馬德昭 田 菲 劉思嘉 湯永濤 宋文珠 王虹蕾 史建全祁洪芳 趙 凱

(1. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所, 高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 高原魚類進(jìn)化與功能基因組學(xué)實(shí)驗(yàn)室, 西寧 810001;2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 青海省動(dòng)物生態(tài)基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 西寧 810001;4. 青海湖裸鯉救護(hù)中心, 西寧 810016)

多子小瓜蟲(Ichthyophthirius multifiliisFouquet, 1876)隸屬于寡膜纖毛綱(Oligohymenophorea)、膜口目(Hymenostomatidae)、凹口科(Ophryoglenidae)、小瓜蟲屬(Ichthyophthirius), 是一種世界性分布的淡水魚類寄生蟲, 能廣泛感染各種淡水魚類,引起魚類“白點(diǎn)病”[1—4]。目前對(duì)多子小瓜蟲的感染尚沒有有效的防治方法, 養(yǎng)殖中主要采用化學(xué)藥物進(jìn)行治療, 但效果均不理想, 反而會(huì)對(duì)魚體造成嚴(yán)重?fù)p傷, 甚至引起環(huán)境污染[5—8]。因多子小瓜蟲感染率高、缺乏有效防治手段, 對(duì)全球水產(chǎn)行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[9,10]。

青海湖裸鯉(Gymnocypris przewalskiiKessler)和黃河裸裂尻魚(Schizopygopsis pylzoviKessler)同為裂腹魚亞科(Schizothoracinae)魚類, 分別為裸鯉屬(GymnocyprisGunther)和裸裂尻魚屬(SchizopygopsisSteindachner)的代表性物種。2種魚同是青藏高原重要經(jīng)濟(jì)魚類, 在維護(hù)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)平衡中發(fā)揮重要作用[11]。青海湖裸鯉主要分布于青海湖及其附屬水系, 其指名亞種(Gymnocypris przewalskii przewalskii)分布于青海湖區(qū), 適應(yīng)湖泊咸水環(huán)境。20世紀(jì)由于亂捕亂撈和生境破壞, 青海湖裸鯉種群數(shù)量大幅下降并被列入《中國瀕危動(dòng)物紅皮書》;近些年通過封湖育漁和增殖放流, 青海湖裸鯉種群已有所恢復(fù)[12,13]。黃河裸裂尻魚主要分布于黃河上游干支流和柴達(dá)木水系, 適應(yīng)河流淡水環(huán)境, 為青海省重點(diǎn)保護(hù)物種[11]。近些年在裂腹魚類人工養(yǎng)殖過程中發(fā)現(xiàn), 青海湖裸鯉、黃河裸裂尻魚等魚類同樣面臨多子小瓜蟲的嚴(yán)重危害[14—17], 已成為阻礙裂腹魚類物種保護(hù)和人工馴化養(yǎng)殖的重要限制因素。

目前, 國內(nèi)外對(duì)裂腹魚類的研究主要集中在適應(yīng)進(jìn)化方面, 對(duì)裂腹魚類免疫系統(tǒng)和感染性疾病的研究較少[18,19]。多子小瓜蟲是人工馴養(yǎng)裂腹魚類中傳播最廣、危害也最嚴(yán)重的寄生蟲之一, 對(duì)該病的研究目前僅限于青海湖裸鯉, 且主要為分子層面的研究[18,19]。對(duì)于感染性疾病, 病理學(xué)研究能直觀的反應(yīng)病原體對(duì)宿主組織的損傷機(jī)制和宿主的死亡原因, 為尋求合適的防治方法找到切入口。目前,裂腹魚類中小瓜蟲病的病理學(xué)研究尚處于空白, 對(duì)該病在裂腹魚類中引起的組織病理損傷缺乏系統(tǒng)性的描述。湖泊型和河流型是裂腹魚類生存的兩種典型生態(tài)型[11,20,21], 本研究以適應(yīng)咸水湖泊環(huán)境的青海湖裸鯉指名亞種和適應(yīng)淡水河流環(huán)境的黃河裸裂尻魚作為研究對(duì)象, 通過比較2種魚類感染小瓜蟲后的病理差異, 研究適應(yīng)不同生境的裂腹魚類對(duì)小瓜蟲感染的響應(yīng)機(jī)制, 為裂腹魚類小瓜蟲病防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚的采集

