棘托竹蓀水溶性多糖理化性質(zhì)、單糖組成和固體形貌研究

張全才 李鷗葉 施曉丹 黃延盛 殷軍藝 張 爽 聶少平*

（1無限極（中國）有限公司 遼寧營口 115000

2南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 南昌 330047）

竹蓀（Dictyophora indusiata）又名竹笙、竹參等，屬于鬼筆科、竹蓀屬，是一類生長在含有大量枯竹殘?bào)w和腐殖質(zhì)的竹林里的腐生性真菌，在我國主要分布在四川、云南、福建等地。竹蓀營養(yǎng)豐富，味道鮮美，素有“山珍之花”、“真菌皇后”等美稱，我國是最早食用竹蓀、最早對竹蓀進(jìn)行人工馴化栽培的國家[1-2]。竹蓀還是珍貴的藥用菌，具有很高的藥用價(jià)值[3]。富含多糖、蛋白質(zhì)、黃酮、多酚類等成分，具有抗炎[4]、抗腫瘤[5-6]、抗氧化[7-8]、抑菌[9]等多種功效，是一類在食品、保健品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景的真菌。

近年來，越來越多的真菌多糖應(yīng)用于治療腫瘤、免疫缺陷病和糖尿病等疾病，竹蓀多糖相關(guān)研究早在1980年便有報(bào)道。Ukai等[10-11]從竹蓀中獲得一種長裙竹蓀子實(shí)體多糖，為線性（1→3）-α-D-甘露聚糖，相對分子質(zhì)量為620 ku（以0.1 mol/L NaCl為流動(dòng)相）或550 ku（以2 mol/L NaOH為流動(dòng)相）。另外，該研究團(tuán)隊(duì)還分離鑒定出另一種結(jié)構(gòu)為帶有（1→6）分支的（1→3）-β-D-葡聚糖（T-3-G和T-5-N）的長裙竹蓀多糖，其中T-3-G的重均分子質(zhì)量約為5.1×105u[12-13]。國內(nèi)研究人員Wang等[14]從竹蓀中分離純化得到一種以β-（1→3）-D-葡聚糖為主鏈，帶有部分 β-（1→6）葡聚糖支鏈的竹蓀多糖（PD3）。而 Hua等[15-16]經(jīng)Sephadex G75和DEAE-Sepharose FF柱層析純化得到的長裙竹蓀多糖Dip-I和Dip-II則含有果糖、木糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖等。Liao等[17]經(jīng)陰離子交換柱層析DEAE-52和葡聚糖凝膠柱層析G200中得到的竹蓀多糖DP1由半乳糖（14.1%）、葡萄糖（56.2%）、甘露糖（29.7%）組成。

上述研究主要以長裙竹蓀為研究對象，采用柱純化的方法來獲得高純度的竹蓀多糖。竹蓀多糖的單糖組成、相對分子質(zhì)量等理化性質(zhì)因制備方法或測定方法的不同而有很大差別。針對棘托竹蓀多糖分離純化和結(jié)構(gòu)特征鮮有研究報(bào)道。本文以棘托竹蓀為研究對象，采用更為簡單的乙醇分級沉淀方法對竹蓀提取物進(jìn)行分級純化，以獲得純度較高的竹蓀多糖組分，并測定其基本理化性質(zhì)、相對分子質(zhì)量、單糖組成和固體形貌等，為后續(xù)深入的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象特征分析以及功能活性研究奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棘托竹蓀提取物，由本單位實(shí)驗(yàn)室自制。

8種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖）和2種糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品（半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸），美國Sigma公司；不同分子質(zhì)量的葡聚糖系列標(biāo)準(zhǔn)品（Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-50、Dextran T-70、Dextran T-500、藍(lán)色葡聚糖），美國 Pharmacia公司；考馬斯亮藍(lán)G-250（進(jìn)口分裝），德國Fluka公司；牛血清蛋白，美國Amersco公司；咔唑，阿拉丁試劑公司；透析袋（截留分子質(zhì)量3 500 u），上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；95%食用酒精、無水乙醇、濃硫酸、苯酚、疊氮鈉等，均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Aligent1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Dionex ICS-5000離子交換色譜儀，美國戴安公司；Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo公司；JSM-6701F型掃描電子顯微鏡，日本電子光學(xué)公司；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司；AL 104電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 棘托竹蓀提取物中高純度多糖的制備 采用乙醇分級沉淀的方法制備高純度竹蓀多糖（如圖1所示）。稱取50 g竹蓀提取物，溶于500 mL蒸餾水，然后加入乙醇（95%，V/V）至體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)為20%，置于冰盒中醇沉8 h后再離心分離（10 000 r/min，15 min，4 ℃），棄去沉淀；上清液繼續(xù)加入乙醇至其體積分?jǐn)?shù)達(dá)到40%，醇沉12 h左右，離心分別得到沉淀和上清液。沉淀用無水乙醇洗滌3～4遍后再加入100 mL蒸餾水復(fù)溶，然后置于冰盒中用蒸餾水透析3 d，每2～3 h換水一次。向離心上清液中繼續(xù)加入乙醇，采用同樣的方法依次獲得60%（V/V）乙醇沉淀和80%（V/V）沉淀進(jìn)行透析。

