胡曉鐘， 趙 研, 2， 黃 潔,3， 高 鳳， 高 珊， 邵 晨,4， 宋微波**

(1. 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物多樣性與進(jìn)化研究所，山東 青島 266003； 2. 首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048； 3. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北 武漢 430072； 4. 西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西 西安 710049)

在超過(guò)10億年漫長(zhǎng)的動(dòng)物演化中，處于真核生物起源階段的原生動(dòng)物歷經(jīng)一次次分化和演化，形成了多樣性極高的一類極具代表性的單細(xì)胞真核生物。其中的纖毛蟲類群，在生殖方式(獨(dú)特的接合生殖)、雙態(tài)核型(分司不同功能的大、小核)、極端多樣化的細(xì)胞發(fā)生模式等方面都代表了真核生物細(xì)胞分化與進(jìn)化的最高階段，已成為細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)、遺傳學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域研究的模型生物。因此，圍繞纖毛蟲基礎(chǔ)生物學(xué)的研究，已成為當(dāng)今國(guó)際原生動(dòng)物學(xué)領(lǐng)域中最活躍的一個(gè)分支。纖毛蟲作為水體微食物網(wǎng)的核心組分，在物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)和水環(huán)境健康維護(hù)中發(fā)揮著重要作用[1-5]。此外，很多兼性和專性寄生、棲生類群又常因構(gòu)成養(yǎng)殖動(dòng)物的病害等成為產(chǎn)業(yè)的防范對(duì)象[6]。因此，以纖毛蟲為對(duì)象的研究一直是國(guó)際上基礎(chǔ)生物學(xué)和相關(guān)應(yīng)用學(xué)科所關(guān)注的重要熱點(diǎn)之一。

然而，由于諸多原因，在中國(guó)以海洋纖毛蟲為核心的基礎(chǔ)生物學(xué)研究長(zhǎng)期以來(lái)十分欠缺，特別是有關(guān)物種-基因水平的多樣性等基本資料構(gòu)建、與生態(tài)學(xué)、環(huán)境生物學(xué)、病害學(xué)、圍繞模式種所開(kāi)展的適應(yīng)與進(jìn)化、共生機(jī)制形成、與環(huán)境耦合的群落結(jié)構(gòu)與動(dòng)態(tài)變化等研究，普遍處于程度不同的缺位狀態(tài)。而基于分子技術(shù)等現(xiàn)代手段的纖毛蟲學(xué)研究起于20世紀(jì)后葉，先天不足加上缺乏系統(tǒng)的投入和有傳承的推進(jìn)，使得在我國(guó)以纖毛蟲學(xué)為核心的現(xiàn)代原生動(dòng)物學(xué)研究與國(guó)際水平曾長(zhǎng)期處于距離越拉越大的趨勢(shì)。

這一現(xiàn)象直到21世紀(jì)初才有了根本改觀：借助于國(guó)家自然科學(xué)基金、多項(xiàng)重大基金以及國(guó)際合作項(xiàng)目的連續(xù)支持，在以作者所在團(tuán)隊(duì)為核心的研究隊(duì)伍以及合作者們的不懈努力下，中國(guó)的纖毛蟲學(xué)研究(特別在海洋領(lǐng)域)在多個(gè)分支中實(shí)現(xiàn)了從追趕、并跑、再到領(lǐng)跑的變化。在這個(gè)研究探索、隊(duì)伍建設(shè)和發(fā)展過(guò)程中，以O(shè)UC(中國(guó)海洋大學(xué))為符號(hào)的原生動(dòng)物學(xué)研究室已發(fā)展成為國(guó)際上本領(lǐng)域內(nèi)為數(shù)不多的旗艦級(jí)研究中心之一，形成了我們的突出特色和集團(tuán)優(yōu)勢(shì)，并在多樣性、細(xì)胞學(xué)等傳統(tǒng)強(qiáng)項(xiàng)健康發(fā)展的同時(shí)，以纖毛蟲為模式的表觀遺傳學(xué)、組學(xué)、纖毛蟲大小核間的基因進(jìn)化等領(lǐng)域也逐漸形成了我們的新拓展和新增長(zhǎng)點(diǎn)，為未來(lái)纖毛蟲基礎(chǔ)生物學(xué)領(lǐng)域的研究奠定了重要基礎(chǔ)、開(kāi)啟了新篇章。

1 纖毛蟲的多樣性

傳統(tǒng)的纖毛蟲物種多樣性研究主要限于歐洲與北美地區(qū)，沿海則包括大西洋兩岸、地中海及太平洋的東岸。而在整個(gè)西太平洋和東亞地區(qū)，有關(guān)纖毛蟲的系統(tǒng)、專業(yè)級(jí)的研究普遍空缺或粗淺，大多數(shù)類群均缺乏了解、不明或不詳，因此，基本的家底信息長(zhǎng)期不明[1]。

在過(guò)去的30年中，作者團(tuán)隊(duì)及合作者先后開(kāi)展了下列多樣性工作：(1)圍繞我國(guó)的黃渤海和南海近岸水域以及以紅樹(shù)林為核心的濕地纖毛蟲，完成了對(duì)其區(qū)系、物種多樣性的系統(tǒng)、全面的調(diào)查研究，形成了中國(guó)首份海洋纖毛蟲原生動(dòng)物的專業(yè)級(jí)家底信息(見(jiàn)圖1)[1,6-13]；(2)作為基因多樣性研究的重要內(nèi)容，我們構(gòu)建了全球最大的海洋纖毛蟲的遺傳資料(包括1 700余種-種群的DNA)信息庫(kù)，同步完成了對(duì)相關(guān)種類18SrRNA等基因的測(cè)序，進(jìn)而構(gòu)成了GenBank中有關(guān)資料的重要組成(見(jiàn)表1)；(3)完成了對(duì)海水養(yǎng)殖水體中以危害性纖毛蟲(及魚類寄生粘孢子蟲)為主的病原原生動(dòng)物分類、病原鑒定、檢索文獻(xiàn)等資料性工作[14]；(4)系統(tǒng)開(kāi)展了有關(guān)膠州灣纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)與變化、與環(huán)境耦合的生態(tài)響應(yīng)及生物環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)的探索[15]。