經(jīng)青海省漁政部門批準(zhǔn), 青海湖裸鯉從青海湖裸鯉救護(hù)中心獲得, 黃河裸裂尻魚采自湟水河上游西海鎮(zhèn)附近水域, 2種魚各150尾, 均為體長15—20 cm、體型正常個(gè)體, 實(shí)驗(yàn)前分別在經(jīng)高錳酸鉀嚴(yán)格消毒的循環(huán)過濾魚缸中暫養(yǎng)1周, 養(yǎng)殖水溫保持在(20±1)℃, 每天早中晚各投喂1次商業(yè)魚飼料,使其充分適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境。

1.2 感染實(shí)驗(yàn)

將暫養(yǎng)1周的青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚分別分為2組, 每組75尾, 一組為感染組, 一組為對(duì)照組。感染實(shí)驗(yàn)所用多子小瓜蟲通過連續(xù)感染青海湖裸鯉的方法保存于實(shí)驗(yàn)室。感染實(shí)驗(yàn)參考Xu等的方法[22], 感染實(shí)驗(yàn)前用過量麻醉劑MS222處理感染小瓜蟲的青海湖裸鯉, 將魚體放入裝有1 L蒸餾水的塑料盆中, 并刮取皮膚部位小瓜蟲, 24℃下放置18h后收集小瓜蟲掠食體。用8000個(gè)/尾的掠食體劑量對(duì)感染組青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚進(jìn)行感染, 感染時(shí)間為4h, 對(duì)照組不做處理。

1.3 實(shí)驗(yàn)記錄

每晚10點(diǎn)對(duì)感染小瓜蟲的青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚死亡情況進(jìn)行記錄, 并對(duì)處于不同感染時(shí)間段的兩種魚的癥狀、軀體病理變化進(jìn)行觀察并記錄。

1.4 鏡下檢查和解剖檢查

魚體表出現(xiàn)肉眼明顯可見的白點(diǎn)時(shí), 各取3條感染最嚴(yán)重的青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚進(jìn)行鏡下觀察。首先利用體視鏡對(duì)皮膚、鰭和鰓等部位進(jìn)行觀察, 確定感染規(guī)律。從小瓜蟲感染較密集的部位用載玻片刮取適量黏液進(jìn)行壓片觀察, 之后用過量麻醉劑麻醉后從每條魚的第一鰓弓處取適量鰓絲進(jìn)行壓片觀察。最短時(shí)間內(nèi)完成鏡檢后對(duì)魚體進(jìn)行解剖并檢查各臟器是否有明顯病理改變, 腸道內(nèi)是否有內(nèi)容物。并在不同感染時(shí)間段刮取兩種魚的皮膚黏液進(jìn)行壓片檢查。

1.5 組織病理學(xué)檢查

在感染后第3天, 各采集3條感染組與未感染組的青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚鰓和背部皮膚肌肉連結(jié)組織, 并剪成大小合適的塊狀, 用4%多聚甲醛磷酸緩沖液(4% PFA-PBS)固定, 固定后用不同濃度酒精脫水(依次為30%、50%、75%、90%和100%),脫水組織經(jīng)過二甲苯透明兩次后浸蠟過夜, 之后用石蠟包埋。包埋好的樣品用手搖式切片機(jī)進(jìn)行切片, 厚度5 μm, 組織切片經(jīng)脫蠟后采用HE(蘇木精-伊紅)染色, 待干燥后進(jìn)行封片, 并在鏡下觀察、拍照。

1.6 掃描電子顯微鏡檢查

在感染后第3天, 采集3條感染組與未感染組青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚的背部皮膚和鰓組織, 剪成大小合適的塊狀, 4℃固定液(2.5%戊二醛)避光浸泡樣品4h后用不同濃度酒精脫水(依次為30%、50%、75%、90%和100%), 之后用1:1乙酸異戊酯處理1h, 再用乙酸異戊酯置換1h后自然干燥20min,用鍍金儀對(duì)處理好的樣品鍍金, 利用日立SU8000型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡對(duì)鍍金后組織進(jìn)行觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚感染小瓜蟲后死亡趨勢(shì)及病理變化