圖1 竹蓀提取物中乙醇分級沉淀多糖流程圖Fig.1 Flow chart of gradual ethanol precipitation of polysaccharides from water extract of Dictyophoraechino-volvata Zane

將上述所得3種透析液分別濃縮至50～60 mL，加入4倍體積的無水乙醇靜置8～12 h，然后進(jìn)行離心（10 000 r/min，15 min，4 ℃），所得沉淀用無水乙醇洗滌3～4遍，真空干燥（60℃，2 h），依次得到3個(gè)棘托竹蓀多糖組分（DEP-4P、DEP-6P、DEP-8P）。

1.3.2 棘托竹蓀多糖的理化性質(zhì)分析

1.3.2.1 中性糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量測定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測定中性糖含量[18]。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法測定竹蓀多糖的蛋白質(zhì)含量[19]。以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用改良的硫酸-咔唑法測定竹蓀多糖中糖醛酸含量[20]。

1.3.2.2 純度及相對分子質(zhì)量測定 采用高效凝膠滲透色譜對棘托竹蓀多糖的純度進(jìn)行鑒定[21]。采用的色譜條件為保護(hù)柱：UltrahydrogelTMGuard Column（6 mm×40 mm，10 μm）；分離柱：UltrahydrogelTMLinearColumn（7.8 mm ×300 mm，10 μm）；柱溫：35.0℃；流動(dòng)相：超純水（含0.02%NaN3）；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。示差檢測器溫度為35.0℃；紫外檢測器檢測波長為280 nm。用流動(dòng)相配制1 mg/mL系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和竹蓀多糖樣品，上機(jī)檢測。

1.3.2.3 單糖組成分析 參考文獻(xiàn)報(bào)道的方法[22-23]，首先用2 mol/L硫酸在100℃油浴條件下將竹蓀多糖水解成單糖，然后采用離子色譜儀對混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品和竹蓀多糖的單糖組成進(jìn)行檢測分析。

1.3.2.4 紅外光譜掃描 稱取干燥的多糖樣品1 mg，采用KBr壓片法，用Nicolet 5700傅里葉紅外光譜儀在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.2.5 電鏡觀察 配制0.5 mg/mL竹蓀多糖溶液，冷凍干燥然后對干燥的多糖樣品進(jìn)行噴金處理，置于掃描電鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘托竹蓀多糖得率和化學(xué)成分

經(jīng)乙醇分級得到3個(gè)棘托竹蓀多糖樣品，通過比色法測定棘托竹蓀提取物及多糖的中性糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量等結(jié)果如表1所示。由表可以看出，隨著分級過程中，乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增加，竹蓀多糖的糖含量降低。3個(gè)竹蓀多糖組分均未檢測出蛋白質(zhì)和糖醛酸。

表1 棘托竹蓀提取物乙醇分級沉淀所得各多糖組分的得率及化學(xué)組成Table 1 Yields，chemical components of polysaccharides using gradual ethanol precipitation from water extract of Dictyophoraechino-volvata Zane

2.2 純度及相對分子質(zhì)量

圖2 棘托竹蓀提取物和乙醇分級沉淀所得多糖高效液相凝膠滲透色譜圖Fig.2 High performance gel chromatograph of polysaccharides using gradual ethanol precipitation water extract from Dictyophora echino-volvata Zane

圖2為棘托竹蓀提取物和多糖（DEP-4P、DEP-6P、DEP-8P）的高效液相凝膠滲透色譜圖。棘托竹蓀提取物在14.2，15.1和17.9 min左右出現(xiàn)3個(gè)峰，表明竹蓀提取物可能具有3個(gè)分子質(zhì)量分布相對集中的組分。經(jīng)過乙醇分級后，DEP-4P、DEP-6P和DEP-8P相對分子質(zhì)量分布則相對集中，并且都是單一對稱的色譜峰。由保留時(shí)間計(jì)算分配系數(shù)Kav與葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的LogMw的關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線得：Kav=-0.2905 LogMw+1.6409，R2=0.9937，DEP-4P、DEP-6P、DEP-8P 的出峰時(shí)間逐漸向后推移，（依次為 15.015，15.893，16.806 min）。DEP-4P、DEP-6P、DEP-8P 的相對分子質(zhì)量約為 2.1×104，6.5×103，1.9×103u，明顯小于文獻(xiàn)報(bào)道的長裙竹蓀多糖的重均分子質(zhì)量（510，550或600 ku）[11-13]。這可能與竹蓀的來源和提取純化的方法有關(guān)。