(a 粗壯殼吸管蟲，自陳相瑞等[7]；b 寡毛雙眉蟲，自宋微波等[1]；c 喇叭蟲(未發(fā)表)；d 旋口蟲(未發(fā)表)；e, i 聚縮蟲(未發(fā)表); f 卡爾半列蟲，自Luo et al.[10]；g 鐘蟲(未發(fā)表)；h 海喙蟲(未發(fā)表)；j 中縊蟲(未發(fā)表)；k 瘦小偏體蟲，自宋微波等[14]； l 中華嗜污蟲，自Pan et al.[11]；m 帆口蟲(未發(fā)表)； n 擬黃色黃色新尾柱蟲，自Zhang et al.[13]；o 扇形游仆蟲(未發(fā)表)；p紡錘披巾蟲，自Chen et al.[8]；q 縮頸半腹柱蟲(未發(fā)表)；r，y 游仆蟲(未發(fā)表)；s 美麗異列蟲(未發(fā)表)；t杯狀靴纖蟲(未發(fā)表)；u 乳突盤毛蟲，自Fan et al.[9]；v 擬鈴蟲(未發(fā)表)；w夏威夷擬稀毛蟲，自Luo et al.[10]；x 多變擬雙列蟲(未發(fā)表)；y 游仆蟲(未發(fā)表)；z1偽康纖蟲(未發(fā)表)；z2清亮阿內(nèi)格蟲，自Yan et al.[12]；z3 真鈴蟲(未發(fā)表)。aAcinetafoetida, from Chen et al.[7]; bDiophrysoligothrix，from Song et al.[1]; cStentorsp. (original); dSpirostomumsp. (original); e,iZoothamniumsp. (original); fHemiholostichakahli, from Luo et al.[10]; gVorticellasp. (original); hRemanellasp. (original); jMesodiniumsp. (original); kDysteriapusilla, from Song et al.[14]; lPhilastersinensis，from Pan et al.[11]; mPleuronemasp. (original); nNeourostylopsisflavaparaflava, from Zhang et al.[13]; oEuplotesvannus(original); pTiarinafusa, from Chen et al.[8]; qHemigastrostylaenigmatica(original); r, yEuplotessp. (original); sAnteholostichapulchra(original); t Cothurnia cyathiforme (original); uDiscotrichapapillifera, from Fan et al.[9]; vTintinnopsissp. (original); wPsilotrichideshawaiiensis, from Luo et al.[10]; xParaistichellavariabilis(original)； z1Pseudocohnilembussp. (original); z2Anigsteiniaclarissima, from Yan et al.[12]; z3Eutintinnussp. (original).)

圖1 纖毛蟲原生動(dòng)物的形態(tài)學(xué)與物種多樣性
Fig.1 Species diversity and morphology of ciliated protozoans

表1 作者團(tuán)隊(duì)所完成的主要纖毛蟲類群DNA庫(kù)、標(biāo)記基因及組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)情況Table 1 DNA bank, genome/transcriptome data, and contribution to the GenBank rRNA gene database by authors’ group

Note： ①Ciliate taxa；②Genomic DNA extracted (species/population)；③Genome/ transcriptome sequenced；④The number of 18SrRNA；⑤The number of ITS-5.8SrRNA；⑥The number of 28SrRNA；⑦From authors’ group；⑧Proportion of the sequences in GenBank from authors’ group.

這些工作的核心成果包括全面開(kāi)展了中國(guó)溫帶、熱帶海區(qū)資料高度缺乏的40余目級(jí)類群自由生纖毛蟲之形態(tài)分類學(xué)研究，首次給出了包括纖毛圖式等現(xiàn)代物種鑒定的專業(yè)級(jí)資料，完成了對(duì)國(guó)際間長(zhǎng)期不詳、鑒定混亂的大量“半知種類”的重描述、新定義及新模建立、異名清理等大量的各類歷史遺留問(wèn)題的修訂。成果還包括研究建立了新目、新科、新屬、新種等大量新階元，填補(bǔ)了國(guó)際間包括溫帶、熱帶沿岸富營(yíng)養(yǎng)區(qū)、離岸水體、熱帶紅樹(shù)林、河口低鹽區(qū)、砂隙潮間帶等生境中纖毛蟲區(qū)系研究的空白[16-29]。

這是國(guó)際范圍內(nèi)迄今原生動(dòng)物多樣性領(lǐng)域中堪稱浩大的一項(xiàng)工程：作者所在團(tuán)隊(duì)連續(xù)投入了30年、全視野地覆蓋了溫帶-熱帶沿海海洋纖毛蟲各類群，描繪了多種生境中包括物種、基因、生態(tài)系多樣性的完整版圖，為研究相關(guān)類群的起源演化、近岸水體生態(tài)學(xué)、微型生物的協(xié)同進(jìn)化與適應(yīng)、大尺度下的水環(huán)境變化與原生動(dòng)物生物地理格局等建立了重要檔案資料和理論依據(jù)，也為生物資源及環(huán)境評(píng)估與保護(hù)、為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病害防治等應(yīng)用領(lǐng)域提供了一份重要的手冊(cè)性資料。

