尹明姬，池永學，李今子

(延邊大學附屬醫(yī)院 吉林 延吉 133002)

癲癇(epilepsy)是一種反復(fù)出現(xiàn)癲癇發(fā)作的慢性疾病。臨床超過30%的患者存在不同程度地耐藥，是慢性癲癇治療的難點，甚至治療失敗[1-3]。越來越多的多藥耐藥基因在慢性癲癇的研究受到關(guān)注，P糖蛋白(P-glycoprotein protein，PGP)和主要穹窿蛋白(major vault protein，MVP)是耐藥基因相關(guān)蛋白，尸檢報告顯示，存在耐藥的慢性癲癇患者腦內(nèi)海馬區(qū)PGP和MVP表達的陽性細胞比鄰近的正常腦組織及正常尸檢標本表達均高，提示PGP和MVP在慢性癲癇耐藥中發(fā)揮重要作用[4-5]，另外氨基酸在慢性癲癇病變中也扮演重要角色。拉莫三嗪(lamotrigine，LTG)廣泛用于耐藥慢性癲癇的治療[6]，但拉莫三嗪對慢性癲癇腦內(nèi)的PGP和MVP及氨基酸表達的影響鮮有報道，因此本課題擬采用戊四氮制備與人慢性癲癇病變高度相似的慢性癲癇大鼠模型，同時分析拉莫三嗪對慢性癲癇治療的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠50只，4～5周齡，體質(zhì)量250～300 g，購自延邊大學[SCXK (吉) 2017-0003]，在延邊大學動物飼養(yǎng)中心[SYXK (吉) 2015-0007]飼養(yǎng)大鼠，并在該中心進行實驗研究，飼養(yǎng)室溫度為20℃ ～ 25℃，相對濕度50% ～ 65%，所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后再行實驗。動物使用倫理審批號：IACUC20170001，本研究符合動物實驗的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

拉莫三嗪片(Glaxo Smith Kline Pharmaceuticals S.A，規(guī)格：50 mg/片，國藥準字：H20110023，批號：20170109)；戊四氮(美國Sigma公司，批號：SOL4242)；TRIzol(美國Invitrogen公司，批號：15596026)；RT-PCR試劑盒(美國TaKaRa公司，批號：201702)；DBA(美國Bioword公司，批號：L201743)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔Ig(武漢博士德生物技術(shù)有限公司，批號：SP1722)。51600型立體定向儀(美國Stoelting公司)；D70-CCTPD70-PCTPC70-EEE型清醒動物生理信號采集系統(tǒng)(美國DSI公司)；UV1700型紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；ZF-288型凝膠顯像儀(上海嘉鵬科技有限公司)；E2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 慢性癲癇模型制備

大鼠腹腔注射戊四氮35 mg/(kg·d)，連續(xù)注射28 d，每次注射后1 h采用紅外攝像頭觀察并記錄癇性發(fā)作的潛伏期與發(fā)作強度。按Racine癲癇發(fā)作分級標準評價，連續(xù)5 d出現(xiàn)≥ II級的發(fā)作即認為慢性癲癇大鼠模型制備成功，并納入研究。

1.3.2 分組及給藥

將慢性癲癇大鼠分為3組，模型組、拉莫三嗪低劑量(5 mg/kg)組和拉莫三嗪高劑量(10 mg/kg)組，每組大鼠15只，健康大鼠作為對照組，所有組別灌胃給藥，模型組和對照組灌胃給予生理鹽水，所有組別連續(xù)灌胃給藥25 d。

1.3.3 指標檢測

(1)大鼠行為學及體質(zhì)量觀察：記錄所有大鼠治療前及治療后的行為學特征及體質(zhì)量。

(2)癲癇發(fā)作時間和腦電波：末次給藥1 d后，檢測腦電波。將各組動物全麻并俯臥位固定在立體定向儀，定位海馬，在海馬深部前囟后約3.0 mm及旁2.5 mm處鉆開顱骨，用腦立體定位儀將腦電圖記錄電極送入硬膜下約3.0 mm。將引導電極信號輸入生理信號采集系統(tǒng)記錄大鼠癲癇發(fā)作頻率，記錄1 h內(nèi)所有組別大鼠癲癇的放電頻率，出現(xiàn)尖波及棘波判定為癲癇發(fā)作，并記錄每次癲癇發(fā)作的時間，計算均值。

(3)海馬樣本中的3種氨基酸含量的測定：取大鼠海馬組織約50 mg，勻漿，分別采用高效液相色譜儀分析海馬組織的天冬氨酸(aspartate，Asp)、谷氨酸(glutamate，Glu)和甘氨酸(glycine，Gly)含量。