2.3 單糖組成分析

3個(gè)竹蓀多糖的單糖組成結(jié)果如表2所示，竹蓀多糖DEP-4P和DEP-6P主要由葡萄糖組成，DEP-8P中還有極少量的甘露糖。3個(gè)組分均未檢測出糖醛酸。該結(jié)果與Ukai[10-13]和Wang等[14]報(bào)道的單糖組成一致，而與Hua等[15-16]報(bào)道的長裙竹蓀多糖Dip-I和Dip-II（果糖、木糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖）和Liao等[17]報(bào)道的竹蓀多糖DP1（半乳糖、葡萄糖、甘露糖）有所差別。

2.4 棘托竹蓀多糖紅外光譜特征

棘托竹蓀提取物及多糖的紅外光譜見圖3。DEP-4P、DEP-6P、DEP-8P與竹蓀提取物具有類似的特征吸收峰。對比參考文獻(xiàn)[24-25]，對棘托竹蓀多糖的紅外圖譜分析如下：在3 380 cm-1處的吸收峰為羥基吸收峰，2 930 cm-1和1 640 cm-1處的微弱吸收峰分別為-CH的伸縮振動(dòng)和氫鍵振動(dòng)吸收峰，1 411 cm-1和1 367 cm-1處的吸收峰為-CH變角振動(dòng)吸收峰。800～1 200cm-1被認(rèn)為是多糖的特征吸收區(qū)域，其中1 023，1 081和1 238 cm-1為吡喃環(huán)吸收峰，930，850，761和709cm-1處的吸收峰，初步表明竹蓀多糖的異頭碳構(gòu)型為α-型[26-27]。

表2 棘托竹蓀多糖的單糖組成結(jié)果Table 2 Monosaccharide composition of polysaccharides from Dictyophora echino-volvata Zane

圖3 棘托竹蓀提取物及乙醇沉淀所得多糖的紅外圖譜Fig.3 FT-IR spectra of polysaccharides using gradual ethanol precipitation and water extract from Dictyophora echino-volvata Zane

2.5 棘托竹蓀多糖電鏡觀察

圖4為不同放大倍數(shù)下（1 000×和2 000×）3個(gè)竹蓀多糖組分掃描電鏡圖，由上圖可以看出，DEP-4P和DEP-6P在電鏡下觀察到的形貌特征以薄片狀為主，DEP-8P則呈現(xiàn)絲狀和片狀交雜的結(jié)構(gòu)。

圖4 棘托竹蓀多糖掃描電鏡圖Fig.4 SEM images of polysaccharides from Dictyophora echino-volvata Zane

3 結(jié)論

本研究采用乙醇分級醇沉的方法從棘托竹蓀提取物中分離純化得到3個(gè)棘托竹蓀多糖組分（分別為 DEP-4P、DEP-6P和DEP-8P），由高效液相色譜表征（單一對稱的峰）和糖含量測定結(jié)果（～90%）可以判定3個(gè)組分均為分布較為均一的純多糖。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，棘托竹蓀多糖的相對分子質(zhì)量逐漸減少，中性糖含量逐漸降低。單糖組成分析表明DEP-4P和DEP-6P由葡萄糖組成，而DEP-8P由大部分的葡萄糖和極少量的甘露糖組成。3個(gè)竹蓀多糖組分具有類似的紅外光譜特征，分析結(jié)果表明竹蓀多糖具有α構(gòu)型吡喃糖的特征吸收峰。結(jié)合單糖組成的結(jié)果推斷棘托竹蓀多糖為一種α-葡聚糖。這種結(jié)構(gòu)的竹蓀多糖與文獻(xiàn)報(bào)道的長裙竹蓀多糖（α-mannan和β-1，3-glucan）不一致，而該類多糖在其它菌菇類多糖（如雙孢菇多糖和平菇多糖）中有所報(bào)道[28-30]。后續(xù)可以采用甲基化方法和核磁技術(shù)對竹蓀多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入解析。掃描電鏡比較3種棘托竹蓀多糖的分子形貌特征發(fā)現(xiàn)DEP-4P、DEP-6P主要表現(xiàn)為片狀結(jié)構(gòu)，DEP-8P則以絲狀結(jié)構(gòu)為主。