細胞周期調(diào)節(jié)蛋白1在胰腺癌中的表達及臨床意義

杜秋國，張日新，葉嘯，朱嶺

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院后湖院區(qū) 肝膽胰外科，湖北 武漢，430014）

胰腺癌是致死性極高的惡性腫瘤，90%的胰腺癌起源于胰腺導管上皮，其1年和5年生存率分別為26%和8%，胰腺癌在確診時大部分已發(fā)展為中晚期[1-3]，預(yù)后較差。細胞周期調(diào)節(jié)蛋白1（speedy/RINGO cell cycle regulator family member A，Spy1）是Speedy/Ringo 細胞周期調(diào)控蛋白家族成員之一，通過激活周期蛋白激（cyclin-dependent kinases，CDKs）控制細胞增殖[4-5]。Spy1的表達能夠在細胞周期G1晚期和整個S期中特異性結(jié)合并激活周期素依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2），促進CDK抑制因子p27降解從而促進細胞增殖[6]。Spy1的功能在多種腫瘤中已有報道，在乳腺癌中，Spy1蛋白高表達，敲低Spy1表達可抑制乳腺癌細胞增殖[7]。Spy1在肝細胞癌中表達水平高于對應(yīng)的癌旁組織，Spy1高表達的肝細胞癌患者預(yù)后差[8]。Spy1在結(jié)腸癌組織中高表達，且其表達水平與結(jié)腸癌患者臨床病理因素顯著相關(guān)[9]，然而Spy1在胰腺癌組織中的表達鮮見報道。本文旨在探討Spy1在胰腺癌組織中的表達，探討其表達水平與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織標本收集

收集2012年12月—2014年12月在華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院肝膽胰脾外科接受胰腺癌切除術(shù)的患者，共85例，其中胰體尾切除術(shù)有35例，胰十二指腸切除術(shù)有50例。病理類型分布：鱗癌5例，胰腺導管腺癌60例，黏液癌20例。TNM分期中I+II期66例，III期18例，IV期1例。納入標準：⑴ 經(jīng)手術(shù)或病理診斷確診為胰腺癌的患者；⑵ 臨床檢驗及隨訪資料完整；⑶ 胰腺癌的治療遵循NCCN指南[10]。剔除標準：⑴ 臨床或隨訪資料不全者；⑵ 患者存在其他部位腫瘤者。組織標本經(jīng)手術(shù)切除后分別做成石蠟標本和-80 ℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆?。本研究?jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意并實施。

1.2 病歷收集及隨訪

收集患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期（美國癌癥協(xié)會第七版）[11]、腫瘤分化程度等資料。采用門診或電話隨訪，每3個月隨訪1次，行腹部彩超或CT及腫瘤標志物檢查，隨訪內(nèi)容包括患者復(fù)發(fā)及死亡情況。無瘤生存時間定義為從術(shù)后到腫瘤復(fù)發(fā)或隨訪截止時間，總生存時間定義為從術(shù)后到患者死亡或隨訪截止時間。隨訪截止至2018年12月，最長隨訪時間6年，共2例失訪。

1.3 實驗試劑

Spy1兔抗人多克隆抗體購自美國BD公司，羊抗鼠或羊抗兔二抗購自美國Invitrogen公司，兩步法免疫組化試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.4 免疫組化和免疫組化評分

石蠟標本經(jīng)切片制作4 μ m 石蠟切片，切片于65 ℃烘片2 h，經(jīng)二甲苯和梯度酒精常規(guī)脫蠟至水。3%雙氧水室溫滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min?？乖迯?fù)方法采用檸檬酸鈉緩沖液微波加熱至沸騰5 min，自然冷卻后清洗3遍。3%牛血清蛋白封閉20 min后甩去多余液體，滴加Spy1抗體稀釋液（1:200）4 ℃孵育過夜，清洗3次。加入二抗（1:500），并于37 ℃下孵育2 h，顯色劑顯色，出現(xiàn)棕黃色時終止反應(yīng)，并用蘇木素染核。計分規(guī)則如下：p為陽性細胞百分比。0分，陽性細胞＜5%；1分，陽性細胞5%～35%；2分，陽性細胞36%～65%；3分，陽性細胞＞66%。i為染色深淺，0分為不顯色；1分代表淺黃色；2分代表棕黃色；3分代表深褐色。對胰腺癌組織進行評分，總分計算依據(jù)∑pi，其中總分≥5分，為高表達組，共55例；總分＜5分，為低表達組，共30例。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS20.0（USA，Chicago）統(tǒng)計軟件。服從正態(tài)分布的計量資料以平均值±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗，不服從正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)和四分位間距表示，組間比較采用秩和檢驗，計數(shù)資料以病例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法，Kaplan-Meier和Log-rank用于分析和比較無瘤生存率和總生存率差異，Cox風險比例模型用于單因素和多因素分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Spy1 在胰腺癌組織中的表達