我們?cè)诖祟I(lǐng)域的近期新目標(biāo)將重點(diǎn)關(guān)注迄今尚缺乏研究、兼具“水”“陸”特征和微氣象條件的淡水濕地生態(tài)系統(tǒng)。即圍繞濕地生態(tài)系中纖毛蟲的多樣性、群落結(jié)構(gòu)與時(shí)空分布格局等，聚焦該生境中纖毛蟲的物種-基因-生境多樣性、生態(tài)系資料的建立、遺傳信息庫(kù)構(gòu)建以及包括細(xì)胞學(xué)、基因進(jìn)化等在內(nèi)的基礎(chǔ)生物學(xué)探討。這項(xiàng)工作的目標(biāo)和意義在于將完成涉及環(huán)境健康維持、資源開(kāi)發(fā)與利用、特別是大時(shí)空尺度上濕地環(huán)境變遷的跟蹤以及歷史檔案資料的構(gòu)建，這些要素均為國(guó)內(nèi)外急需面對(duì)的科學(xué)問(wèn)題。預(yù)期成果將建立和呈現(xiàn)中國(guó)淡水濕地生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)纖毛蟲多樣性與生態(tài)學(xué)等家底信息的全面、專業(yè)級(jí)資訊，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外空白，體現(xiàn)科學(xué)研究服務(wù)于國(guó)家需要這一重要訴求，并有望在新物種發(fā)現(xiàn)、纖毛蟲遺傳信息庫(kù)的完善、分子生態(tài)學(xué)探索、生態(tài)學(xué)時(shí)空信息的構(gòu)建等領(lǐng)域形成一批創(chuàng)新成果，鞏固和擴(kuò)大我們的學(xué)科優(yōu)勢(shì)及在領(lǐng)域內(nèi)的旗艦地位。

2 纖毛蟲細(xì)胞發(fā)生模式

纖毛蟲的重要特征之一即為體表的纖毛器發(fā)生了結(jié)構(gòu)和功能上的高度分化和特化。在細(xì)胞的分裂過(guò)程中通過(guò)不同的模式和過(guò)程經(jīng)由原基而逐步發(fā)育為新生細(xì)胞的纖毛器，該過(guò)程被稱為“細(xì)胞發(fā)生”。這一過(guò)程本質(zhì)上反映了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的分化與去分化，并由此構(gòu)成了纖毛蟲學(xué)中有關(guān)“細(xì)胞分化”這一重要的科學(xué)問(wèn)題。

鑒于這一背景，纖毛蟲的細(xì)胞發(fā)生學(xué)研究長(zhǎng)期以來(lái)是纖毛蟲學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的重要分支。該領(lǐng)域研究的主要意義在于：為探討原生動(dòng)物這一多源發(fā)生體系的系統(tǒng)關(guān)系與演化提供理論支持；為親緣種、隱存種的廓清提供發(fā)生學(xué)的鑒別特征；為在分子水平上揭示基因調(diào)控及相關(guān)的機(jī)制研究提供背景信息。

近20年來(lái)，作者團(tuán)隊(duì)以高度特化的腹毛類纖毛蟲為模式，所完成的個(gè)體發(fā)生學(xué)研究覆蓋了目前所知的幾乎所有發(fā)生類型，涉及隸屬37科、88屬的150余種的細(xì)胞分化模式和過(guò)程(見(jiàn)圖2)。這些工作詳細(xì)跟蹤報(bào)道了無(wú)性繁殖行為中的細(xì)胞器、皮膜結(jié)構(gòu)及核器的構(gòu)建過(guò)程，刻畫了不同類群的皮層/胞器起源-分化-命運(yùn)、重要結(jié)構(gòu)的近祖-衍化分析[30]。

(A 自Luo et al.[33]；B 自Zhang et al.[13]；C 自Jiang et al.[31]；D 自Shao et al.[35]。A from Luo et al.[33]; B from Zhang et al.[13]; C from Jiang et al.[31]; D from Shao et al.[35].)

圖2 纖毛蟲原生動(dòng)物的細(xì)胞發(fā)生模式與結(jié)構(gòu)分化

Fig.2 Patterns of morphogenesis in ciliated protozoans

代表性工作包括：(1)對(duì)信息殘缺類群完成了發(fā)生模式的修正和補(bǔ)足，進(jìn)而完善了對(duì)游仆蟲屬內(nèi)發(fā)生模式的刻畫；(2)完整描述了具大-小口型多態(tài)性的瞬膜蟲的生活史；(3)構(gòu)建了散毛目?jī)?nèi)背面纖毛器結(jié)構(gòu)的第6種分型：半腹柱蟲型；(4)闡釋了原本系統(tǒng)位置相距甚遠(yuǎn)的偽瘦尾蟲屬和圓纖蟲屬同源，二者位于進(jìn)化末端且發(fā)生背面結(jié)構(gòu)的二次退化；(5)對(duì)比尾列蟲屬與瘦尾蟲屬發(fā)生模式的高相似度，界定其均為尾柱目和高等類群散毛目的居間類群，即尾柱目向散毛目進(jìn)化的過(guò)渡態(tài)及關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)；(6)揭示了偽小雙蟲屬屬內(nèi)發(fā)生的高度不保守性；(7)通過(guò)比對(duì)偽角毛蟲屬、趨角蟲屬、偏角毛蟲屬和類角毛蟲屬的多元分析，為揭示偽角毛蟲科的系統(tǒng)演化提供了重要依據(jù)[30-36]。

