林張軍，李 倩，章越凡，芮耀誠

(1.海軍軍醫(yī)大學藥學院藥理學教研室，上海 200433；2.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇一醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230031)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種慢性炎癥反應，其特征為大動脈和中動脈血管壁上形成的脂質(zhì)斑塊[1]。巨噬細胞是AS斑塊的重要組成部分，在AS的進展中發(fā)揮重要作用。從早期斑塊的巨噬細胞浸潤、吞噬堆積的脂質(zhì)和細胞碎片，到最終形成泡沫細胞，巨噬細胞的狀態(tài)決定了斑塊的發(fā)展[2]。

自噬現(xiàn)象在降解細胞內(nèi)的長壽命蛋白、受損細胞器和堆積的脂滴中起關鍵作用[3]。自噬功能缺陷會誘發(fā)泡沫細胞形成，從而促進AS的發(fā)展[4-5]。p62/SQSTM1是一種多功能的支架蛋白，它不僅參與自噬過程，還涉及多個細胞信號轉(zhuǎn)導通路[6-9]。在選擇性自噬中，p62將泛素化的蛋白攜帶到自噬小體內(nèi)降解，同時自身也被降解[6]。然而，在小鼠和人類的AS斑塊中檢測到了大量堆積的p62蛋白[10-11]，這是一種自噬功能缺陷導致的病理現(xiàn)象，還是一種抗AS的應激反應，目前尚存在爭議[12]。并且，p62是否參與了脂滴的自噬性降解暫無定論[13]。因此，本研究擬在氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL)誘導的巨噬源性泡沫細胞中探討p62蛋白對脂質(zhì)代謝相關的自噬以及炎癥因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞

Raw264.7細胞購自ATCC，GFP-LC3B穩(wěn)轉(zhuǎn)RAW264.7細胞系由本研究室參照文獻方法構建[14]。

1.2 試劑及儀器

DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，胎牛血清、青鏈雙抗、胰蛋白酶(Gibco)；兔抗小鼠p62抗體、兔抗小鼠LC3B抗體、兔抗小鼠Nrf2抗體(Cell Signaling Technology)，CF555標記的驢抗兔二抗(Biotium)，兔抗小鼠PEX2抗體(Abgent)，兔抗小鼠Plin2抗體(Abcam)，HRP(辣根過氧化酶)標記的二抗和β-Actin抗體(上?？党缮锕こ逃邢薰?；低密度脂蛋白(Low density lipoprotein，LDL)、乙?；兔芏戎鞍?acetylated lipoprotein low density，Ac-LDL)、Ox-LDL和DiI標記的Ox-LDL(北京協(xié)生生物科技有限公司)；DAPI(上海碧云天生物技術有限公司)，抗淬滅封片劑(Thermo Fisher)；siRNA轉(zhuǎn)染試劑INTERFERinR(Polyplus)；Nrf2 siRNA(Santa Cruz)，p62 siRNA(5′-GCUAUGUCCUAUGUGAAAGAU-3′)和對照siRNA (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′)由蘇州吉瑪基因股份有限公司合成；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及qPCR檢測試劑(Takara)；雷帕霉素、氯喹和巴佛洛霉素A1(Sigma)；玻底培養(yǎng)皿(無錫耐思生物科技有限公司)。

Real-time qPCR儀(Thermo Fisher ABI7500)，激光共聚焦顯微鏡(蔡司LSM700)，CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Forma Scientific)。

1.3 細胞培養(yǎng)及siRNA轉(zhuǎn)染

Raw264.7細胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%滅活胎牛血清及100 U/ml青霉素和100 mg/L鏈霉素，置于37 °C、5.0% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

RAW264.7細胞按1×105個/孔的密度加到12孔板中培養(yǎng)過夜，按照INTERFERin說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染36 h后給予終濃度為40 mg/L的Ox-LDL刺激，24 h后提取細胞總蛋白；或轉(zhuǎn)染48 h后給予終濃度為40 mg/L的Ox-LDL刺激，4 h后提取細胞總RNA。

