劉 丹， 李然紅， 陳 鑫， 王立鳳

(牡丹江師范學院， 黑龍江 牡丹江 157012)

黃酮類化合物是多酚類次生代謝物，在植物體中主要參與植物的生長繁殖、花色形成、抗病性及非生物環(huán)境脅迫等生理作用，具有抗氧化、消除自由基等功效。查爾酮異構酶(Chalcone isomerase,CHI)是黃酮類代謝途徑中關鍵酶，在黃酮代謝調(diào)控方面起重要作用。1987 年，CHI基因首次從法國豌豆中分離出來，隨后在玉米、豌豆、菜豆等多種植物中克隆分離到該基因[1-3]。CHI基因為多類型家族，根據(jù)特異性分為TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ、TypeⅣ共4種類型[4]，許多植物中同時存在多種類型的CHI基因，如甘草中有2種類型CHI基因，豆科植物百脈根植物中存在3種CHI基因[5-6]。作為黃酮類代謝途徑中的關鍵酶，CHI基因能夠調(diào)控查爾酮的積累，進而影響其黃酮類化合物的含量，在植物的生長發(fā)育、花葉變色、抵抗性等方面作用顯著。BEDBAR等[7]研究發(fā)現(xiàn)，CHI基因能夠影響矮牽牛查爾酮的積累，改變矮牽?；ǚ鄣念伾煌瑫r大麥和洋蔥CHI基因失活導致黃酮類化合物的含量急劇下降，而過量表達CHI基因則含量顯著提高[8]。狗棗獼猴桃〔Actinidiakolomikta(Maxim.& Rupr.) Maxim.〕別名狗棗子，是獼猴桃科(Actinidiacese)獼猴桃屬(Actinidia)落葉藤本植物，是最為耐寒的獼猴桃種類之一[9]。目前關于狗棗獼猴桃的研究主要集中在有效物質(zhì)提取、營養(yǎng)和醫(yī)藥價值開發(fā)及繁殖技術上，有關其抗性基因的研究尚少。因此，以狗棗獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考，篩選到狗棗獼猴桃查爾酮異構酶AkCHI1的cDNA序列，利用生物信息學方法對其進行預測和分析，以期為AkCHI1功能研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

狗棗獼猴桃AkCHI1 cDNA序列從牡丹江師范學院植物遺傳育種實驗室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得；中華獼猴桃變種(PSR86069.1Actinidiachinensisvar.chinensis)、茶樹(XP_028087110.1Camelliasinensis)；芝麻(XP_011079862.1Sesamumindicum)、黑穗槐(XP_021279652.1Herraniaumbratica)、可可樹(XP_017977137.1Theobromacacao)、葡萄(CBI28694.3Vitisvinifera)、歐洲橄欖(XP_022864712.1Oleaeuropaeavar.sylvestris)、東方苔草(PON84200.1Tremaorientale)、蘋果(XP_008368846.1Malusdomestica)；山黃麻(PON55262.1Parasponiaandersonii)、番木瓜(XP_021898058.1Caricapapaya)、紫花風鈴(PIN18250.1Handroanthusimpetiginosus)、核桃(XP_018856033.1Juglansregia)、榴蓮(XP_022771113.1Duriozibethinus)、馬鈴薯(XP_006352775.1Solanumtuberosum)、美女煙草(XP_009803839.1Nicotianasylvestris)、番茄(XP_004242334.1Solanumlycopersicum)等植物氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載。

1.2 方法

AkCHI1的理化性質(zhì)用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/ protparam)進行分析；NCBI-CDD進行保守結構域及蛋白家族預測(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)；Inter-ProtScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/ search/sequence-search)預測功能位點；NetNGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)對N-糖基化位點進行預測；NetOGlyc(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)對O-糖基化位點進行預測；采用 PredictProtein 數(shù)據(jù)庫(https://www.predictprotein.org/)對AkCHI1蛋白進行二級結構預測；使用 SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在線軟件預測蛋白質(zhì)三級結構。從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中獲得18條不同植物的氨基酸序列信息，利用MEGA 5.1的Neighbor-joining法構建蛋白質(zhì)系統(tǒng)進化樹。

同時，還要大量增加新質(zhì)專業(yè)力量，依托信息產(chǎn)業(yè)、地質(zhì)測繪、航空航天、交通運輸、裝備制造等行業(yè)部門，編建戰(zhàn)略投送、遠程預警、信息通信、網(wǎng)絡攻防、海上救援、高技術裝備技術保障等新質(zhì)力量，適應支援保障打贏信息化戰(zhàn)爭的需要。

2 結果與分析

2.1 AkCHI1的理化性質(zhì)

對AkCHI1氨基酸序列分析表明，狗棗獼猴桃AkCHI1基因cDNA全長為1 168 bp，編碼區(qū)(CDS)為cDNA上第81～941個堿基，共編碼287個氨基酸，分子量31 610.03 D，理論等電點為9.30，負電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為33，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為41，分子式為C1386H2242N402O424S9，總原子數(shù)4 463，親水性(GRAVY)的平均水平為-0.237。不穩(wěn)定指數(shù)為55.60，說明該蛋白非穩(wěn)定。由圖1可見，該蛋白中含量最多的為絲氨酸，占11.5%，其次為亮氨酸和精氨酸，各占9.8和8.4%，含量最少的為色氨酸，為0.3%。經(jīng)預測(圖2)，該基因蛋白的整個肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分的最大值為2.122，在36個氨基酸處；最小值為-2.511，在24個氨基酸處。蛋白質(zhì)存在3個高分值(>2)，6個低分值(<-2)，根據(jù)蛋白質(zhì)親水和疏水的得分判定該蛋白為親水蛋白。