如圖 1所示, 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚在感染后第3天開始大量死亡, 隨后死亡量逐漸下降, 青海湖裸鯉在感染后死亡更加急劇。青海湖裸鯉死亡高峰期出現(xiàn)在感染后第3至第4天, 到感染后第8天全部死亡, 死亡率達(dá)100%。黃河裸裂尻魚死亡高峰期在感染后第3到第5天, 感染2周后僅存活2尾,最終死亡率達(dá)97.3%。

青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚感染多子小瓜蟲后體表出現(xiàn)大量白色小點(diǎn), 游動(dòng)緩慢, 攝食量明顯下降。感染早期, 青海湖裸鯉皮膚黏液分泌量明顯增多, 軀干表面形成一層透明膠狀層, 隨著感染程度加重, 透明膠狀層變?yōu)槿榘咨z狀物并伴有不同程度脫落, 此時(shí)魚體發(fā)白。黃河裸裂尻魚在小瓜蟲感染后第4天, 尾鰭、背鰭等出現(xiàn)壞死, 鰭上皮組織凋亡脫落僅剩鰭條, 因失去完整的鰭, 魚體無法控制方向和平衡出現(xiàn)斜游或浮于水面現(xiàn)象。在感染后期軀體皮膚出現(xiàn)細(xì)菌感染樣潰爛, 部分魚呈全身性潰爛, 表皮大量脫落, 魚體表呈灰黑色無光澤, 身體消瘦。

2.2 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚鏡下和解剖檢查

體視鏡觀察發(fā)現(xiàn), 小瓜蟲主要寄生于2種魚的軀干和鰭, 頭部較少。寄生于青海湖裸鯉的蟲體密度要明顯高于黃河裸裂尻魚。取青海湖裸鯉鰓絲和背側(cè)皮膚部位黏液進(jìn)行壓片后在顯微鏡下觀察可見大量大小不等、不停游動(dòng)的圓形或橢圓形滋養(yǎng)體, 蟲體內(nèi)清晰可見馬蹄形大核, 多見聚集分布(圖 2a、2d)。取黃河裸裂尻魚鰓絲和皮膚黏液進(jìn)行壓片觀察僅見少量大小不等、圓形或橢圓形有馬蹄形核的滋養(yǎng)體, 視野中散落分布(圖 2b、2e)。2種鏡檢方法均顯示在同一感染階段青海湖裸鯉感染的多子小瓜蟲密度明顯高于黃河裸裂尻魚。此外, 在青海湖裸鯉體表產(chǎn)生的膠狀黏液層中觀察到處于八細(xì)胞期、三十二細(xì)胞期的包囊, 包囊內(nèi)子個(gè)體清晰可見(圖 2c、2f)。

解剖檢查發(fā)現(xiàn), 相比于對(duì)照組(圖 3a), 感染組青海湖裸鯉的鰓被濃稠黏液包裹, 鰓絲糜爛, 呈嚴(yán)重缺血狀態(tài)。肝臟變性呈淡黃色, 膽有不同程度的腫大, 腸道無內(nèi)容物(圖 3c)。相比于未感染組(圖3b), 感染組黃河裸裂尻魚鰓糜爛、發(fā)白。肝臟有明顯病理改變, 失去原有紅潤光澤, 膽有不同程度腫大, 膽汁色淺, 腸道無內(nèi)容物(圖 3d)。

2.3 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚組織病理學(xué)檢查

圖 1 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚感染多子小瓜蟲后的死亡趨勢(shì)Fig. 1 The mortality rates of Gymnocypris przewalskii przewalskii and Schizopygopsis pylzovi after I. multifiliis infection

圖 2 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚的鰓和皮膚黏液顯微鏡檢查Fig. 2 Microscopic examination of gill and skin mucus of Gymnocypris przewalskii przewalskii and Schizopygopsis pylzovi

