哇巴因對肝癌細胞株P-gp表達的影響研究

楊明鎮(zhèn)　趙逵

【摘要】 目的 研究哇巴因對肝癌細胞株P-糖蛋白（P-gp）表達的影響。方法 選用人肝癌Bel-7402細胞株， 阿霉素（ADM）大劑量間斷沖擊法建立Bel-7402/ADM模型并設為耐藥組， 正常Bel-7402設為對照組。采用免疫印跡（WB）檢測兩組哇巴因干預前后P-gp表達水平。結果 哇巴因干預前， 耐藥組P-gp表達水平為（72.68±0.07）， 對照組為（22.21±0.04）;哇巴因干預后， 耐藥組P-gp表達水平為（20.61±0.04）， 對照組為（14.32±0.05）;哇巴因干預后， 兩組P-gp水平均顯著低于哇巴因干預前， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;哇巴因干預前后耐藥組P-gp水平均顯著高于對照組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 哇巴因可有效下調肝癌細胞株P-gp的表達。

【關鍵詞】 哇巴因;肝癌細胞株;P-糖蛋白

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.24.107

Effect of ouabain on the expression of P-gp in hepatocellular carcinoma cell line? ?YANG Ming-zhen， ZHAO Kui. Department of Invasive Technology， Affiliated Hospital of Zunyi Medical College， Zunyi 563003， China

【Abstract】 Objective? ?To study the effect of ouabain on the expression of P-glycoprotein （P-gp） in hepatocellular carcinoma cell line. Methods? ?The Bel-7402/ADM model of human hepatocellular carcinoma cell line Bel-7402 was established by high-dose intermittent impulse method with adriamycin （ADM） as drug-resistant group and normal Bel-7402 as control group. The expression of P-gp was detected by Western blotting （WB） before and after ouabain intervention in the two groups. Results? ?Before intervention of ouabain， drug-resistant group had P-gp expression level as （72.68±0.07）， which was （22.21±0.04） in the control group. After intervention of ouabain， drug-resistant group had P-gp expression level as （20.61±0.04）， which was （14.32±0.05） in the control group. After intervention of ouabain， both groups had significantly lower P-gp expression level than those before intervetion of ouabain， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Before and after intervention of ouabain， drug-resistant group had significantly higher P-gp expression level than the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion? ?Ouabain can effectively down-regulate the expression of P-gp in hepatocellular carcinoma cell line.

【Key words】 Ouabain; Hepatocellular carcinoma cell line; P-glycoprotein

肝癌（liver? cancer）是指發(fā)生于肝臟或從肝臟開始的惡性腫瘤， 使機體基因轉錄異常， 細胞失去正常增殖、分化、凋亡能力[1]。肝癌發(fā)病隱蔽， 初期無明顯癥狀， 病情進展迅速， 臨床癥狀多表現(xiàn)為發(fā)熱、乏力、納差、消瘦、消化道癥狀及最常見的肝區(qū)疼痛， 多因癌細胞迅速生長致肝包膜緊繃導致， 疼痛可輻射至右肩[2]。體征常見肝脾腫大、腹水黃疸等。肝癌確診時患者往往已到晚期或已發(fā)生轉移， 大多數(shù)患者無法通過手術根治， 預后差， 復發(fā)率高。化療是目前最主要治療手段[3]， 長時間使用化療藥物易導致腫瘤多藥耐藥性（multidrug resistance， MDR）[4]， 影響藥物吸收， 制約療效， 危害患者身心健康。研究表明， P-糖蛋白（P-glycoprotein， P-gp）是MDR基因編碼的一種跨膜轉運蛋白， 參與機體解毒及代謝， 可將細胞內毒性代謝產物外排出細胞， 保護細胞受損。臨床上對哇巴因干預下P-gp表達影響研究較少， 因此本文旨在探討哇巴因對肝癌細胞株P-gp表達的影響， 期望為臨床治療提供實驗和理論依據(jù)， 現(xiàn)將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1. 1 主要藥物及試劑 人肝癌Bel-7402細胞株（上海冠導生物工程有限公司）;ADM（湘潭嘉葉源生物科技有限公司）;胎牛血清（FBS）（北京雅安達生物技術有限公司）;細胞裂解液（北京智杰方遠科技有限公司）;聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）（上海邦景實業(yè)有限公司）;預染標準分子量蛋白 （上海谷研實業(yè)有限公司）。

