秦 振，董 楠，楊 林，廖巖峰

(天方藥業(yè)有限公司，河南 駐馬店 463000)

林可霉素(lincomycin)(圖1)[1]是一種高效廣譜抗生素，于1962年由美國(guó)人Mason等首先從鏈霉菌林可變種培養(yǎng)液中獲得，從此獲得廣泛應(yīng)用。林可霉素分子式為C18H34N2O6S，相對(duì)分子質(zhì)量為406.56。

圖1 林可霉素結(jié)構(gòu)式Fig.1 Lincomycin structural formula

目前在世界上發(fā)酵培養(yǎng)是抗生素生產(chǎn)的主要方法，各國(guó)都在廣泛應(yīng)用。由于在發(fā)酵液中存在著大量菌絲體的同時(shí)，還存在著菌體的代謝物，剩余培養(yǎng)基以及抗生素主組分以外的其它復(fù)雜組分。所以，在抗生素提取精制之前，必須進(jìn)行預(yù)處理、過(guò)濾，以除去這些干擾物質(zhì)[3-4]。

目前對(duì)于發(fā)酵液的處理方法，有帶菌絲體萃取、雙水相法、樹(shù)脂離子交換法、膜分離以及板框過(guò)濾法等，以上各種方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)。板框過(guò)濾法因其技術(shù)要求簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便因此被我公司采用。

發(fā)酵液在過(guò)濾前需要進(jìn)行預(yù)處理。通過(guò)預(yù)處理改變發(fā)酵液的物理性質(zhì)以利于固液分離。預(yù)處理常用的方法有pH、溫度調(diào)節(jié)、絮凝等。對(duì)于不同的抗生素產(chǎn)品其預(yù)處理的具體主法不同。本文主要以林可霉素為例，對(duì)發(fā)酵液的預(yù)處理方法和效果進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 pH值調(diào)節(jié)的影響

常溫下取林可霉素發(fā)酵液，升至適當(dāng)溫度后用草酸將發(fā)酵液調(diào)至適當(dāng)pH值，測(cè)定濾速(mL·5min-1)。取數(shù)份體積相同的預(yù)處理(pH值為2.8)，將其回調(diào)到不同的pH值，攪拌均勻后用濾紙過(guò)濾，分別測(cè)定各濾液效價(jià)和濾速。

1.2 溫度調(diào)節(jié)的影響

取林可霉素發(fā)酵液，加入草酸將pH值調(diào)至2.8后，接著加入適量的硫酸鋅和黃血鹽，最后在不同的溫度下過(guò)濾，分別測(cè)定各濾液效價(jià)和濾速。

1.3 外加物質(zhì)的影響

取林可霉素發(fā)酵液，加入不同含量的硫酸鋅和黃血鹽，攪拌30 min后過(guò)濾，測(cè)定濾液效價(jià)、蛋白質(zhì)含量(以沉淀物計(jì)算)和過(guò)濾速度。

以上實(shí)驗(yàn)所用的林可霉素發(fā)酵液由天方藥業(yè)有限公司林可生產(chǎn)車(chē)間提供。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論

2.1 預(yù)處理pH值對(duì)過(guò)濾的影響

在水溶液中抗生素存在著解離平衡，pH值的高低影響著解離平衡。取林可霉素發(fā)酵液分別調(diào)到不同的pH值(pH值=2～8)，測(cè)定濾液效價(jià)的不同變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在不同的pH值下過(guò)濾后的林可霉素發(fā)酵液效價(jià)存在峰值。同時(shí)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)，pH值對(duì)林可霉素發(fā)酵液的濾速、蛋白質(zhì)含量的影響都比較大。在pH值<3.5時(shí)過(guò)濾后蛋白質(zhì)的析出量較多，最大可達(dá)到110 mg(10 mL濾液)-1(見(jiàn)表1)，說(shuō)明在過(guò)濾過(guò)程中較低的pH值使濾液中堿性蛋白質(zhì)的析出量增加。

圖1 林可霉素濾液效價(jià)與pH的關(guān)系圖Fig.1 Lincomycin filtrate titers and pH relationship diagram

表1 pH值對(duì)濾速與蛋白質(zhì)含量影響Table 1 pH on the filtration rate and protein content

為了研究pH值<3.0時(shí)效價(jià)降低現(xiàn)象及過(guò)濾pH值對(duì)后續(xù)萃取過(guò)程的影響。在接下來(lái)又做了對(duì)pH回調(diào)后對(duì)濾液的影響實(shí)驗(yàn)：取林可霉素發(fā)酵液先調(diào)節(jié)pH值至3.0，然后再分別回調(diào)至pH值=3.0～7.5，測(cè)定濾液效價(jià)變化(見(jiàn)圖2)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著pH值回調(diào)不斷的上升，濾液效價(jià)呈下降趨勢(shì)，其具體表現(xiàn)與圖1相似，但是濾液的濾速變化小，蛋白質(zhì)的析出量逐漸減小，并趨于一定值(見(jiàn)表2)。

圖2 pH值回調(diào)后對(duì)效價(jià)的影響Fig.2 pH callback on the impact of price

從以上實(shí)驗(yàn)我們可以看出，濾液的效價(jià)只與最終的pH值有關(guān)，同實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的pH調(diào)節(jié)關(guān)系不大， 這說(shuō)明林可霉素濃度與pH值之間存在著一定的平衡關(guān)系，林可霉素在溶液和固形物之間存在著一種吸附平衡。發(fā)酵液中存在著多種蛋白質(zhì)，不同的等電點(diǎn)下蛋白質(zhì)的含量差異比較大，林可霉素是在偏酸性的條件下進(jìn)行過(guò)濾，此時(shí)基本上不會(huì)析出堿性的蛋白質(zhì)。當(dāng)pH值上調(diào)到9.5左右時(shí)蛋白質(zhì)會(huì)大量析出，此時(shí)易造成乳化現(xiàn)象，使分相出現(xiàn)困難。蛋白質(zhì)在溶液中存在著溶解平衡和變性問(wèn)題，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的影響因素較多，計(jì)算比料復(fù)雜，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)濾時(shí)如果pH值高于6.5濾液中的堿性蛋白質(zhì)的含量會(huì)比較少。

