魚源熒光假單胞菌生物被膜形成和致腐表型的研究

嚴(yán)羽萍 劉 麗 朱軍莉* 陸海霞 勵(lì)建榮

（1浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 310018

2渤海大學(xué)遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧錦州121013）

養(yǎng)殖魚類低溫貯藏品質(zhì)下降的主要原因是嗜冷腐敗微生物的生長繁殖。在有氧冷藏條件下，假單胞菌多為淡水魚的特定腐敗菌。胥亞夫等[1]發(fā)現(xiàn)水產(chǎn)品中主要腐敗菌為假單胞菌屬細(xì)菌，包括熒光假單胞菌、腐臭假單胞菌和邊緣假單胞菌。Parlapani等[2]報(bào)道海鯛中的腐敗微生物為假單胞菌屬，特別是熒光假單胞菌。楊憲時(shí)等[3]研究羅非魚冷藏過程菌相的變化，發(fā)現(xiàn)在0～10℃冷藏過程中假單胞菌為優(yōu)勢腐敗菌，熒光假單胞菌為最優(yōu)勢種群。郭全友等[4]對(duì)養(yǎng)殖大黃魚的菌相研究中，鑒定出腐敗希瓦氏菌和假單胞菌是低溫貯藏大黃魚的優(yōu)勢腐敗菌。

熒光假單胞菌是革蘭氏陰性、有鞭毛，產(chǎn)生物被膜，是廣泛存在于土壤和水生環(huán)境中的微生物，也是食品微生物腐敗的重要嗜冷腐敗菌[5]。研究表明，熒光假單胞菌分泌的蛋白酶和酯酶等代謝產(chǎn)物難以用瞬時(shí)高溫滅活，導(dǎo)致冷藏食品的風(fēng)味等物化性質(zhì)變化。假單胞菌屬還常在生產(chǎn)設(shè)備表面形成生物膜，對(duì)食品生產(chǎn)可能帶來持續(xù)污染。在食品環(huán)境中，生物被膜成為假單胞菌的寄所，可以提高其對(duì)在食品加工過程中遇到的各種環(huán)境壓力（低溫、酸、鹽、消毒劑）的抵抗力[6-7]。Anna Koza等[8]研究表明，假單胞菌屬可以形成多種生物被膜，能在靜止液體的氣-液界面上定殖并成膜。

目前熒光假單胞菌的致腐能力主要集中在牛奶分離株，而水產(chǎn)品來源的熒光假單胞菌僅報(bào)道其分離與鑒定，對(duì)腐敗表型和生物被膜形成的報(bào)道較少。鑒于此，本研究分析5株熒光假單胞菌的生物被膜形成及致腐能力，為探究魚源熒光假單胞菌致腐機(jī)理及生物被膜的控制提供理論基礎(chǔ)，為水產(chǎn)品保鮮提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PF01、PF06和PF07為冷藏大黃魚中的優(yōu)勢腐敗菌，PF10為大菱鲆的特定腐敗菌，NCBI登錄號(hào)分別為 KU173826、KU173831、KU173832、KR706375，PFuk4為標(biāo)準(zhǔn)菌株，購買于微生物菌種保藏中心。LB肉湯、胰酶大豆肉湯（TSB）、營養(yǎng)瓊脂（NA），泳動(dòng)性培養(yǎng)基（胰蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂0.3%），均購買于青島海博生物有限公司；SYTO9，Thermofisher，Waltham，MA，USA；96 孔 細(xì)胞培養(yǎng)板，無錫 NEST生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；酶標(biāo)儀VICTOR X，美國Perkin Elmer公司；移液器，德國Eppendorf公司；熒光顯微鏡LEICA DM4000，德國萊卡公司。

1.3 方法

1.3.1 活化培養(yǎng) 將-80℃貯藏的5株熒光假單胞菌甘油菌接種于LB培養(yǎng)基中28℃，200 r/min過夜活化后，于LB培養(yǎng)基中二次活化。離心收集菌體，用無菌生理鹽水將菌濃度調(diào)整到108CFU/mL待用。

1.3.2 生長曲線測定 將5株熒光假單胞菌分離株過夜活化菌液稀釋10倍后按1%接種于含有200 μL TSB培養(yǎng)基的96孔板中，置于28℃下培養(yǎng)，每隔3 h用酶標(biāo)儀測定600 nm處吸光度。

1.3.3 結(jié)晶紫法定量檢測生物被膜 將過夜活化的細(xì)菌菌液稀釋 10倍后按1%接種量接種于TSB培養(yǎng)基，并以200 μL分裝到96孔板中，28℃靜置培養(yǎng) 3，6，9，12，18，24 h 后，采用結(jié)晶紫法測定生物被膜形成量。根據(jù) Djordjevic[9]方法略做修改，去除孔板中菌液，每孔用250 μL PBS緩沖液輕輕漂洗3次，干燥后，加入200 μL 0.2%的結(jié)晶紫溶液，染色15 min后清洗，干燥，最后加入200 μL 33%冰乙酸，用酶標(biāo)儀測量其590 nm處吸光值。