1. 2 實驗模型制備及分組 取對數(shù)生長期人肝癌Bel-7402細胞， 0.25%胰酶消化， 1000 r/min離心3 min后收集細胞。在37℃、5% CO2、0.1 μmol/L濃度ADM條件下染毒1 h后，?0.25%胰酶消化， 1000 r/min離心3 min收集細胞， 在不加ADM培養(yǎng)瓶中繼續(xù)接種培養(yǎng)。重復以上步驟， 逐漸提高ADM藥物濃度至1 μmol/L濃度， 細胞仍能穩(wěn)定良好生長即肝癌耐藥Bel-7402/ADM造模成功。將正常Bel-7402設為對照組， Bel-7402/ADM設為耐藥組。

1. 3 觀察指標 采用免疫印跡（Western Blot， WB）檢測P-gp表達水平， 取正常人肝癌Bel-7402及Bel-7402/ADM細胞， FBS清洗3次， 加入細胞裂解液， 離心15 min， 取上清液加入蛋白樣緩沖液混勻， 置入100℃沸水變性5 min后-20℃保存?zhèn)溆?。將凝膠置于電泳槽， 加甘氨酸電泳緩沖液， 取總蛋白上樣， 80 V電泳， 內參照為β-actin， 藍色蛋白樣緩沖液與上下分離線>3 cm時停止電泳， 取出凝膠去除膜與凝膠氣泡， 兩側放上濾紙， 置入轉膜液槽， 80 V電壓4℃過夜。BTBS洗膜3次， 加入二抗溫育1 h， TBS洗膜3次， 加入增強化學發(fā)光（ECL）在Bio-RAD上成像并分析密度。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

哇巴因干預前， 耐藥組P-gp表達水平為（72.68±0.07）， 對照組為（22.21±0.04）;哇巴因干預后， 耐藥組P-gp表達水平為（20.61±0.04）， 對照組為（14.32±0.05）;哇巴因干預后， 兩組P-gp水平均顯著低于哇巴因干預前， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;哇巴因干預前后耐藥組P-gp水平均顯著高于對照組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。耐藥組P-gp表達凝膠蛋白電泳圖見圖1。

3 討論

我國作為肝癌大國[5]， 每年新發(fā)肝癌病例約占全球的50%， 且發(fā)病率逐年增長。肝癌起病隱匿， 初期多在肝病隨訪或體檢中偶然發(fā)現(xiàn)， 患者無癥狀， 體格檢查也缺乏腫瘤指征， 出現(xiàn)癥狀就醫(yī)時多進入中晚期， 大部分失去根治性手術機會， 而化療是此階段患者最有效治療方式， 但肝癌在腫瘤死亡率中僅次于肺癌居于第二位， 最主要是因部分患者化療無效或有效逐漸轉為無效現(xiàn)象產生， 出現(xiàn)對未接觸過、多種化學結果和作用機理不同的化療藥物交叉耐藥， 即MDR。MDR[6]嚴重影響腫瘤治療效果， 是肝癌化療失敗的主要原因， 嚴重威脅患者生命安全， 最先發(fā)現(xiàn)其和細胞膜糖蛋白增加有關， MDR由多種因素介導， 包括化療藥物造成損傷， 其中一些酶發(fā)揮作用， 使細胞自我修復能力增強， 導致細胞耐藥（如蛋白激酶C）;腫瘤細胞凋亡基因難以正常介導細胞凋亡導致耐藥機制（如CD95/CD95L）;微環(huán)境改變導致腫瘤細胞對化療藥物敏感性降低;某些信號傳導因子改變[如細胞轉錄因子蛋白家族（NF-κB）]及其中最主要的P-gp介導化療藥物外排。mdr-1基因位于染色體7q21-21， 經(jīng)糖基化后形成170KD的P-gp， 屬于一種跨膜轉運蛋白， 由跨膜疏水區(qū)和ATP結合親水區(qū)構成， 主要定位在細胞膜上。

