LKB1/Akt/mTOR通路介導(dǎo)調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞對抗EGFR抑制劑耐藥研究

(中國人民解放軍陸軍第八三集團(tuán)軍醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

膠質(zhì)瘤是一種常見的預(yù)后較差的腦腫瘤，其中包括成年膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、間變性少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、兒童膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和彌漫性內(nèi)分泌神經(jīng)膠質(zhì)瘤[1]。其五年生存率為0%～60%，迫切需要新的治療方法[2]。EGFR基因擴(kuò)增在膠質(zhì)瘤中常見，但EGFR TKI療效欠佳[3]。一項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，新診斷的EGFRvIII表達(dá)的膠母患者使用Rindopepimut 生存期未延長。Rindopepimut對膠母患者的免疫療效可能需要通過聯(lián)合用藥來實(shí)現(xiàn)。一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，成人復(fù)發(fā)低級別膠質(zhì)瘤使用mTOR抑制劑依維莫司后疾病較穩(wěn)定，6個月PFS為84%，12個月PFS為47%。依維莫司的抗腫瘤作用同時存在腫瘤血管結(jié)構(gòu)異常。以上結(jié)果支持依維莫司在低級別膠質(zhì)瘤中做進(jìn)一步探索。研究旨在解析膠質(zhì)瘤細(xì)胞對EGFR TKI的療效，以及探討LKB1/Akt/mTOR信號通路在膠質(zhì)瘤細(xì)胞對抗EGFR TKI的耐藥的作用和分子機(jī)制，這為膠質(zhì)瘤EGFR TKI等靶向治療提供新的治療策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及材料

選用SPF級別的BALB/C荷瘤鼠(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，雄性，體重18～22 g，6～8 周齡，在SPF 級條件下無菌層流飼養(yǎng)，恒溫恒濕，所有的飲用水和食物均進(jìn)行滅菌。所有動物實(shí)驗(yàn)操作符合動物實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，遵循實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定。Western Blot所需試劑購自中國碧云天公司；pEGFR/EGFR抗體，pAkt/Akt抗體，pS6K/S6K抗體，pERK/ERK抗體，pSTAT3/STAT和LKB1抗體和β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG均購于美國Bioworld公司。厄洛替尼，LKB抑制劑1093222-27-5和Akt抑制劑LY294002購自美國Sigma公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫(American type culture collection, ATCC)；穩(wěn)定表達(dá)EGFRvIII的U87細(xì)胞株由天津醫(yī)科大學(xué)提供。U87細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入100 U/mL的青霉素和100 U/mL的鏈霉素，置于培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 MTT法

細(xì)胞以5 000個/孔的密度種植于96孔板內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞生長融合達(dá)70%時，給予細(xì)胞相應(yīng)處置，細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后給予相應(yīng)藥物處理，若無需轉(zhuǎn)染直接用藥物處理24 h，然后進(jìn)行檢測。為了避免藥物處理時間過長導(dǎo)致混雜因素過多，藥物處理時間不超過24 h。藥物處理時間達(dá)到預(yù)定時，每孔加入10μL MTT，在37℃孵育4 h，終止培養(yǎng)。棄掉孔內(nèi)液體，避光條件下加入200 μL 二甲基亞砜，放置搖床晃動10 min使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀于490 nm波長處測定各孔的吸光度值，并記錄結(jié)果。

1.4 Western Blot

建模6 h、24 h和48 h后處死大鼠，剝離海馬到EP管內(nèi)放置-80℃冰箱中儲存。復(fù)蘇后將組織研磨并加入RIPA裂解在SDS-PAGE電泳凝膠上分離。轉(zhuǎn)移到PVDF膜，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h。ECL檢測標(biāo)記信號。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 厄洛替尼上調(diào)AKT和S6K蛋白磷酸化水平

檢測厄洛替尼作用于EGFR野生型U87細(xì)胞和EGFRvIII U87細(xì)胞，Western Blot檢測可見pEGFR表達(dá)水平顯著降低，而AKT和S6K蛋白磷酸化水平明顯增加，同時可見ERK和STAT3磷酸化水平無明顯變化。見圖1。采用siRNA 下調(diào)LKB，與對照組相比，厄洛替尼增加的Akt和S6K磷酸化水平受到顯著抑制。見圖2。

圖1 厄洛替尼作用于EGFR野生型和EGFRvIII U87細(xì)胞的蛋白

圖2 LKB siRNA處理厄洛替尼Akt和S6K蛋白磷酸化

2.2 LKB抑制劑和Akt抑制劑可克服厄洛替尼耐藥

厄洛替尼并未改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EGFR野生型U87細(xì)胞和EGFRvIII U87細(xì)胞活性，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LKB抑制劑和Akt抑制劑明顯降低腫瘤活性，而MEK抑制劑并無相關(guān)作用。見圖3。