1.3.4 胞外多糖（EPS）含量測定 參考Harimawan等[10]的方法略作修改提取胞外多糖。具體為培養(yǎng) 12，18，24 h后的 10 mL 菌液，4℃離心（5 000×G，20 min），去上清，然后用磷酸緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）重懸菌體，在80℃水浴 30 min，4 ℃離心（15 000×G，30 min），用0.22 μm濾膜過濾，得到上清液用苯酚硫酸法測定胞外多糖含量。

1.3.5 珠渦流法在1.3.1節(jié)所述的細(xì)菌菌懸液中加入不銹鋼片（10 mm ×10 mm）和蓋玻片（22 mm×22 mm）。在28℃靜置培養(yǎng)1 h。參考Nguyen等[11]珠渦流法對(duì)粘附在不銹鋼片表面的細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。具體方法如下，用PBS緩沖液輕輕洗去不銹鋼片表面的浮游菌，然后放于裝有10 mL無菌生理鹽水的離心管中，加入適量玻璃珠，劇烈渦旋3 min后，梯度稀釋計(jì)數(shù)。

1.3.6 熒光顯微鏡觀察 熒光顯微鏡觀察參照Bagge等[12]的方法。具體如下：用滅菌PBS洗去蓋玻片上浮游菌，放入2.5%的戊二醛中固定1.5 h，用PBS洗去戊二醛，烘箱干燥后，滴加70 μL 0.1 μL/mL SYTO9于蓋玻片上，均勻覆蓋于表面，避光孵育20 min，吸去多余的染料后，放置熒光顯微鏡下（40×）觀察。

1.3.7 泳動(dòng)性測定 參考 Sperandio等[13]的方法，泳動(dòng)瓊脂培養(yǎng)基凝固后，將5 μL過夜培養(yǎng)的菌液滴在平板中心，吸干后，移至28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。

1.3.8 蛋白酶活性測定 參照SB/T 10317-1999標(biāo)準(zhǔn)[14]中福林酚法測定蛋白酶活力方法，在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

1.3.9 嗜鐵素檢測 參考文獻(xiàn)[15]，制作CASAD嗜鐵素檢測平板，利用CASAD嗜鐵素平板法可檢測總的嗜鐵素，將過夜培養(yǎng)的菌液離心取上清5 μL加入平板中，置于28℃培養(yǎng)24 h后觀察。

1.3.10 生物報(bào)告菌檢測信號(hào)分子 參考Ravn等[16]方法并略作修改。報(bào)告菌紫桿菌CV026活化后，取5 mL加入到50 mL LB瓊脂中，混合均勻后倒平板，待冷卻后，平板中心打孔，加入菌液，28℃培養(yǎng)，觀察顏色變化。

1.3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 每組樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取其平均值。采用Microsoft Excel和Origin 8.5進(jìn)行 數(shù) 據(jù) 處 理和作圖，并利用SPSS21.0的ANOVA進(jìn)行方差分析P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光假單胞菌分離株的生長曲線

研究測定了5株熒光假單胞菌分離株在28℃下靜置培養(yǎng)的生長曲線。如圖1所示，熒光假單胞菌在3 h到12 h期間生長迅速，尤其是PF07在對(duì)數(shù)生長期生長最快，PF01、PF06和PF10次之，且這3株菌的生長基本保持一致，PFuk4生長最慢。在18 h后PF07和PFuk4生長緩慢，在培養(yǎng)24 h進(jìn)入穩(wěn)定期，而其余3株菌依然在逐漸增長，在27 h 進(jìn)入穩(wěn)定期。PF01、PF06、PF07、PF10和PFuk45株菌在穩(wěn)定期的細(xì)菌量分別達(dá)到1.7，1.7，1.5，1.7和1.4（OD600），其中 PF01、PF06和PF10 的細(xì)菌量最高，PFuk4的菌量最少。

圖1 5種熒光假單胞菌分離株在28℃下的生長曲線Fig.1 Growth curves of five isolates of P.fluorescens at 28℃

2.2 熒光假單胞菌分離株的生物被膜形成

2.2.1 結(jié)晶紫法測定生物被膜含量 生物被膜通常被定義為微生物群體粘附于表面或界面產(chǎn)生一種可供微生物定殖的由多糖、蛋白質(zhì)、核酸和脂肪所組成的胞外基質(zhì)[17]。比較5株熒光假單胞菌被膜形成能力，如圖2所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5株菌都能在試管壁的氣-液界面較快的形成菌膜，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長膜量逐漸增多，24 h出現(xiàn)明顯的膜，48 h逐步增厚，72 h后膜開始破裂。Liang等[18]也發(fā)現(xiàn)奧奈達(dá)希瓦氏菌在氣-液交界處形成菌膜。