上述成果揭示和描述了包括原腹毛類祖先型“原基滯后分化”、瘦尾蟲“次級(jí)背觸毛原基片段化”、獨(dú)角蟲背觸毛獨(dú)特的“兩組發(fā)生式”、針毛蟲緣棘毛的“尾棘毛發(fā)育模式”和類角毛蟲波動(dòng)膜原基“多次片段化”等一系列發(fā)生學(xué)新現(xiàn)象[30]。

我們同時(shí)利用細(xì)胞發(fā)生學(xué)信息解答了若干長(zhǎng)期存疑的系統(tǒng)進(jìn)化問(wèn)題，包括證明了凱毛蟲代表了廣義腹毛綱中的1個(gè)原始、低等的類群，為確定3個(gè)綱-亞綱級(jí)類群間真實(shí)的演化關(guān)系提供了重要的依據(jù)，同時(shí)綜合發(fā)生學(xué)信息建立了1新亞綱-原腹毛亞綱，解答了由上世紀(jì)后半葉以來(lái)長(zhǎng)期存疑的凱毛蟲科系統(tǒng)定位及其與腹毛類和異毛類的系統(tǒng)關(guān)系等問(wèn)題。其次，明確了盤頭類作為一個(gè)腹毛類祖先型，代表了介于游仆亞綱和腹毛亞綱之間的居間類群，證明其與腹毛亞綱具有更為接近的親緣關(guān)系并應(yīng)為腹毛亞綱中獨(dú)立的側(cè)支，并且建立了1個(gè)目級(jí)新階元-盤頭目，該成果揭示了近40年來(lái)懸疑的盤頭類的系統(tǒng)定位及其與腹毛亞綱和游仆亞綱的系統(tǒng)關(guān)系等問(wèn)題[30-36]。

3 纖毛蟲標(biāo)記基因測(cè)序和分子系統(tǒng)演化

由于纖毛蟲具有極高的物種多樣性、復(fù)雜的生活史和十分久遠(yuǎn)的進(jìn)化史，許多“相近階元”的分類學(xué)特征或許經(jīng)歷了趨同、趨異或起源不詳?shù)难莼^(guò)程。因此，建立在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上的類群間的系統(tǒng)演化關(guān)系在諸多類群中均存在著懸疑、不明和爭(zhēng)議，特別是在一些演化鄰接階元信息不明的類群。近年來(lái)，這些懸疑和爭(zhēng)議隨著以標(biāo)記基因序列分析為代表的分子系統(tǒng)學(xué)技術(shù)的引入而不斷得到澄清或形成新的觀點(diǎn)。

但一個(gè)突出的問(wèn)題構(gòu)成了新的瓶頸：在國(guó)際GenBank信息庫(kù)中，太多的纖毛蟲類群因缺乏標(biāo)記基因信息而導(dǎo)致系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建中形成新的盲區(qū)。此外，信息庫(kù)中許多缺乏分類學(xué)依據(jù)的序列(錯(cuò)誤鑒定的素材)為系統(tǒng)發(fā)育研究引入了新干擾和新混亂。

在此背景下，我們?cè)陂_(kāi)展上述纖毛蟲多樣性研究的過(guò)程中，完成了涵蓋了纖毛蟲常見(jiàn)類群的1 400余條核糖體標(biāo)記基因的測(cè)序工作，累計(jì)向GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)貢獻(xiàn)近20%纖毛蟲的標(biāo)記基因序列(見(jiàn)表1)。迄今為止，基于標(biāo)記基因信息對(duì)門下13個(gè)綱55個(gè)目級(jí)階元的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了深層次的梳理和探討，揭示了大量類群的系統(tǒng)進(jìn)化地位(見(jiàn)圖3)[37-52]。代表性成果包括：(1)建立了兩新綱(Mesodiniea，Protocruziea)[36-37]、一新亞綱(Protohypotrichia)、兩新目(Lynnellida，Discotrichida)[45-47]以及一新亞目(Pseudoamphisiellina)[48]；(2)系統(tǒng)闡述了五個(gè)亞綱級(jí)類群(腹毛類、游仆類、寡毛類、緣毛類、盾纖類)內(nèi)部的系統(tǒng)關(guān)系：明確了游仆亞綱及其轄屬的2目7科均為單源發(fā)生系，證實(shí)了盤頭目與游仆目具有更密切的系統(tǒng)關(guān)系；新建立的Lynnella屬代表了一個(gè)介于寡毛亞綱和環(huán)毛亞綱之間的一個(gè)目級(jí)新階元[44]；(3)同步探討了有關(guān)物種選擇、建樹(shù)方法、環(huán)境未知序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)的使用、旁系同源基因、數(shù)據(jù)缺失和異質(zhì)性等一系列因素對(duì)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的影響[49-52]。

作為一份新成果，我們結(jié)合單細(xì)胞組學(xué)測(cè)序技術(shù)，構(gòu)建了一種高效自動(dòng)化序列分析方法 (Guided Phylogenomic Search in trees, GPSit)，其具有一站式、高度流程化的特點(diǎn)并集成了全部的必需和可選操作，大大減少人工操作時(shí)間。該方法支持同時(shí)使用超級(jí)數(shù)據(jù)集與超級(jí)樹(shù)方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育基因組學(xué)分析，能夠很好地重構(gòu)深層系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系并揭示淺層系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系中的相關(guān)類群的系統(tǒng)進(jìn)化地位。該方法很大程度上紓解了(不可培養(yǎng)類群)基因組數(shù)據(jù)難以獲取的困難[53]。