1.4 巨噬源性泡沫細胞模型的建立

參照文獻中泡沫細胞模型的建立方法[15-16]，使用終濃度為40 mg/L Ox-LDL刺激Raw264.7細胞24 h，建立巨噬源性泡沫細胞模型。

1.5 細胞中LC3和p62斑點的觀察

穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-LC3B的RAW264.7細胞按 2×105個/孔的密度加到玻底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，24 h后更換含終濃度為40 mg/L Ox-LDL的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h；取出玻底培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)基，加PBS洗滌2次；再加4%的多聚甲醛溶液進行固定30 min，PBS漂洗3次，每次5 min；用封閉液(1× PBS/5%正常驢血清/0.3% TritonTMX-100)室溫封閉60 min；吸去封閉緩沖液，加入稀釋后的p62一抗(1∶250)，4°C 孵育過夜；取出用 1× PBS 漂洗3次，每次5 min；加入熒光二抗(1∶500)，室溫下避光孵育標本1～2 h；用 1× PBS 漂洗3次，每次5 min；滴上抗淬滅封片劑，于激光共聚焦顯微鏡下觀察LC3和p62斑點。

RAW264.7細胞按1×105個/孔的密度加到玻底培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，使用終濃度均為40 mg/L的LDL、Ac-LDL或Ox-LDL刺激24 h。取出玻底皿，p62抗體孵育過程同前所述，在熒光二抗孵育結(jié)束后，滴加DAPI染液室溫孵育5 min，用 1× PBS 漂洗3次，每次5 min；滴上抗淬滅封片劑，于激光共聚焦顯微鏡下觀察p62斑點。

1.6 Western blot

使用碧云天RIPA試劑盒提取細胞內(nèi)總蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度后進行蛋白變性。提取的蛋白用SDS-PAGE法分離，使用半干轉(zhuǎn)法將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用含5%的脫脂奶粉常溫封閉2 h后，進行p62、LC3、PEX2和Nrf2一抗(1∶1 000)4℃孵育過夜，取出后使用TBST洗滌3次后，HRP標記的二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，滴加ECL發(fā)光液后于Tanon5200成像系統(tǒng)上成像。使用Quantity One軟件分析灰度值。

1.7 Real-time qPCR

使用RNAiso Reagent提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用qPCR檢測試劑以及p62、IL-6、TNFα和β-Actin引物進行擴增，其中，β-Actin作為內(nèi)參。詳細序列見表1。

表1 qPCR引物序列

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

2 結(jié)果

2.1 Ox-LDL同時上調(diào)巨噬細胞中自噬水平和p62蛋白水平

在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，Ox-LDL處理組的細胞中出現(xiàn)更多的LC3和p62斑點，并且存在共定位(圖1A)。LC3斑點增多說明Ox-LDL誘導的泡沫細胞中自噬體數(shù)量增多，p62斑點增多有可能是自噬溶酶體降解途徑受到影響導致的。利用自噬抑制劑氯喹與Ox-LDL共刺激或分別刺激Raw264.7細胞24 h后，Western blot結(jié)果顯示Ox-LDL提高了巨噬細胞中LC3-Ⅱ/ACTB比值，與氯喹共刺激后能進一步升高該比值(圖1B)，說明Ox-LDL上調(diào)了巨噬細胞的自噬水平。為了研究Ox-LDL對p62蛋白水平的影響是否通過了自噬途徑，將Ox-LDL與自噬誘導劑(雷帕霉素)或自噬抑制劑(巴佛洛霉素A1、氯喹)共刺激巨噬細胞24 h，通過Western blot檢測細胞中p62蛋白水平。結(jié)果顯示雷帕霉素能抑制Ox-LDL對p62蛋白的上調(diào)作用，巴佛洛霉素A1和氯喹均能增加Ox-LDL對p62蛋白的上調(diào)作用(圖1C)。這說明Ox-LDL對p62蛋白的上調(diào)作用并不是抑制自噬溶酶體降解途徑導致的。

圖1 Ox-LDL對巨噬細胞中自噬水平和p62蛋白水平的影響 A.共聚焦顯微鏡下觀察LC3(綠色)和p62(紅色)斑點；B.Ox-LDL上調(diào)Raw264.7細胞自噬水平；C.不同處理組細胞中p62蛋白水平；Ox-LDL(40 mg/L)、雷帕霉素(Rap)100 nmol/L、氯喹(CQ)50 μmol/L和巴佛洛霉素A1(Baf A1)100 nmol/L；ACTB(β-actin)