熒光假單胞菌在96孔塑料孔板上也能形成被膜，其中培養(yǎng)3 h時(shí)5株菌的生物被膜量基本保持一致（P＞0.05）。隨著細(xì)菌生長，熒光假單胞菌的生物被膜量也開始顯著增加，培養(yǎng)至12 h，PF01、PF06、PF07和PF10的生物被膜量達(dá)到最高，分別為 1.71，1.72，2.24和1.61（OD600），而 PFuk4在18 h達(dá)到最高，為2.50，隨即又開始下降。在熒光假單胞菌分離株中PF07和PFuk4的生物被膜形成能力較強(qiáng)，且PF07被膜形成周期較短。研究表明，熒光假單胞菌具有較強(qiáng)的生物被膜能力，而且不同來源的熒光假單胞菌生物被膜形成能力差別較大。Sim?es等[19]報(bào)道熒光假單胞菌模式菌株形成生物被膜的能力高于從乳制品加工環(huán)境中分離得到的分離株。課題組[20]也發(fā)現(xiàn)不同來源的銅綠假單胞菌形成生物被膜的能力也有所不同。在食品接觸表面的腐敗致病菌的粘附及生物被膜形成，增加產(chǎn)品加工過程的交叉污染，縮短貨架期，給食品產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[7]。

圖2 5種熒光假單胞菌分離株在28℃下的生物被膜形成Fig.2 Biofilm formation of five isolates of P.fluorescens at 28℃

2.2.2 EPS含量 胞外多聚物（EPS）由胞外多糖、蛋白質(zhì)和胞外DNA等多種成分組成，是形成生物被膜的重要基質(zhì)。研究測定5株菌在28℃下培養(yǎng)不同時(shí)間的EPS含量，如圖3所示。結(jié)果顯示，5株熒光假單胞菌隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，EPS含量逐步增加，其中PF07形成EPS較快，在18 h達(dá)到最高，為 0.61（OD490），而 PF01、PF06、PF10和PFuk44株在24 h達(dá)到最高，分別為0.46，0.56，0.52和0.48（OD490）。銅綠假單胞菌EPS分泌使細(xì)菌間彼此粘結(jié)，并促進(jìn)菌體粘附于物體表面[21]。Taguett[22]曾報(bào)道分析熒光假單胞菌TF7的多糖組成為果糖、葡萄糖和甘露糖，比例為4∶1∶0.6。結(jié)合結(jié)晶紫染色和EPS含量分析發(fā)現(xiàn)，分離株P(guān)F07生物被膜形成能力很強(qiáng)，形成周期較短，胞外多糖含量較高。

2.3 熒光假單胞菌分離株的粘附能力

生物被膜的形成主要分為初期粘附、不可逆粘附、微菌落形成、成熟和播撒5個(gè)階段[23]。研究假單胞菌在不銹鋼片上的初期粘附能力，如圖4所示。結(jié)果顯示假單胞菌能粘附于不銹鋼片上，且PF07的初期粘附能力最強(qiáng)，粘附量可達(dá)到6.87 lg CFU/cm2；PF01、PF06和PF10 的粘附量無顯著差異，分別為 6.46，6.42和6.53 lg CFU/cm2；PFuk4的粘附量最低，為 6.08 lg CFU/cm2。細(xì)菌在表面的初期粘附是一個(gè)復(fù)雜的過程，受各種物理化學(xué)特性的影響，包括細(xì)胞和介質(zhì)表面。細(xì)胞表面疏水性被認(rèn)為是最重要的物理化學(xué)參數(shù)，控制著細(xì)菌在表面的粘附和分離[24]。熒光假單胞菌PF07高粘附性與其較強(qiáng)的被膜形成和EPS分泌能力一致。

圖3 5種熒光假單胞菌分離株在28℃下的EPS含量變化Fig.3 The EPS production of five isolates of P.fluorescens at 28℃

圖4在28℃下5種熒光假單胞菌分離株的粘附能力Fig.4 The adherence ability of five isolates of P.fluorescens at 28℃

由于熒光染料SYT09可與細(xì)菌的DNA特異結(jié)合并發(fā)出綠色熒光，進(jìn)一步通過熒光顯微鏡觀察熒光假單胞菌在玻璃片上的粘附能力，如圖5所示。結(jié)果觀察，假單胞菌都能較快地粘附到玻璃片表面，較分散地分布于表面，其中PF07細(xì)菌聚集形成團(tuán)塊，且粘附菌量較多。顯微鏡觀察與細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果較一致，表明熒光假單胞菌PF07在不銹鋼片和玻璃片表面具有較強(qiáng)的粘附能力。Midelet等[25]也曾發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌具有很強(qiáng)的粘附能力，能快速粘附到接觸面上。Liu等[26]曾報(bào)道隆德假單胞菌在培養(yǎng)4～6 h后開始粘附于接觸表面并形成生物被膜。