目前國內外對肝癌MDR已有較多文獻報道， 但對哇巴因藥物下肝癌細胞株的P-gp表達的影響研究較少。P-gp[7]廣泛分布全身多個器官及組織中， 參與藥物體內轉運， 腫瘤細胞長期接觸化療藥物， mdr-1基因被誘導大量表達P-gp， 此時P-gp結合藥物分子并利用ATP水解能量將疏水親脂性化療藥物在尚未發(fā)揮細胞毒性時排除細胞外， 降低藥物濃度， 細胞由此獲得耐藥性， P-gp發(fā)揮外排作用依賴ATP水解釋放能量， P-gp包含2個ATP結合位點， P-gp識別并結合藥物， 其中1個ATP激活水解釋放能量， P-gp結構改變釋放底物至細胞外， 隨后第2個ATP水解P-gp恢復原狀態(tài)， 其影響P-gp與藥物結合、外排、強度及P-gp結構恢復。針對P-gp介導的腫瘤MDR， 可通過增加細胞內Ca2+濃度在mdr-1基因轉錄翻譯上抑制P-gp合成及活性， 影響膜功能降低P-gp外排作用， 提高藥物濃度， 解決腫瘤細胞耐藥性。P-gp外排作為ATP能量依賴泵， 也可以從降低外排所需能量入手。有研究發(fā)現(xiàn)低濃度哇巴因能抑制腫瘤生長[8， 9]， 作為細胞膜上鈉鉀泵（Na+-K+-ATP ase）抑制劑， 可通過Na+-K+-ATP酶α亞基特異性可逆結合抑制血管內皮細胞生長， 降低細胞黏附性， 促進鈉鉀泵內吞加快酶的溶解， 減少細胞內鈉鉀泵含量， 抑制鈉鉀泵功能， 導致細胞內ATP分解減少， 降低P-gp將藥物排除體外能力， K+濃度下降或哇巴因可抑制鈉鉀ATP酶50%以上導致Na+濃度上升， 引起細胞膜超極化， 激活Na+/Ca2+

對向轉運體， Ca2+濃度上升， 影響mdr-1基因轉錄翻譯P-gp。本研究以非耐藥人肝癌Bel-7402細胞系為親代細胞， 采用ADM誘變產生Bel-7402/ADM模型， 以WB測定哇巴因干預前后P-gp表達， 利用抗原抗體特異反應， 有效排除其他蛋白質干擾。本文研究結果顯示， 哇巴因干預前， 耐藥組P-gp表達水平為（72.68±0.07）， 對照組為（22.21±0.04）;哇巴因干預后， 耐藥組P-gp表達水平為（20.61±0.04）， 對照組為（14.32±0.05）;哇巴因干預后， 兩組P-gp水平均顯著低于哇巴因干預前， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;哇巴因干預前后耐藥組P-gp水平均顯著高于對照組， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。由此說明腫瘤細胞耐藥時P-gp呈高表達狀態(tài)， 哇巴因可有效降低P-gp表達， 耐藥組干預后可恢復至對照組未受干預狀態(tài)， 增加腫瘤細胞對ADM敏感性， 實現(xiàn)逆轉耐藥作用。

綜上所述， 哇巴因可有效下調肝癌細胞株的P-gp表達。

參考文獻

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