迄今為止的工作顯示，單基因和少數(shù)基因?yàn)榛A(chǔ)的纖毛蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究依然不能回答一些包括隱存種厘定、關(guān)系混亂的形態(tài)屬的界定、形態(tài)特征-細(xì)胞發(fā)生學(xué)信息與分子信息相悖等問(wèn)題。這些工作需要在系統(tǒng)基因組學(xué)(Phylogenomics)研究的水平上去探討和尋求解答。因此，作為新的關(guān)注點(diǎn)之一，我們將高通量測(cè)序技術(shù)、DNA信息庫(kù)利用與組學(xué)資訊開(kāi)發(fā)整合成新的工作平臺(tái)，在組學(xué)和大數(shù)據(jù)背景下去解析包括物種鑒定、適應(yīng)與進(jìn)化相關(guān)的系統(tǒng)學(xué)科學(xué)問(wèn)題。作者預(yù)期，新設(shè)想的實(shí)施將引領(lǐng)和推動(dòng)纖毛蟲分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的發(fā)展并將構(gòu)成系統(tǒng)學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。

4 纖毛蟲基因條形碼技術(shù)探索

作為近幾十年來(lái)新形成的一項(xiàng)革命性成果，基因條碼技術(shù)成為銜接(以形態(tài)學(xué)為標(biāo)志的)傳統(tǒng)分類學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)及系統(tǒng)分類學(xué)等學(xué)科間交叉研究的橋梁。其衍生出的相關(guān)分析方法對(duì)闡釋涉及傳統(tǒng)分類學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)、進(jìn)化生態(tài)學(xué)、生物地理學(xué)、生物信息學(xué)等相關(guān)學(xué)科的一系列重要科學(xué)問(wèn)題均產(chǎn)生了積極的促進(jìn)作用[54-55]。

在信息化時(shí)代，通用性、客觀性和可操作性等生物多樣性工作的基本需求，函需在纖毛蟲物種鑒定、分類、進(jìn)化及生態(tài)學(xué)等研究中引入輔助性的分子標(biāo)記，而這一客觀需求推動(dòng)了纖毛蟲領(lǐng)域分子技術(shù)的革新和多學(xué)科的交叉發(fā)展[2,56-57]。到本世紀(jì)初，得益于DNA條形碼技術(shù)和基于高通量測(cè)序技術(shù)的各種組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，纖毛蟲分子標(biāo)記的研究再次迎來(lái)新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。其中，適于纖毛蟲類群的DNA條形碼候選基因在不同層次、不同領(lǐng)域的應(yīng)用和推廣對(duì)當(dāng)今纖毛蟲生物多樣性的研究提出了新的要求， 也帶來(lái)了新的認(rèn)知。

該技術(shù)自21世紀(jì)初建立以來(lái)，在動(dòng)物、植物、真菌等類群的生物多樣性研究中大放異彩，但在真核微生物上的應(yīng)用卻嚴(yán)重滯后。作為為數(shù)不多的代表性工作之一，作者團(tuán)隊(duì)在過(guò)去幾年中圍繞纖毛蟲DNA條形碼候選基因的篩選工作開(kāi)展了建設(shè)性的探索[58-60]。

研究進(jìn)展可以概括為如下幾點(diǎn)：(1) 證實(shí)了常規(guī)barcode條碼標(biāo)記基因——線粒體細(xì)胞色素c氧化酶I(COI)基因5’端序列不僅可(例如在草履蟲屬內(nèi))進(jìn)行近緣種的物種界定，而且具有鑒別隱存種的優(yōu)勢(shì)；(2)比較探討了COI基因不同層面的差異對(duì)種類鑒定和種群結(jié)構(gòu)分析的影響，明確了線粒體基因的異質(zhì)性，揭示了COI基因在同一細(xì)胞內(nèi)部以及個(gè)體間、種群間的遺傳差異，但該差異不影響其物種界定的能力；(3)以前口蟲為材料，我們綜合比較了7個(gè)核基因變異區(qū)和線粒體COI基因作為DNA條形碼的區(qū)分效力，揭示了COI、ITS1、ITS2、28SrRNA基因D2區(qū)具有明顯的barcode gap區(qū)，特別是COI有發(fā)現(xiàn)隱存種的潛力；(4)我們隨后的研究發(fā)現(xiàn)，雖COI基因有較大優(yōu)勢(shì)，但其在不同類群間遺傳分化較大且存在長(zhǎng)度各異的插入?yún)^(qū)，不利于通用引物設(shè)計(jì)。此外，高變的ITS1/ITS2區(qū)及18SrRNA基因V2/V9區(qū)雖在一定程度上可進(jìn)行物種界定但卻無(wú)法較好的反映物種間的演化關(guān)系。鑒于此，我們提出纖毛蟲物種多樣性研究適宜于用18SrRNA基因V4區(qū)對(duì)非近緣物種進(jìn)行判讀，再借助進(jìn)化速率較快的28SrRNA基因D1～D2區(qū)或COI基因進(jìn)行近緣種或隱存種刻畫的策略(見(jiàn)圖4)[61]。

而隨著高通量測(cè)序技術(shù)的推進(jìn)，應(yīng)運(yùn)而生的宏條形碼技術(shù)對(duì)纖毛蟲物種多樣性分析的分子標(biāo)記又提出了新的要求：合適的通用引物、合適的片段長(zhǎng)度和豐富準(zhǔn)確的參考數(shù)據(jù)庫(kù)。因此，與前期的基因標(biāo)記篩選工作相比，更為迫切的任務(wù)是物種參考數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建。目前制約建庫(kù)的首要因素是素材(物種、種群)的采集與正確鑒定，這仍需寄希望于分類學(xué)家專業(yè)的形態(tài)分類學(xué)知識(shí)。得益于作者及合作團(tuán)隊(duì)過(guò)去二十年研究工作的積累和由此構(gòu)建的內(nèi)容豐富的纖毛蟲DNA庫(kù)提供的素材，基于18SrRNA基因V4區(qū)的宏基因組學(xué)分析初步完成了淡水環(huán)境樣本較大規(guī)模的摸底分析，實(shí)現(xiàn)了從類群水平到群落水平的推進(jìn)?？梢灶A(yù)見(jiàn)的前景是，基因條形碼技術(shù)的完善和應(yīng)有將進(jìn)一步助力于揭示纖毛蟲各種生態(tài)系統(tǒng)中重要生態(tài)學(xué)功能、地位及其與環(huán)境間的相互關(guān)系。

(A，D自Zhao et al.[58]；B自Zhao et al.[60]；C自Zhao et al.[59]。A, D from Zhao et al.[58]; B from Zhao et al.[60]; C from Zhao et al.[59].)