圖5在28℃下5種熒光假單胞菌分離株在玻璃片上粘附的熒光顯微鏡圖Fig.5 Fluorescence microscope images of five isolates of P.fluorescens at 28℃

2.4 熒光假單胞菌分離株的泳動(dòng)性

細(xì)菌的泳動(dòng)性與生物被膜形成能力密切相關(guān)，其有助于細(xì)菌在介質(zhì)表面的運(yùn)動(dòng)。如圖6所示，熒光假單胞菌均具有一定的泳動(dòng)能力，PF07的泳動(dòng)能力最強(qiáng)，其擴(kuò)散直徑可以達(dá)到39.5 mm，而其它4株菌的泳動(dòng)擴(kuò)散直徑分別為25.3，28.5，32.2和29.5 mm。Liu等[26]也發(fā)現(xiàn)隆德假單胞菌在半固體培養(yǎng)基平板上有很強(qiáng)的泳動(dòng)性和群集性。Ping等[27]曾報(bào)道熒光假單胞菌SBW25擁有右旋鞭毛，比靠左旋鞭毛驅(qū)動(dòng)的大腸桿菌有更強(qiáng)的泳動(dòng)性。

圖6在28℃下5種熒光假單胞菌分離株的泳動(dòng)性Fig.6 Swimming motility of five isolates of P.fluorescens at 28℃

2.5 熒光假單胞菌分離株的蛋白酶和嗜鐵素活性

假單胞菌屬的某些成員是富含蛋白類生鮮食品，特別是冷藏牛肉[28]和海鮮[29]的主要腐敗菌，與其高蛋白酶活性有關(guān)[30]。如圖7a所示，5株熒光假單胞菌在28℃下具有較高的蛋白酶活性，其中PF01、PF06和PF07在12 h活性達(dá)到最大，分別為24.0，24.2和24.5酶活力單位，隨后開始下降。PF10在24 h達(dá)到最大為 24.5酶活力單位，而PFuk4仍在持續(xù)增長，在36 h達(dá)到25.9酶活力單位。結(jié)果表明，大黃魚源的3株假單胞菌產(chǎn)生蛋白酶的速率較快，而標(biāo)準(zhǔn)菌株由于生長較慢，蛋白酶生成較慢，然而其活性也較高。

CASAD嗜鐵素平板法檢測熒光假單胞菌嗜鐵素，嗜鐵素會(huì)奪取青色平板中的鐵離子，形成黃色暈圈，檢測結(jié)果直觀。如圖7b所示，5株假單胞菌都能形成黃色暈圈，表明假單胞菌分離株都含有嗜鐵素。

圖7在28℃下5種熒光假單胞菌分離株的蛋白酶（a）和嗜鐵素（b）活性Fig.7 Protease activity and siderophore of five isolates of P.fluorescens at 28℃

2.6 生物報(bào)告菌法檢測AHLs信號(hào)分子

圖8 紫色桿菌CV026報(bào)告菌法檢測5種熒光假單胞菌中AHLsFig.8 The ability of producing AHLs of five isolates of P.fluorescens at 28℃

生物報(bào)告菌法是一種經(jīng)典的檢測 AHLs信號(hào)分子的方法，具有簡單、方便、靈敏度好等優(yōu)點(diǎn)。生物報(bào)告菌紫色桿菌CV026檢測熒光假單胞菌AHLs活性，如圖8所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PF07能引起報(bào)告菌產(chǎn)生紫色色素，且PFuk4周圍的紫色極淺，而PF01、PF06和PF10周圍不變色，表明PF07產(chǎn)生含量較高或活性較強(qiáng)的短鏈AHLs，而PFuk4也具有較弱的AHLs活性，而其余3株菌不產(chǎn)生短鏈AHLs。Kjelleberg等[31]發(fā)現(xiàn)AHLs可以調(diào)控銅綠假單胞菌的粘附、游動(dòng)和細(xì)菌生物被膜的形成。

3 結(jié)論

研究表明，5株熒光假單胞菌都能在試管和塑料孔板中形成大量生物被膜，且能較快地粘附于不銹鋼片與玻璃片表面。熒光假單胞菌具有較強(qiáng)的泳動(dòng)性、蛋白酶活性及產(chǎn)嗜鐵素，其中PF07較強(qiáng)的生物被膜形成能力和致腐表型，可能與高活性的AHLs存在內(nèi)在關(guān)聯(lián)。