圖3 厄洛替尼作用于EGFR野生型和EGFRvIII U87細(xì)胞活性

2.3 LKB抑制劑和Akt抑制劑聯(lián)合厄洛替尼抑制荷瘤鼠腫瘤增長

采用EGFR野生型U87細(xì)胞種植荷瘤鼠，與對照組相比，厄洛替尼聯(lián)合LKB抑制劑可顯著降低腫瘤生長，如圖4a所見，而厄洛替尼、LKB抑制劑并不影響荷瘤鼠腫瘤大小。與對照組相比，厄洛替尼聯(lián)合Akt抑制劑可顯著降低腫瘤生長，如圖4b所見，而厄洛替尼、Akt抑制劑并不影響荷瘤鼠腫瘤大小。

圖4 厄洛替尼聯(lián)合LKB/Akt抑制劑作用于荷瘤鼠

3 討論

目前腫瘤治療為精準(zhǔn)靶向和個體化治療，尤其是在基因突變較少的兒童低級別膠質(zhì)瘤中，MAPK信號通路BRAF基因變異常見膠質(zhì)瘤中[2]。BRAF V600E突變的低級別兒童膠質(zhì)瘤患者對常規(guī)放化療不敏感，10年的無進(jìn)展生存率(DFS)為27% ，顯著低于BRAF野生型60.2%[3]。兒童膠母中較常見的致癌基因融合約占10%，MET基因融合激活MAPK信號通路，破壞細(xì)胞周期調(diào)控，誘導(dǎo)腫瘤進(jìn)展[3]。MET抑制劑的模型研究發(fā)現(xiàn)其能抑制MET突變的腫瘤生長。PI3K/ATK/mTOR信號通路的抑制在一項(xiàng)Ⅱ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，成人復(fù)發(fā)低級別膠質(zhì)瘤使用mTOR抑制劑依維莫司后疾病較穩(wěn)定。本研究檢測厄洛替尼作用于EGFR野生型U87細(xì)胞和EGFRvIII U87細(xì)胞，Western Blot檢測可見pEGFR表達(dá)水平顯著降低，而AKT和S6K蛋白磷酸化水平明顯增加，同時可見ERK和STAT3磷酸化水平無明顯變化。采用siRNA 下調(diào)LKB，與對照組相比，厄洛替尼增加的Akt和S6K磷酸化水平受到顯著抑制。厄洛替尼并未改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞的EGFR野生型U87細(xì)胞和EGFRvIII U87細(xì)胞活性，與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LKB抑制劑和Akt抑制劑明顯降低腫瘤活性，而MEK抑制劑并無相關(guān)作用。此外，還有其他靶向治療藥物，比如CDK4/6 抑制劑帕布利昔布，其可抑制mTOR下游信號通路活性，使mTOR信號通路激活。依維莫司抑制mTOR通路，激活Ras的介導(dǎo)ERK，帕布利西布可結(jié)合抑制ERK。依維莫司與帕布利昔布組合治療顯著干擾了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)的代謝，導(dǎo)致大量細(xì)胞凋亡，且依維莫司顯著提高了帕布利昔布在腦中的濃度。CDK4/6與mTOR抑制劑對GBM有治療潛力，建議開展臨床試驗(yàn)進(jìn)一步評估。DS7423為PI3K/mTOR雙靶點(diǎn)抑制劑, 在小鼠中能穿越血腦屏障。DS7432對PI3K通路激活且PTEN失活的膠母細(xì)胞系有抑制作用[4，5]。NVP-BEZ235是 PI3K/mTOR 雙靶點(diǎn)抑制劑, 能增強(qiáng)放療對成人和兒童膠母細(xì)胞系中的殺傷作用并導(dǎo)致早期的腫瘤代謝改變，此變化通過核磁共振光譜呈現(xiàn)。隨著一代mTOR抑制劑雷帕霉素、二代mTOR抑制依維莫司等的涌現(xiàn)，耐藥問題也隨之而來，而三代mTOR抑制劑Rapalink-1的研究為耐藥問題帶來曙光。

總之，本研究表明LKB1/Akt/mTOR通路參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞對EGFR TKI耐藥，通路抑制劑可改善TKI耐藥，這為膠質(zhì)瘤克服EGFR TKI靶向治療提供理論依據(jù)。