從組織切片可以看到, 未感染的青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚鰓絲結(jié)構(gòu)完整、界限清晰, 鰓小片緊密排列于鰓絲, 上覆密集鰓絲上皮細(xì)胞(圖 4a、4b)。感染后第3天, 青海湖裸鯉鰓絲間有大量大小不等的小瓜蟲滋養(yǎng)體, 蟲體在鰓絲內(nèi)的寄生使鰓小片受擠壓變形, 鰓小片和鰓絲上皮細(xì)胞壞死脫落,部分鰓絲斷裂(圖 4c)。感染后第3天, 黃河裸裂尻魚鰓絲間見較多小瓜蟲滋養(yǎng)體, 蟲體在鰓絲間的移動(dòng)使鰓小片和上皮細(xì)胞壞死脫落 (圖 4d)。觀察寄生于鰓絲部位的多子小瓜蟲滋養(yǎng)體, 可見蟲體胞口呈內(nèi)凹袋狀, 胞質(zhì)內(nèi)有大量深染顆粒(圖 5a、5b、5c)。

圖 3 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚的解剖檢查Fig. 3 Anatomic examination of visceral organs of Gymnocypris przewalskii przewalskii and Schizopygopsis pylzovi

圖 4 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚鰓組織切片F(xiàn)ig. 4 Histology of gill of Gymnocypris przewalskii przewalskii and Schizopygopsis pylzovi

未感染的青海湖裸鯉皮膚表皮結(jié)構(gòu)完整, 細(xì)胞間連接緊密, 無空隙(圖 6a)。感染后第3天, 青海湖裸鯉皮膚表皮層和固有層間寄生有多子小瓜蟲, 表皮下層出現(xiàn)空隙, 皮膚表皮受到嚴(yán)重?fù)p傷(圖 6c)。未感染的黃河裸裂尻魚皮膚表皮結(jié)構(gòu)完整, 表皮細(xì)胞連接緊密, 表皮層和固有層間界限清晰(圖 6b)。感染后第3天, 黃河裸裂尻魚皮膚表皮結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化, 大量表皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡化病理改變, 失去原有的緊密結(jié)構(gòu), 表皮層與固有層間界限模糊不清(圖 6d)。

圖 5 位于鰓上的多子小瓜蟲滋養(yǎng)體Fig. 5 The trophont of Ichthyophthirius multifiliis on the gill of Gymnocypris przewalskii przewalskii and Schizopygopsis pylzovi

圖 6 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚皮膚組織切片F(xiàn)ig. 6 Histological sections of skin of Gymnocypris przewalskii przewalskii and Schizopygopsis pylzovi

2.4 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚掃描電子顯微鏡檢查

圖 7 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚鰓掃描電鏡觀察Fig. 7 The ultrastructure of gill of Gymnocypris przewalskii przewalskii and Schizopygopsis pylzovi by SEM

圖 8 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚鰓絲掃描電鏡觀察Fig. 8 The ultrastructure of gill filament of Gymnocypris przewalskii przewalskii and Schizopygopsis pylzovi by SEM

未感染組青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚鰓絲結(jié)構(gòu)完整、清晰, 表面無分泌物覆蓋, 鰓小片排列整齊(圖 7a、7b)。在高倍鏡下觀察鰓小片間無分泌物、血細(xì)胞堆積, 鰓小片表面細(xì)胞輪廓清晰可見(圖 8a、8b)。相比于未感染組, 感染組青海湖裸鯉鰓絲有不同程度損傷和黏連, 鰓小片排列紊亂, 鰓小片間充滿分泌物(圖 7c)。高倍視野觀察可見表面光滑的球形分泌物堆積于鰓小片間, 鰓小片表面細(xì)胞輪廓消失(圖 8c)。感染組黃河裸裂尻魚鰓絲表面覆蓋黏液, 鰓小片間充滿分泌物, 鰓小片排列紊亂, 小瓜蟲的移動(dòng)造成鰓絲損傷, 鰓小片萎縮、脫落(圖 7d)。高倍視野下見表面光滑的球形分泌物和凹盤狀紅細(xì)胞充滿鰓小片間隙, 鰓小片表面細(xì)胞輪廓消失(圖 8d)。鏡下可見被覆密集纖毛的多子小瓜蟲滋養(yǎng)體寄生于鰓小片間, 寄生部位的組織被滋養(yǎng)體啃食造成嚴(yán)重?fù)p傷(圖 5d)。