(4)免疫組化檢測腦組織中的PGP和MVP表達：末次給藥1 d后，檢測完腦電波后，取腦的海馬組織，部分置于多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，過氧化氫室溫放置15 min，PBS清洗，高壓修復(fù)抗原，放置至室溫，PBS清洗，山羊血清，室溫封閉放置20 min，滴加一抗PGP和MVP(1∶100)，4℃孵育過夜，室溫放置30 min，PBS清洗，滴加二抗，37℃放置10 min，PBS清洗，加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶，37℃放置10 min，DAB顯色，鏡下觀察。

(5)Western blot檢測海馬中PGP和MVP水平：取大鼠海馬組織約50 mg，加入裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上超聲裂解5 s，重復(fù)4次，低溫離心，收集上清，以紫外分光光度計法定量總蛋白，蛋白定量5 g/L，每個電泳道上樣50 μg，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移儀將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到PVDF膜，脫脂奶粉封閉放置2 h，加入一抗PGP和MVP(工作濃度均為1∶100)+ GAPDH(1∶1000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜，羊抗鼠二抗(1∶5000)室溫孵育1.5 h，清洗，以凝膠顯像儀和定量軟件，以GAPDH條帶與電泳條帶的灰度面積比值表示GST-π蛋白質(zhì)的含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學比較

對照組大鼠活動正常。慢性癲癇模型組大鼠表現(xiàn)為活動減少、咀嚼、節(jié)律性點頭，頭頸上仰、前肢陣攣發(fā)作，少數(shù)大鼠豎尾或尾拍地面。拉莫三嗪組大鼠由早期的頭頸上仰、前肢陣攣發(fā)作逐漸過渡到豎毛及嘴和面部肌肉抽搐，少見豎尾或尾拍地的情況。治療前，與對照組比，模型組及拉莫三嗪組的體質(zhì)量均明顯降低(P<0.05)。治療后，與對照組比，模型組體質(zhì)量明顯降低(P<0.05)，與模型組比，拉莫三嗪組的體質(zhì)量明顯增高(P<0.05)，且呈拉莫三嗪劑量依賴性趨勢，見表1。

Table1Comparison of body mass of rats in the four experimental groups

組別Groups體質(zhì)量Body mass治療前Before treatment治療后After treatment對照組Control group302.6±42.3372.9±45.6模型組Model group255.6±40.1a274.6±40.5a拉莫三嗪低劑量組Low-dose lamotrigine group253.9±39.8306.5±41.3b拉莫三嗪高劑量組High-dose lamotrigine group254.5±37.5339.9±40.7bcF值F value5.40015.221

注：與對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與拉莫三嗪低劑量組組比，cP<0.05。

Note. Compared with the control group,aP<0.05. Compared with the model group,bP<0.05. Compared with the low-dose lamotrigine group,cP<0.05.

2.2 各組大鼠癲癇發(fā)作時間和腦電圖比較

與對照組比，模型組癲癇發(fā)作時間增高(P<0.05)，腦電圖頻率降低(P<0.05)，波幅增高(P<0.05)；與模型組比，拉莫三嗪組的癲癇發(fā)作時間降低(P<0.05)，腦電圖頻率增高(P<0.05)，波幅降低(P<0.05)，且呈拉莫三嗪劑量依賴性趨勢，見表2。

表2 各組大鼠癲癇發(fā)作時間和腦電圖比較

注：與對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與拉莫三嗪低劑量組相比，cP<0.05。

Note. Compared with the control group,aP<0.05. Compared with the model group,bP<0.05. Compared with the low-dose lamotrigine group,cP<0.05.

表3 各組大鼠海馬的氨基酸含量比較

注：與對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與拉莫三嗪低劑量組相比，cP<0.05。

Note. Compared with the control group,aP<0.05. Compared with the model group,bP<0.05. Compared with the low-dose lamotrigine group,cP<0.05.

2.3 各組大鼠海馬的氨基酸含量比較

與對照組比，模型組海馬的Asp和Glu均明顯增高(P<0.05)，Gly明顯降低(P<0.05)；與模型組比，拉莫三嗪組海馬的Asp和Glu均明顯降低(P<0.05)，Gly明顯增高(P<0.05)，且呈拉莫三嗪劑量依賴性趨勢，見表3。

2.4 免疫組化法檢測各組大鼠海馬PGP和MVP表達

PGP和MVP陽性表達均在細胞膜與細胞核。與對照組比，模型組海馬PGP和MVP陽性表達增高(P<0.05)；與模型組比，拉莫三嗪組海馬PGP和MVP陽性表達降低(P<0.05)，且呈拉莫三嗪劑量依賴性趨勢，見圖1。

圖1 免疫組化法檢測各組大鼠海馬PGP和MVP表達(× 200)Figure 1 Expression of PGP and MVP in the hoppicampal tissues detected by immunohistochemical staining