表2 pH對(duì)濾速與蛋白質(zhì)含量影響Table 2 pH on the filtration rate and protein content

2.2 溫度調(diào)節(jié)的影響

林可霉素發(fā)酵液過(guò)濾速率受溫度的影響，因此我們做了溫度對(duì)發(fā)酵液過(guò)濾速度的影響實(shí)驗(yàn)，取放罐發(fā)酵液分別調(diào)節(jié)溫度(30～80℃)，測(cè)定濾液效價(jià)及濾速的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過(guò)濾林可霉素發(fā)酵液時(shí)溫度越高濾速越高，但濾液效價(jià)隨著溫度的升高而降低。通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們可以發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)發(fā)酵液的濾速和效價(jià)影響都非常的大。

從圖3我們可以看出隨著溫度不斷的提高，發(fā)酵液效價(jià)隨著降低，但是發(fā)酵液的濾速卻不斷提高，然而隨著溫度再進(jìn)一步的升高，濾速會(huì)趨于一穩(wěn)定值。

2.3 外加物質(zhì)的影響

圖4 外加物質(zhì)對(duì)濾速、效價(jià)和蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 Effects of added substances on filtration rate,titer and protein content

在恒定溫度和pH值的條件下加入不同量的外加物質(zhì)(黃血鹽和硫酸鋅1∶1配比)，測(cè)定林可霉素發(fā)酵液效價(jià)和濾速。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在林可霉素發(fā)酵液中加入不同量的黃血鹽和硫酸鋅對(duì)林可霉素效價(jià)影響不大，但對(duì)蛋白質(zhì)含量和發(fā)酵液濾速的影響較大。

由圖4可看出，隨著外加物質(zhì)濃度的增加，林可霉素效價(jià)基本維持在一穩(wěn)定值，說(shuō)明外加物質(zhì)的加入對(duì)效價(jià)影響不大；但發(fā)酵液的濾速則不斷提高，最后趨于一穩(wěn)定值，說(shuō)明外加物質(zhì)的加入可提高發(fā)酵液的濾速；而外加物質(zhì)增加則可降低蛋白質(zhì)含量，但在生產(chǎn)中需考慮生產(chǎn)成本問(wèn)題，所以外加物質(zhì)可控制在0.15%～0.3%最佳。

2.4 染菌對(duì)提取的影響

林可霉素提取的影響因素除了pH值、溫度和外加物質(zhì)外，染菌對(duì)提取的影響也非常的大。

2.4.1 對(duì)過(guò)濾的影響

發(fā)酵罐因染雜菌后，發(fā)酵液黏度加大，造成提取板框過(guò)濾時(shí)間拉長(zhǎng)，影響設(shè)備的周轉(zhuǎn)使用；因?yàn)轲ざ却螅瑸V渣殘留量也加大，破壞生產(chǎn)平衡，且降低過(guò)過(guò)濾收率。

2.4.2 對(duì)有機(jī)溶劑萃取的影響

染菌的發(fā)酵液含有大量的水溶性蛋白質(zhì)，更易發(fā)生乳化，使水相和溶劑相難以分開(kāi)。

2.4.3 對(duì)離子交換的影響

雜菌會(huì)粘在樹(shù)脂表面或被樹(shù)脂吸附，從而降低離子交換樹(shù)脂的交換性能。

2.4.4 對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響

如果染菌會(huì)造成發(fā)酵液中出現(xiàn)較多的蛋白質(zhì)和其他的雜質(zhì)，會(huì)對(duì)產(chǎn)品的純度造成較大的影響；同時(shí)可能會(huì)產(chǎn)品的外觀造成影響。

2.4.5 雜菌對(duì)“三廢”處理的影響

染菌后的發(fā)酵廢液，生物好氧量(COD)增高，增加三廢治理時(shí)間和成本。

2.5 提高異常發(fā)酵罐產(chǎn)品質(zhì)量的方法

(1)針對(duì)異常發(fā)酵罐放罐發(fā)酵液要多做小試，找到黃血鹽與草酸兩種物料的比例。

(2)在生產(chǎn)投料時(shí)，要分多次加入，且每次都要做小試，盡量找到最佳點(diǎn)。

2.6 降低藥渣殘留的方法

(1)濾液過(guò)濾時(shí)不能使板框的壓力過(guò)高，壓力控制在0.2～0.25 MPa，便于洗水。

(2)對(duì)各級(jí)板框之間的壓力也要做出調(diào)整，壓力控制在0.2～0.25 MPa，并注意末尾板框壓力。

3 結(jié)論

(1)在抗生素的發(fā)酵液中存在著電離平衡，同時(shí)在發(fā)酵液中固形物和蛋白質(zhì)在沉淀過(guò)程中也會(huì)存在吸附平衡，各種預(yù)處理方法都會(huì)對(duì)上述平衡造成一定的影響。

(2)由于蛋白質(zhì)在不溶液中存在著變性和溶解平衡，采用不同的溫度和pH濾液中的蛋白質(zhì)含量和濾速會(huì)出現(xiàn)不同。

(3)染菌不僅僅對(duì)發(fā)酵效價(jià)影響較大，對(duì)后面提取的收率和產(chǎn)品質(zhì)量影響也很大，降低染菌率可以提高收率和產(chǎn)品質(zhì)量。