tADA與ADA2的樣本相關(guān)性相對較高，而tADA與ADA1的相關(guān)性卻較低。最后，如圖2D所示，隨著樣本中AST活性上升的趨勢tADA的活性也在逐步增加，圖中趨勢顯示是顯著的正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.891(P=0.019)。

注：A.HIV所有感染患者樣本中CD4+細胞數(shù)與tADA活性的相關(guān)性；B.HIV所有感染患者樣本中CD4+細胞數(shù)與ADA2活性的相關(guān)性；C.HIV所有感染患者樣本中tADA活性與ADA2活性的相關(guān)性D)HIV所有感染患者樣本中tADA活性與AST活性的相關(guān)性。

圖2指標在樣本檢測中的相關(guān)性分析

2.6特異性和靈敏度分析 tADA、ADA2及AST三個指標在非HIV-PSM與HIV-PSM樣本中的AUC值均在0.81～0.89之間。tADA、ADA2及AST的ROC下面區(qū)域分別為0.870、0.885和0.810。tADA的特異性和靈敏度分別為80%、80%；ADA2的特異性和靈敏度亦分別為90%、80%；AST的則為100%、70%，在此特異性和靈敏度條件下對應(yīng)的tADA、ADA2及AST臨界值(當Youden指數(shù)最大時確定診斷最佳臨界值)分別為： 28.5 U/L、19.4U/L和115.9 U/L。

注：A：tADA的ROC曲線；B：ADA2的ROC曲線；C：AST的ROC曲線。

圖3tADA、ADA2和AST的ROC曲線

3 討 論

近年來，由于全球艾滋病感染者不斷增加，馬爾內(nèi)菲青霉菌病發(fā)病率也呈現(xiàn)增長的趨勢。由于馬爾內(nèi)菲青霉菌病具有較高的病死率，如果患者未得到準確的診斷和及時治療，播散型的PSM病死率可超過75%[1]。早期診斷無特殊生化指標，確診需要病原學檢測，而病原學檢測耗時，有可能延誤最佳治療時機[2]，因此有必要建立一套早期診斷的指標，以便及時治療以改善預(yù)后。

tADA是嘌呤核苷分解代謝過程中的可特異性催化水解核苷生成肌苷和氨的一種重要酶類，包括兩種同工酶：ADA1和ADA2，其在體內(nèi)分布較普遍，主要存在于實質(zhì)器官、淋巴細胞、單核/巨噬細胞中。正常情況下，血清中tADA主要來源于肝臟，當肝細胞損傷壞死或膜通透性增加時，肝細胞內(nèi)tADA釋放入血引起tADA活性增加，可作為一種反應(yīng)肝細胞損害、肝纖維化的指標[3]；但是，由于在單核/巨噬細胞、T淋巴細胞中tADA活性較血清更高[4]，其tADA是淋巴細胞增殖與分化及單核細胞成熟為巨噬細胞過程中所必需的，tADA缺陷可導致原發(fā)性免疫缺陷病，因而被認為是細胞免疫的指標[5-6]，故臨床上tADA的變化可能與免疫性疾病的關(guān)系更為密切。有文獻[7-8]報道，在肺結(jié)核、結(jié)核性胸膜炎患者血清及胸膜腔中的tADA活性增高，認為與細胞免疫功能增強、淋巴細胞增多有關(guān)；但在某些免疫缺陷的疾病中，亦發(fā)現(xiàn)有tADA的升高，說明ADA活性高低，并不完全與免疫功能的強弱及淋巴細胞計數(shù)一致。原因可能是標準的tADA檢測的是tADA的活性(有氨顯色法和氨偶聯(lián)酶測定法)，而不是數(shù)量，活性與數(shù)量不完全成正比，因此只有當T細胞受到抗原刺激激活或快速增殖時，tADA活性水平才會明顯增高[9]。而在肺結(jié)核及AIDS感染者中，tADA升高時，CD4+T淋巴細胞減少而CD8+T淋巴細胞增加[10]，且發(fā)現(xiàn)tADA升高是以ADA2為主[11]，而在本研究中，HIV-PSM組血清tADA升高亦是以ADA2升高為主，與文獻報道結(jié)果一致?？赡苁且驗锳DA2主要來源于單核巨噬細胞系統(tǒng)，在單核巨噬細胞系統(tǒng)激活與淋巴細胞數(shù)量變化不一致情況下亦可能出現(xiàn)tADA的升高[12]。

馬爾內(nèi)菲青霉菌病是由于馬爾尼菲青霉菌(PM)感染所致，而PSM主要寄生于巨噬細胞，并可隨血液運送到單核吞噬細胞系統(tǒng)。在免疫功能正常者，巨噬細胞被T細胞產(chǎn)生的細胞因子激活而使PSM感染得到控制；而在HIV/AIDS患者由于免疫功能低下，體內(nèi)CD4+T細胞減少，巨噬細胞不能及時吞噬和殺滅入侵的PM孢子，致使PM在體內(nèi)迅速繁殖，巨噬細胞變性壞死造成該菌在體內(nèi)廣泛播散，引發(fā)播散型PSM[13-14]。由于馬爾內(nèi)菲青霉菌喜嗜濕熱環(huán)境，因而我國南方或東南亞可能更多見，文獻報道，該病在越南的患病率是4.4%[15]，在中國香港的患病率是14%[16]，但是中國大陸鮮有報道。除環(huán)境因素、季節(jié)性變化外，最主要的是患者CD4+T細胞數(shù)減少，通常小于200個/μL的AIDS患者其患PSM的風險更高，本文結(jié)果就提示HIV-PSM組患者的CD4+T細胞數(shù)僅僅21個/μL左右。ADA活性變化是否與CD4+T細胞數(shù)及機會性感染密切相關(guān)呢？有研究[17]報道，HIV陽性患者血清中ADA的活性可能有一個很明顯的上升趨勢，但是ADA或ADA1和ADA2同工酶在HIV合并PSM患者中的變化情況卻很少報道。本研究結(jié)果顯示，在HIV感染不同階段，隨著CD4+T細胞數(shù)逐漸減少，患者出現(xiàn)機會性感染的幾率越高，尤其是PSM，而且ADA(ADA2)和AST活性亦隨之升高，進一步研究發(fā)現(xiàn)，隨著HIV-PSM治療轉(zhuǎn)歸好轉(zhuǎn)，ADA(ADA2)和AST活性亦隨之下降，說明ADA(ADA2)和AST活性與HIV感染的疾病進程和機會性感染密切相關(guān)，尤其是HIV-PSM患者。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，上述三個指標具有較好的相關(guān)性和較高的靈敏度和特異性；進而在此特異性和靈敏度條件下對應(yīng)的tADA、ADA2及AST臨界值(當Youden指數(shù)最大時確定診斷最佳臨界值)分別為： 28.5 U/L、19.4U/L和115.9 U/L。因此，根據(jù)我們的實驗摸索，可以初步推斷這些指標(tADA、ADA2及AST)有可能成為HIV-PSM早期診斷的血清學指標，以輔助臨床早期診斷治療及改善預(yù)后。但本研究僅為單指標探索性診斷研究，初步發(fā)現(xiàn)血清幾個常見指標在HIV/AIDS合并PSM早期診斷中具有潛在價值，今后尚需擴大樣本及綜合更多指標進行更深入探索。