5 纖毛蟲的組學(xué)與基因進(jìn)化

隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，基因組和轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)大數(shù)據(jù)的解析為研究生命的起源與演化、發(fā)育、遺傳、代謝等一系列生物學(xué)基本問(wèn)題提供了全新的視野和有力的工具，已經(jīng)成為當(dāng)前生物科學(xué)領(lǐng)域中最具影響力的前沿領(lǐng)域[62-64]。與此領(lǐng)域大背景相對(duì)照，纖毛蟲組學(xué)的研究目前尚處于方興未艾的起步階段，大量未知等待解答。近年來(lái)，作者依托所在團(tuán)隊(duì)的分類學(xué)背景，聚焦進(jìn)化地位特殊種、環(huán)境極端種等類群，目前已經(jīng)完成了對(duì)包括大彈跳蟲、玫瑰喇叭蟲、扇形游仆蟲、具溝急游蟲等十余種基因組和轉(zhuǎn)錄組的深度測(cè)序。此外，我們利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，累計(jì)完成了對(duì)80余代表物種單細(xì)胞水平的基因組/轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(見(jiàn)圖5)。

作為代表性成果之一，我們以扇形游仆蟲為模式，分析了高質(zhì)量的大核基因組、部分小核基因組及不同環(huán)境脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[65]，結(jié)果包括：(1)其大核基因組中含有超過(guò)25 000個(gè)完整的單基因的微型染色體 (單倍體基因組大小約85MB)；(2)小核基因組中豐度最高的內(nèi)部刪除序列的邊界都存在保守的序列基序5’-TA-3’，且染色體斷裂位點(diǎn) (CBS) 被復(fù)制并保留在大核基因組中；(3)通過(guò)分析不同環(huán)境脅迫 (營(yíng)養(yǎng)缺乏、極端溫度、極端鹽度等) 下轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)，揭示了對(duì)外部物理或化學(xué)刺激作出反應(yīng)的基因簇；(4)在鹽度和化學(xué)應(yīng)激下，HSP70基因的轉(zhuǎn)錄顯著增加，但是對(duì)溫度刺激沒(méi)有反應(yīng)；推測(cè)這種耐溫性與調(diào)節(jié)區(qū)溫度壓力敏感元件的演化缺失有關(guān)。這些數(shù)據(jù)的解析為理解具有高度適應(yīng)能力的微生物的獨(dú)特生物學(xué)提供了分子證據(jù)。

我們對(duì)大彈跳蟲的基因組和轉(zhuǎn)錄組的工作顯示：(1)其大核染色體呈現(xiàn)高度的片段化，微型染色體的拷貝數(shù)不均勻，與基因表達(dá)水平相關(guān)；(2)DNA和RNA水平存在明顯的動(dòng)態(tài)變化，包括大核形成過(guò)程中內(nèi)部刪除序列的可變剪切和轉(zhuǎn)錄過(guò)程中內(nèi)含子的大規(guī)?？勺兗羟校?3)大多數(shù)微型染色體的副端粒區(qū)存在一個(gè)穩(wěn)定的TATAbox結(jié)構(gòu)，其轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制高度簡(jiǎn)潔；(4)對(duì)不同溫度下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析可以從細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞內(nèi)吞和溶酶體、細(xì)胞周期控制、核小體組蛋白等層面解讀了大彈跳蟲對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)機(jī)制。

(A～D, K 自Chen et al.[65]； E, F自Chen et al.[53]； G～J自Zheng et al.[66]；L自Gao et al.[70]； M自Gao et al.[71]。A～D, K from Chen et al.[65]; E, F from Chen et al.[53]; G～J from Zheng et al.[66]; L from Gao et al.[70]; M from Gao et al.[71]. )

圖5 纖毛蟲原生動(dòng)物的基因組與進(jìn)化
Fig.5 Genome and evolution of ciliated protozoans

結(jié)合基因組與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們對(duì)玫瑰喇叭蟲的大核基因組(內(nèi)含子與非編碼基因間區(qū))和種群遺傳學(xué)研究表明：(1)與同屬種天藍(lán)喇叭蟲相比較顯示，喇叭蟲的進(jìn)化歷程中存在一次全基因組的倍增事件，玫瑰喇叭蟲的基因組呈現(xiàn)為未發(fā)生全基因組倍增的祖先形態(tài)；(2)兩種喇叭蟲均具有極短的內(nèi)含子和非編碼基因間區(qū)，且非編碼區(qū)域能夠有效地起始轉(zhuǎn)錄。