2.2 LDL、Ac-LDL和Ox-LDL 上調(diào)巨噬細胞中p62蛋白和 mRNA水平

在激光共聚焦顯微鏡下觀察到，LDL、Ac-LDL或Ox-LDL刺激后，細胞內(nèi)p62斑點均增多(圖2A)。Western blot 結(jié)果顯示：LDL、Ac-LDL和Ox-LDL均能上調(diào)p62蛋白水平，其中Ox-LDL的上調(diào)能力最強(圖2B)。分別使用終濃度均為40 mg/L LDL、Ac-LDL和Ox-LDL刺激2、4、6 h后，用Real-time qPCR檢測p62 mRNA水平，結(jié)果顯示：3種低密度脂蛋白均能使p62 mRNA水平呈現(xiàn)時間依賴性上調(diào)，其中Ox-LDL上調(diào)作用最強，與LDL組(4、6 h，P<0.01)和Ac-LDL組(4 h，P<0.05；6 h，P<0.01)相比，均有統(tǒng)計學差異(圖2C)。

圖2 LDL、Ac-LDL和Ox-LDL對巨噬細胞中p62蛋白和mRNA水平的影響 A.共聚焦顯微鏡下觀察p62(紅色)，細胞核(藍色)；B.LDL、Ac-LDL和Ox-LDL對Raw264.7細胞中p62蛋白水平的影響，ACTB(β-actin)；C.LDL、Ac-LDL和Ox-LDL對p62 mRNA水平的影響(n=3)**P<0.01，與同一時間點中LDL組比較；#P<0.05，##P<0.01，與同一時間點中Ac-LDL組比較

2.3 沉默p62對巨噬源性泡沫細胞中自噬的影響

使用p62 siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞36 h后，再給予終濃度為40 mg/L的Ox-LDL刺激24 h，Western blot檢測到p62 siRNA組LC3II/β-actin比值低于對照組(圖3A)，而脂滴相關蛋白Plin2蛋白水平?jīng)]有明顯變化(圖3B)，提示下調(diào)p62雖然削弱了Ox-LDL誘導的自噬水平，但是未對細胞中脂滴自噬性降解產(chǎn)生明顯影響。另外，Western blot結(jié)果還顯示Ox-LDL刺激后的p62 siRNA組PEX2蛋白水平高于對照組(圖3A)。PEX2主要位于過氧化物酶體膜上[17]，PEX2水平的變化提示沉默p62可能影響了泡沫細胞中過氧化物酶體的自噬性降解。

圖3 沉默p62對巨噬源性泡沫細胞中自噬的影響 A.沉默p62對LC3、PEX2蛋白水平的影響；B.沉默p62對Plin2的影響；油酸200 μmol/L；ACTB(β-actin)

2.4 p62抑制Ox-LDL誘導的炎癥因子表達

為了確認p62是否影響了Ox-LDL誘導的炎癥因子的表達，本研究中對比了p62 siRNA組和對照組Raw264.7細胞經(jīng)Ox-LDL刺激4 h后胞內(nèi)的TNFα和IL-6 mRNA水平。Real-time qPCR結(jié)果顯示，p62 siRNA 組TNFα(P<0.05)和IL-6 mRNA(P<0.01)表達明顯升高(圖4)，說明沉默p62促進了Ox-LDL誘導的炎癥因子的表達。

圖4 沉默p62對Ox-LDL誘導的炎癥因子表達的影響 A.對Ox-LDL誘導的TNFα mRNA水平的影響；B .對Ox-LDL誘導的IL-6 mRNA水平的影響(n=3)*P<0.05，**P<0.01，與Ox-LDL刺激后的對照組比較

2.5 Ox-LDL在巨噬細胞中通過Nrf2介導p62上調(diào)

當細胞應對氧化應激時，腹腔巨噬細胞中p62可以被Nrf2誘導表達，敲除Nrf2顯著抑制p62的表達水平[18]。為了進一步探討Ox-LDL對Raw264.7細胞中p62蛋白的上調(diào)是否與Nrf2相關，使用Nrf2 siRNA轉(zhuǎn)染Raw264.7細胞36 h后，再給予終濃度為40 mg/L的Ox-LDL刺激24 h，Western blot結(jié)果顯示，Nrf2 siRNA組中Ox-LDL對p62蛋白的上調(diào)受到了明顯抑制(圖5)。這說明Ox-LDL誘導巨噬細胞中p62蛋白水平上調(diào)是通過Nrf2介導的。