免疫組化示：胰腺癌組織中Spy1主要表達于細胞核，部分在細胞漿中（圖1），在85例患者中，Spy1高表達者有55例（64.7%），Spy1低表達者有30例（35.3%）。

圖1 免疫組化檢測胰腺癌組織中Spy1 蛋白表達（×200） Figure 1 Immunohistochemichal staining for Spy1 expression in pancreatic cancer tissues (×200)

2.2 Spy1 表達與胰腺癌臨床病理特征 的關(guān)系

Spy1蛋白表達與年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管浸潤、腫瘤部位和病理類型無明顯關(guān)系（均P＞0.05），而與腫瘤大小、TNM分期和分化程度明顯相關(guān)（均P＜0.05）（表1）。

2.3 Spy1 表達與胰腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

Spy1高表達組1年無瘤生存率為49.3%，Spy1低表達組為72.8%，Spy1高表達組1年無瘤生存率低于Spy1低表達組（P＜0.01）；Spy1高表達組3年無瘤生存率21.6%，Spy1低表達組3年無瘤生存率為49.4%，Spy1高表達組3年無瘤生存率低于Spy1低表達組（P＜0.01）。Spy1高表達組1年總生存率為59.6%，Spy1低表達組為82.3%，Spy1高表達組1年總生存率低于Spy1低表達組（P＜0.01）；Spy1高表達組3年總生存率為25.6%，Spy1低表達組為57.1%，Spy1高表達組3年總生存率低于Spy1低表達組（P＜0.01）（圖2）。

2.4 影響胰腺癌患者無瘤生存率的危險因素分析

單因素分析示Spy1高表達（P=0.018）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）為影響胰腺癌患者無瘤生存的危險因素；多因素分析示Spy1高表達（P=0.023）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.005）為影響無瘤生存率的獨立危險因素（表2）。

表1 Spy1 表達與臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table 1 The relations of Spy1 expression with the clinicopathologic characteristics [n (%)]

圖2 不同Spy1 表達水平胰腺癌患者的生存曲線Figure 2 The survival curves of pancreatic cancer patients with different Spy1 expression levels

表2 影響胰腺癌患者無瘤生存率的單因素和多因素分析Table 2 Univariate and multivariate analysis of the risk factors for disease-free survival rates in pancreatic cancer patients

2.5 影響胰腺癌患者總生存率的危險因素分析

單因素分析示分化程度（P=0.031）、TNM分期（P=0.041）及Spy1表達（P=0.018）為影響患者總生存的危險因素；多因素分析示Spy1高表達（P=0.035）及TNM分期（P=0.037）為影響胰腺癌患者總生存的獨立危險因素（表3）。

表3 影響胰腺癌患者總生存率的單因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analysis of the risk factors for overall survival rates in pancreatic cancer patients

3 討 論

由于胰腺癌具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移早的特點，預(yù)計2030年胰腺癌將成為第二大致死性腫瘤[12]。大約有20%的胰腺癌患者在診斷時為可手術(shù)切除的局部腫瘤，有15%～20%的患者確診時為不可手術(shù)的局部晚期腫瘤[13-14]。胰腺癌的發(fā)生不受年齡和性別影響，其5年生存率僅8%[15-16]。盡管目前有多種手段治療胰腺癌，但其中位生存期僅6～12個月[17]。尋找和鑒定與胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)的分子標志物對指導胰腺癌治療和改善預(yù)后尤為重要。