2.5 Western blot法檢測各組大鼠海馬PGP和MVP表達

與對照組比，模型組海馬PGP和MVP陽性表達增高(P<0.05)；與模型組比，拉莫三嗪組海馬PGP和MVP陽性表達降低(P<0.05)，且呈拉莫三嗪劑量依賴性趨勢，見圖2。

注：與對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與拉莫三嗪低劑量組相比，cP<0.05。圖2 Western blot檢測各組大鼠海馬PGP和MVP表達Note. Compared with the control group, aP<0.05. Compared with the model group, bP<0.05. Compared with the low-dose lamotrigine group, cP<0.05.Figure 2 Expression of PGP and MVP in the hoppicampal tissues detected by Western blotting

3 討論

Asp和Glu為腦內(nèi)興奮性氨基酸，兩者的興奮性神經(jīng)毒性作用可導致神經(jīng)細胞變性和死亡，Gly為腦內(nèi)抑制性氨基酸，在腦內(nèi)含量異?？烧T導癲癇發(fā)作，當腦內(nèi)興奮性與抑制性氨基酸的平衡被破壞，尤其是Asp和Glu增高，Gly降低，誘導癲癇發(fā)作[7-9]。本課題結(jié)果所示，與對照組比，慢性癲癇大鼠海馬區(qū)的Asp和Glu明顯增高，Gly顯著降低，同時慢性癲癇的癲癇發(fā)作次數(shù)較多，腦電圖顯示異常，且均存在統(tǒng)計學差異，由此可見腦內(nèi)興奮性和抑制性的氨基酸動態(tài)平衡被打破，表達異常則引導癲癇發(fā)作。給予拉莫三嗪治療后，慢性癲癇大鼠海馬區(qū)的氨基酸趨向平衡，即Asp和Glu明顯降低，Gly明顯增高，可見拉莫三嗪治療慢性癲癇與穩(wěn)定或改善癲癇海馬區(qū)的氨基酸水平，降低癲癇發(fā)作次數(shù)，且呈現(xiàn)劑量依賴性趨勢，與文獻報道拉莫三嗪通過改善氨基酸的遞質(zhì)活性，降低腦內(nèi)異常放電而達到治療慢性癲癇的結(jié)果一致[10-11]。

與腫瘤耐藥相似，慢性癲癇也存在耐藥現(xiàn)象，且與耐藥蛋白表達增高相關(guān)，其中被研究較為成熟的是PGP和MVP。PGP作為跨膜藥物轉(zhuǎn)運蛋白，屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族，通過排出細胞內(nèi)藥物或通過細胞內(nèi)囊泡分泌等途徑降低藥物聚集在細胞間隙，細胞質(zhì)及細胞器，達到耐藥的效果[12-14]。MVP是細胞器穹隆蛋白的主要成分，穹隆蛋白在阻止藥物靠近細胞核，降低病灶的藥物濃度并避免藥物與靶點結(jié)合中起到關(guān)鍵作用[15-16]。本課題結(jié)果顯示，與對照組比，慢性癲癇大鼠海馬中的PGP和MVP蛋白均明顯上調(diào)，且差異存在統(tǒng)計學意義，可見存在明顯的耐藥基礎(chǔ)。給予拉莫三嗪治療后，慢性癲癇大鼠海馬中的PGP和MVP蛋白均明顯下調(diào)，且劑量越高，下調(diào)越顯著，提示拉莫三嗪治療慢性癲癇可能與降低海馬中的PGP和MVP蛋白表達緊密相關(guān)。對于拉莫三嗪治療慢性癲癇可能與降低海馬中的PGP和MVP蛋白表達機理尚無明確報道，如王海燕等[17]認為拉莫三嗪降低PGP和MVP蛋白表達的機理是間接而非直接，又如Liu等[18]采用藥劑手段，以mPEG-PLA/TPGS混合膠束裝載拉莫三嗪，通過人為手段提高癲癇病灶的拉莫三嗪濃度，PGP表達明顯降低，提示拉莫三嗪可直接降低PGP表達。本文也存在以下缺陷，臨床收治的存在耐藥的慢性癲癇患者與長期服用抗癲癇藥有關(guān)，但本文制備的慢性癲癇大鼠與臨床患者的病情存在病理性的不同，再加上給與慢性癲癇大鼠的時間相對較短，對臨床治療的推薦價值有限，因此進一步的研究有必要進行長期給藥，考察長期給藥對慢性癲癇動物模型的干預(yù)效果。

綜上所述，拉莫三嗪治療慢性癲癇與降低海馬PGP、MVP蛋白及改善海馬氨基酸相關(guān)，但拉莫三嗪治在降低海馬PGP、MVP蛋白的機制仍需進一步考察。