圖1 AkCHI1基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成

Fig.1 Amino acid compositions of protein encoded by theAkCHI1 gene

圖2 AkCHI1蛋白的親水/疏水性

Fig.2 Hydrophilicity/hydrophobicity analysis of AkCHI1

2.2 AkCHI1的信號肽及跨膜結構

滴滴的企業(yè)使命宣稱是“讓出行更美好”，而滴滴似乎卻一直沉浸在商業(yè)競爭的慣性思維中，忽視了自身所帶有的公共屬性，并任憑自身壟斷性的優(yōu)勢，一次次危害公共利益。在出行這件事上，最重要的始終是安全問題，但愿滴滴能通過這些血淋淋的生命教訓，真正把乘客安全問題重視起來，及時有效地對平臺內(nèi)部進行整改，而不是每次事件發(fā)生后換來的一篇不痛不癢的道歉信。

注：C值、S值和Y值分別是原始剪切位點、信號肽和綜合剪切位點的分值。

Note: The C value,S value and Y value were the scores of original shear site,signal peptide and comprehensive shear site respectively.

圖3 AkCHI1蛋白的信號肽及跨膜結構

Fig.3 Signal peptide and transmembranne domain of AkCHI1

2.3 AkCHI1功能位點及結構域

由表1可見，AkCHI1上含有8個蛋白激酶C磷酸化位點、4個酪蛋白磷酸激酶II磷酸化位點、3個十四烷?；稽c。對N-糖基化位點進行預測表明，該蛋白內(nèi)有1個潛在的N-糖基化位點，在67(NRSS)氨基酸處。O-糖基化是另一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，O-糖鏈能維持所連接蛋白質(zhì)部分的空間構象，NetOGlyc4.0 server對O-糖基化位點進行預測，預測分數(shù)均大于0.5的認為是陽性，故推測該蛋白內(nèi)共含11個O-糖基化位點。

2.4 AkCHI1的二級、三級結構

對AkCHI1的二級結構預測表明，組成AkCHI1的287個氨基酸中，42.51%的氨基酸可能會形成螺旋，19.86%的氨基酸可能形成延伸鏈，3.14%的氨基酸可能形成轉(zhuǎn)角，34.49%的氨基酸可能形成無規(guī)則卷曲，無二硫鍵和特殊的二級結構。對AkCHI1蛋白進行三級結構預測(圖5)，該結構主要由螺旋和無規(guī)則卷曲組成，在第82～283個氨基酸組成的三級結構，含有查爾酮異構酶結構域。

經(jīng)預測(圖3)，AkCHI1蛋白不含信號肽，D值為0.196(<0.450)，不存在跨膜結構。

圖4 AkCHI1蛋白的保守序列

圖5 AkCHI1蛋白的三級結構

Fig.5 Tertiary structure prediction of AkCHI1 protein

2.5 AkCHI1的蛋白質(zhì)修飾位點

對AkCHI1保守序列及蛋白家族預測表明，AkCHI1同時具有Chalcone2、Chalcone3的保守序列，是Chalcone3(PLN03174)家族的一員(圖4)。

2.6 AkCHI1的氨基酸序列同源性

AkCHI1氨基酸序列與18種植物的CHI氨基酸序列進行同源性分析表明(圖6)，狗棗獼猴桃與榴蓮的親緣關系較近，而與葡萄等植物的親緣關系較遠。

2009年新修訂的《歐盟排放交易指令》對2012年年底之前注冊的項目從2013年起產(chǎn)生的CERs作了詳細說明，在未達成有法律效力的國際減排協(xié)議的情況下，歐盟各成員國至少在2015年5月31日前有權利但非義務使用特定項目類型的CERs。歐盟氣候委員會于2011年1月21日通過的草案明確規(guī)定，2013年1月1日起 EU—ETS不得使用來自HFC23項目和己二酸N2O項目產(chǎn)生的 CERs，2013年前產(chǎn)生的 CERs可以使用到2013年4月30日。

表1 AkCHI1蛋白的修飾位點

圖6 CHI1的蛋白系統(tǒng)進化樹

Fig.6 System phylogenetic tree of CHI1

3 結論

CHI基因具有調(diào)節(jié)植物組織顏色及調(diào)控類黃酮生物合成的主要功能，在番茄等植物中分析得到，CHI基因能夠控制花瓣、果皮等組織的顏色，并在黃酮類物質(zhì)代謝中是關鍵酶類[1]。因此，分析篩選AkCHI1基因cDNA序列信息，并對其進行生物信息學分析，為進一步研究狗棗獼猴桃花葉及黃酮類物質(zhì)代謝調(diào)控機制提供依據(jù)。結果表明，AkCHI1基因cDNA總長1 168 bp，CDS為861 bp，編碼的蛋白由287個氨基酸構成。具有Chalcone2、Chalcone3的保守序列，是Chalcone3(PLN03174)超家族的一員，為親水性非穩(wěn)定的蛋白。在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST，與AkCHI1相比的100條CHI基因的氨基酸序列中，一致性最高的達到96.04%，最低的也為57.67%，說明在不同的植物中，CHI基因的氨基酸序列十分保守。選取18條氨基酸序列與AkCHI1進行比對表明，狗棗獼猴桃與榴蓮的親緣關系較近，而與葡萄等植物的親緣關系較遠。