細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）是一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞分裂和轉(zhuǎn)錄翻譯中具有重要作用，其功能的發(fā)揮受到一系列周期蛋白的調(diào)控[18-19]。Spy1是一個新的細胞周期調(diào)控蛋白。Porter等[6]發(fā)現(xiàn)Spy1可消除細胞周期抑制蛋白P27對細胞周期的阻滯，增強CDK2對組蛋白H1的蛋白激酶活性，通過促進G1/S期轉(zhuǎn)換促進細胞增殖。在細胞發(fā)生DNA損傷時，Spy1表達水平顯著升高，通過激活CDK2來應(yīng)對DNA損傷從而保護細胞存活[20]。Spy1在疾病中的作用也有所報道[21]，Spy1可通過依賴c-Jun氨基末端激酶信號通路調(diào)控軸突維持因子的磷酸化和降解，在損傷性軸索變性疾病中發(fā)揮重要功能。在腫瘤中，Spy1在調(diào)控膠質(zhì)瘤干細胞CD133+的細胞群體分裂中發(fā)揮重要作用[22]。在上皮性卵巢癌中，Spy1隨腫瘤級別的增高表達量增加，高表達Spy1與卵巢癌預(yù)后不良相關(guān)，在細胞系中敲低Spy1表達，顯著抑制卵巢癌細胞增殖并促進細胞凋亡[23]。研究[9]發(fā)現(xiàn)，Spy1高表達于結(jié)腸癌組織中，其表達水平與惡性臨床病理因素相關(guān)，并可作為評估結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨立危險因素。

本研究發(fā)現(xiàn)Spy1 在胰腺癌組織中表達存在差異，其中Spy1高表達占64.7%，Spy1低表達占35.3%，提示胰腺癌組織中Spy1以高表達為主，這與其他腫瘤表達情況報道一致[23]。本研究發(fā)現(xiàn)Spy1 蛋白表達與腫瘤大小、TNM 分期和分化程度等惡性臨床病理特征相關(guān)，這些惡性因素正是患者術(shù)后預(yù)后不佳的原因。Spy1高表達組的胰腺癌患者術(shù)后無瘤生存率及總生存率也低于低表達組。單因素和多因素Cox風險比例回歸模型示，Spy1是影響胰腺癌患者術(shù)后預(yù)后不良的獨立危險因素。

Spy1發(fā)揮腫瘤生物學功能的機制已有報道。Spy1一方面通過直接結(jié)合CDK2影響其活性，另一方面，Spy1直接結(jié)合P27影響其穩(wěn)定性，通過調(diào)節(jié)CDK2活性和P27穩(wěn)定性來調(diào)控細胞周期，進而影響細胞增殖[24]。McGrath等[25]進一步通過解析Cdk2-Spy1和p27-Cdk2-Spy1復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)揭示，Spy1通過結(jié)合CDK2改變其空間構(gòu)象從而影響其活性，Spy1缺少周期蛋白結(jié)合位點，導致P27對CDK-Spy1復(fù)合物的親和力下降，從而影響細胞周期和增殖。報道[26]顯示Spy1通過激活ERK信號通路導致雌激素受體α的激活，促進腫瘤細胞對化療藥物如他莫昔芬的耐受。

當然，本研究僅限于分析胰腺癌患者臨床病理因素與Spy1表達水平的關(guān)聯(lián)性研究，缺乏機制研究。根據(jù)本研究結(jié)果，結(jié)合之前的報道推測，Spy1 在胰腺癌中異常高表達的原因和在胰腺癌中所起的作用可能包括：首先，Spy1在胰腺癌中高表達的原因可能是表觀遺傳修飾的改變，包括微小RNA調(diào)控缺失及本身基因的突變等；其次，Spy1 在胰腺癌中的作用可能是促進腫瘤細胞生長、加速腫瘤進展和遠處轉(zhuǎn)移等。然而，Spy1在胰腺癌進展中的具體分子機制值得進一步研究。

綜上，Spy1在胰腺癌組織中高表達，且與預(yù)后不良相關(guān)。Spy1高表達為影響胰腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素。