圖5 Nrf2介導Ox-LDL誘導的巨噬源性泡沫細胞中p62蛋白的上調(diào)

3 討論

修飾的低密度脂蛋白是一類重要的致AS因子，包括Ac-LDL、Ox-LDL等。巨噬細胞通過CD36受體攝取修飾的低密度脂蛋白后，大量的脂質(zhì)以膽固醇酯的形式儲存在于脂滴中[19]。過量的脂質(zhì)負荷能夠觸發(fā)脂滴的自噬性降解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和過氧化物酶體增殖物激活受體γ等通路激活[19-23]。本研究發(fā)現(xiàn)了Ox-LDL具有極強的上調(diào)p62蛋白的作用。雖然Ox-LDL對p62蛋白的上調(diào)作用已有文獻報道[10,24]，但是通過本研究發(fā)現(xiàn)，LDL和Ac-LDL也有上調(diào)p62蛋白作用，并且探索了Ox-LDL上調(diào)p62表達的機制，為p62在抗AS中的應用研究提供了理論基礎。

本研究還發(fā)現(xiàn)Ox-LDL刺激后的巨噬細胞中自噬功能沒有明顯改變，但p62 的轉(zhuǎn)錄水平有顯著的上調(diào)，說明Ox-LDL主要在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)p62，同時也提示p62蛋白水平升高不是自噬溶酶體功能受損的充分依據(jù)。研究同時發(fā)現(xiàn)沉默p62后能夠影響炎癥因子的表達，推測在巨噬源性泡沫細胞中p62上調(diào)可能是一種保護機制，即p62通過抑制IL-6和TNFα mRNA的表達避免可能繼發(fā)的更強的炎癥反應，這與既往文獻報道一致[25]。

p62可以結(jié)合細胞器表面泛素化的蛋白，將這些細胞器拖入自噬小體中，利用自噬溶酶體途徑實現(xiàn)細胞器的更新[6]。與p62功能類似的還有NBR1[26]。脂滴通過p62或NBR1途徑降解目前還缺乏充分的證據(jù)，沒有報道發(fā)現(xiàn)脂滴上存在p62或NBR1蛋白[27-28]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在脂質(zhì)負荷時自噬小體優(yōu)先與脂滴結(jié)合[29]，但具體機制還不明確。本研究發(fā)現(xiàn)，沉默p62對巨噬細胞中脂質(zhì)負荷的程度無明顯影響，也提示p62不是巨噬細胞中脂滴自噬性降解的必需蛋白。過氧化物酶體是胞內(nèi)脂肪酸代謝的重要場所，過氧化物酶體的數(shù)量與細胞內(nèi)氧化應激水平密切相關，細胞可以通過自噬來調(diào)節(jié)過氧化物酶體數(shù)量從而控制細胞內(nèi)活性氧水平[30]。當p62被沉默后，過氧化物酶體的自噬性降解會受到影響，表現(xiàn)為細胞內(nèi)過氧化物酶體數(shù)量增多[30]。本研究還發(fā)現(xiàn)沉默p62會上調(diào)Ox-LDL處理組細胞中PEX2蛋白水平，提示p62與過氧化物酶體自噬性降解存在相關性。PEX2作為一種E3泛素連接酶，可以增強對底物蛋白的泛素化作用，從而提高經(jīng)NBR1途徑的自噬性降解[31]。推測沉默p62后出現(xiàn)的PEX2蛋白上調(diào)可能是一種代償機制。

Keap-Nrf2通路是細胞內(nèi)主要的抗氧化反應途徑之一。上調(diào)的p62蛋白與Nrf2競爭性結(jié)合Keap1，導致更多的Nrf2游離出來進入細胞核，從而介導p62的轉(zhuǎn)錄[32]。p62既是該通路的誘導產(chǎn)物，又能反作用于該通路，促進細胞內(nèi)活性氧的清除和DNA修復等。推測在AS斑塊區(qū)細胞中，大量表達的p62蛋白參與泛素化的蛋白和受損細胞器的降解，從而維持細胞內(nèi)部穩(wěn)態(tài)，這種p62的上調(diào)是否一種自我保護機制，還需要進一步的研究。