以檸檬類瘦尾蟲為材料，我們利用端粒引物PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序相結(jié)合的方法，快捷地獲取了其部分大核基因組數(shù)據(jù)[66]，確認(rèn)該物種的端粒序列為(C4A4)2C4，主要發(fā)現(xiàn)包括：(1)大核基因組基本為“一條基因一條染色體”的模式，有少量染色體包含兩或三個(gè)基因；(2)密碼子偏好性分析顯示其存在終止密碼子重分配現(xiàn)象；(3)染色體分析顯示出明顯不對(duì)稱的GC偏移和正義鏈亞端粒區(qū)高AT偏好，同時(shí)在亞端粒區(qū)域的3’端發(fā)現(xiàn)11 bp高AT含量的結(jié)構(gòu)單元及存在一個(gè)40 bp不敏感的GC振蕩區(qū)，推測(cè)可能與端粒的添加、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的啟動(dòng)等有關(guān)；(4)發(fā)現(xiàn)潛在的TATA-box存在于編碼鏈的5’亞端粒區(qū)，集中在30～50 nt區(qū)段。

我們對(duì)具溝急游蟲轉(zhuǎn)錄組的深度測(cè)序和分析[67]，完成了超級(jí)樹(shù)和超級(jí)數(shù)據(jù)集兩種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系重構(gòu)方法的比較，結(jié)果表明兩種方法重構(gòu)的纖毛蟲進(jìn)化關(guān)系在綱級(jí)水平上是一致的；基于包括具溝急游蟲在內(nèi)的 13 種纖毛蟲的形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)差異信息比較，在組學(xué)水平上探究了表層胞質(zhì)蛋白基因的表達(dá)水平與其細(xì)胞形態(tài)的相關(guān)性并揭示了 Alveolin 和 EPC 兩個(gè)表層胞質(zhì)蛋白基因家族的表達(dá)量與圍口動(dòng)基列、射出體、口區(qū)等形態(tài)學(xué)特征具有顯著相關(guān)性。

基因重組作為一重要的產(chǎn)生基因多樣性及驅(qū)動(dòng)進(jìn)化的機(jī)制，在許多真核細(xì)胞中都有發(fā)生。這一過(guò)程可以發(fā)生在某些特定基因上，也可以發(fā)生在全基因組層面。最劇烈和普遍的基因重組發(fā)生在纖毛蟲的大核基因組形成過(guò)程中。由于不同纖毛蟲的大小核數(shù)目不盡相同以及高度的物種多樣性，其細(xì)胞大小核演化過(guò)程中序列的刪除、亂序基因的重排、染色體片段化及基因多倍化程度等基因重組的模式和機(jī)制也因此呈現(xiàn)出顯著的差異[68-69]。圍繞此過(guò)程和機(jī)理的研究對(duì)于了解物種形成和分化、真核生物基因組進(jìn)化等都具有重要的理論意義。

作者及合作者利用已完成轉(zhuǎn)錄組分析的鉤刺斜管蟲為材料，對(duì)其基因亂序和不同基因家族的選擇性拼接模式等進(jìn)行了探討和揭示[70-71]，主要成果包括：(1)對(duì)高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析，從中篩選出112個(gè)候選基因家族，發(fā)現(xiàn)選擇性拼接在基因家族中廣泛存在且這些基因可能是該纖毛蟲所特有；(2)首次測(cè)定鉤刺斜管蟲中三個(gè)選擇性拼接基因家族，發(fā)現(xiàn)不同基因家族具有不同的選擇性拼接模式；(3)提出了亂序基因進(jìn)化的理論模型：基因亂序由基因復(fù)制及之后的分化來(lái)演繹，選擇性拼接可能是基因亂序進(jìn)化過(guò)程的中間形式；(4)鉤刺斜管蟲隱匿種間大小核基因的重組模式較為保守，但是小核特異序列的進(jìn)化速率較高，且接頭序列存在移位現(xiàn)象，揭示了基因重排在物種分化中的作用[72]。以上工作為基因組結(jié)構(gòu)對(duì)基因家族進(jìn)化的影響給出了新觀點(diǎn)和新詮釋，為纖毛蟲物種分化-形成機(jī)理提供了重要資訊。

在國(guó)際范圍內(nèi)，圍繞纖毛蟲大小核間的基因組重組模式和機(jī)制的研究目前尚處于探索階段。與現(xiàn)有纖毛蟲的龐大系統(tǒng)相比，迄今有關(guān)兩型核間基因組重組的認(rèn)知均來(lái)自對(duì)四膜蟲、草履蟲及個(gè)別“一個(gè)基因一條染色體”淡水模式種的研究，而對(duì)于具有更高多樣性的海洋類群仍一無(wú)所知。我們的目標(biāo)是建立一海洋纖毛蟲新型模式動(dòng)物：扇形游仆蟲。以此為材料，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)手段，揭示其大小核基因組的重組模式；在此基礎(chǔ)上，探討大小核基因組的重組機(jī)制，為后續(xù)更深入的機(jī)理研究建立第一手的數(shù)據(jù)資料；同時(shí)，優(yōu)化扇形游仆蟲接合生殖的誘導(dǎo)條件，揭示其有性生殖過(guò)程中大小核演化的完整過(guò)程、界定性別決定相關(guān)的調(diào)控基因。這項(xiàng)工作的目的是將該物種構(gòu)建為一新的海洋模式生物，從而為拓展更大空間的基因進(jìn)化研究奠定基礎(chǔ)。

6 以四膜蟲為模式的表觀遺傳學(xué)

在過(guò)去近半個(gè)世紀(jì)中，以四膜蟲為模式動(dòng)物的研究曾先后取得了包括核酶和端粒酶在內(nèi)的重大發(fā)現(xiàn)。伴隨著全基因組測(cè)序及基因操作技術(shù)的建立，特別是自人類獲得其無(wú)菌培養(yǎng)體系以來(lái)，四膜蟲已發(fā)展成為細(xì)胞生物學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域中理想的模式材料[73]。

與大部分纖毛蟲一樣，四膜蟲的大小核具有(幾乎)相同的DNA序列卻有著不同的表觀遺傳調(diào)控因素，二者在基因組大小、基因表達(dá)、基因拷貝數(shù)等各方面具有巨大的差異。迄今所知，這些差異在很大程度上是由表觀遺傳因素(如組蛋白修飾、DNA甲基化等)進(jìn)行調(diào)控的。

利用四膜蟲為模式材料，我們及合作者團(tuán)隊(duì)近年來(lái)聚焦于組蛋白修飾和DNA甲基化(見(jiàn)圖6)，陸續(xù)開(kāi)展和完成了以下工作：

(1)首次鑒定了組蛋白單甲基化酶TXR1(TetrahymenaTrithorax Related-1)，可特異性地催化組蛋白第27位賴氨酸的甲基化(H3K27me1)。我們還證實(shí)了TXR1通過(guò)與PCNA的結(jié)合定位到復(fù)制叉上，催化形成H3K27me1，以維持正常的染色體構(gòu)象或影響下游作用因子的結(jié)合。本工作為研究表觀遺傳信息和遺傳信息的協(xié)同復(fù)制提供了重要的模式平臺(tái)[74-77]。

(2)繪制了首份單堿基分辨率的四膜蟲N6-腺嘌呤甲基化(6mA)全基因組分布圖譜，并在此基礎(chǔ)上系統(tǒng)刻畫了其序列特征和染色質(zhì)環(huán)境：發(fā)現(xiàn)6mA位點(diǎn)絕大部分位于5’-AT-3’序列上，偏向性的分布在RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄基因的5’端，但與轉(zhuǎn)錄活性僅存在弱相關(guān)性。另外，6mA聚集在連接DNA上，且該區(qū)域兩側(cè)富集占位穩(wěn)定性高、含有組蛋白變體H2A.Z的核小體。上述發(fā)現(xiàn)揭示了6mA的分布由序列特征和染色質(zhì)環(huán)境共同決定，并由此提出6mA與基因轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重塑等同為染色質(zhì)調(diào)控的重要組成，為后續(xù)研究6mA的功能和調(diào)控機(jī)制提供了重要數(shù)據(jù)[78]。

(3)改進(jìn)了分離條件從而獲得了大量高純度的大核和小核并利用優(yōu)化的酶切和離心方案將核小體分辨率提高至單核小體水平。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)分別對(duì)大核和小核的單核小體樣品進(jìn)行高通量測(cè)序及分析，我們發(fā)現(xiàn)順式元件主要決定核小體占位，而反式元件主要決定核小體定位。同時(shí)，順式和反式元件對(duì)于核小體的全局分布具有協(xié)同調(diào)控效應(yīng)。此工作充分利用了四膜蟲的雙元核對(duì)照系統(tǒng)，為順式(序列特征)和反式(轉(zhuǎn)錄活性)作用元件共同決定核小體分布的理論提供了直接證據(jù)[79-80]。

(A, C, D, E, G, I, J, K 自 Zhao et al.[81]； F, G改自Wang et al.[78]；H 改自Gao et al.[74]。A, C, D, E, G, I, J, K was adapted from Zhao et al.[81; F, G was adapted from Wang et al.[78]; H was adapted from Gao et al.[74].)

圖6 四膜蟲的表觀遺傳學(xué)
Fig.6 Epigenetic studies usingTetrahymenaas model organism

(4)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)座子的編碼RNA(表達(dá))和非編碼RNA(沉默)利用同一套轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，兩種RNA之間的平衡由Polycomb抑制通路和RNA干擾通路共同調(diào)控。新發(fā)現(xiàn)的現(xiàn)象包括：Polycomb抑制通路蛋白和RNA干擾通路蛋白的敲除株系中，通常狀況下應(yīng)為沉默狀態(tài)的轉(zhuǎn)座子的表達(dá)被大規(guī)模激活，某些被激活的轉(zhuǎn)座子可能會(huì)編碼有活性的轉(zhuǎn)座酶并控制自身的轉(zhuǎn)座。該工作系首次針對(duì)四膜蟲中轉(zhuǎn)座子的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行的探討，解釋了其沉默與重新激活這一看似矛盾的現(xiàn)象，為深入研究轉(zhuǎn)座子與宿主的協(xié)同進(jìn)化提供了重要理論支持[81]。

我們進(jìn)展中的工作仍將繼續(xù)圍繞甲基化這一主流方向，特別聚焦在DNA 6mA催化酶學(xué)系統(tǒng)和表觀遺傳識(shí)別信號(hào)系統(tǒng)的鑒定和刻畫、組蛋白TXR1蛋白調(diào)控復(fù)制的分子機(jī)制的解析、轉(zhuǎn)座子對(duì)基因組穩(wěn)定性的影響等問(wèn)題。此外，還將嘗試構(gòu)建新的模式研究體系，即以海洋纖毛蟲為模式的動(dòng)物模型。這項(xiàng)探索的潛在意義在于：將極大地補(bǔ)充現(xiàn)有纖毛蟲模式生物緊缺的現(xiàn)狀，為未來(lái)深入挖掘真核生物表觀遺傳調(diào)控中的新現(xiàn)象和新機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

致謝：借此感謝(中國(guó)海洋大學(xué))原生動(dòng)物學(xué)研究室的歷屆畢業(yè)生以及在讀生們，在過(guò)去的20余年中，他們?yōu)閷?shí)驗(yàn)室的建設(shè)和發(fā)展、為該文中所涉成果做成了巨大的貢獻(xiàn)。特別謝意送給我們的國(guó)際合作者們，他們的加盟與合作，共同成就了團(tuán)隊(duì)的今天。