對(duì)皮膚組織進(jìn)行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn), 未感染組青海湖裸鯉皮膚表面較為平滑, 視野中見大量黏液細(xì)胞(圖 9a)。感染后第3天, 青海湖裸鯉皮膚表面覆蓋有大量表面光滑、形狀不規(guī)則的分泌物, 因分泌物覆蓋皮膚而無法觀察到皮膚表面正常結(jié)構(gòu)(圖9b)。小瓜蟲寄生部位組織突起, 周圍組織塌陷, 形成火山狀隆起(圖 9c)。未感染組黃河裸裂尻魚皮膚表面結(jié)構(gòu)清晰, 視野中偶見分泌細(xì)胞(圖 9d)。感染組黃河裸裂尻魚皮膚表面無顆粒狀分泌物, 與未感染組基本無差異(圖 9e)。小瓜蟲寄生部位組織突起, 周圍組織塌陷, 表皮細(xì)胞壞死脫落(圖 9f)。

3 討論

3.1 小瓜蟲感染引起青海湖裸鯉高死亡率的原因分析

通常在22℃條件下, 小瓜蟲感染宿主后2.5d就可發(fā)育為成熟的滋養(yǎng)體, 在此過程中小瓜蟲通過取食宿主寄生部位的組織和體液滿足自身能量需求,因此大量小瓜蟲的感染在短時(shí)間內(nèi)可對(duì)宿主鰓、皮膚等寄生部位組織造成急性損傷[1]。鰓和皮膚在魚類適應(yīng)外部環(huán)境和維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用, 鰓具有進(jìn)行氣體交換、含氮排泄物排出、酸堿調(diào)節(jié)、滲透壓調(diào)節(jié)等功能[23], 皮膚具有免疫防御、滲透壓調(diào)節(jié)等功能[24,25], 一旦遭受嚴(yán)重?fù)p傷將影響到魚體多種重要生理功能。

本研究發(fā)現(xiàn), 多子小瓜蟲的感染導(dǎo)致青海湖裸鯉鰓絲黏連、斷裂, 鰓絲上皮細(xì)胞萎縮、脫落, 皮膚表皮下層形成空腔, 同時(shí)觀察到肝臟發(fā)生病理改變, 膽囊呈現(xiàn)腫大。鰓和皮膚的這種損傷不僅嚴(yán)重影響到氣體交換和含氮排泄物正常排出, 而且會(huì)導(dǎo)致體液大量流失, 進(jìn)而引起機(jī)體缺氧、酸堿失衡、滲透壓失衡等, 持續(xù)的缺氧、滲透壓和酸堿的失衡會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生存的內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變, 組織細(xì)胞損傷、凋亡, 造成各器官不可逆的病理改變和功能障礙, 導(dǎo)致青海湖裸鯉短時(shí)間內(nèi)死亡。對(duì)感染小瓜蟲的草魚進(jìn)行的組織病理學(xué)研究和電鏡觀察顯示[26,27],小瓜蟲感染后草魚肝、腎細(xì)胞周圍完整結(jié)構(gòu)消失,肌肉細(xì)胞萎縮, 細(xì)胞核濃縮溶解, 各組織線粒體出現(xiàn)腫脹、嵴斷裂或消失現(xiàn)象, 表明小瓜蟲感染可引起魚體其他組織器官的損傷。此外, 感染小瓜蟲后青海湖裸鯉的攝食量下降, 而鰓和皮膚的損傷又引起體液流失, 體液流失往往伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)的流失,進(jìn)一步使體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)減少, 營養(yǎng)代謝無法滿足機(jī)體所需能量使魚體更加虛弱。Tian等[18]對(duì)感染小瓜蟲的青海湖裸鯉進(jìn)行多組織轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)小瓜蟲的感染顯著改變了魚體參與代謝、內(nèi)分泌等功能相關(guān)基因的表達(dá)模式, 表明小瓜蟲的感染影響了機(jī)體的代謝、內(nèi)分泌等功能。以上結(jié)果表明小瓜蟲對(duì)青海湖裸鯉鰓和皮膚造成的嚴(yán)重?fù)p傷引起其他器官的病理改變, 進(jìn)而導(dǎo)致代謝、內(nèi)分泌等功能紊亂, 是青海湖裸鯉在較短時(shí)間內(nèi)全部死亡的主要原因。

圖 9 青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚皮膚掃描電鏡觀察Fig. 9 The ultrastructure of skin of Gymnocypris przewalskii przewalskii and Schizopygopsis pylzovi by SEM

3.2 小瓜蟲感染引起黃河裸裂尻魚高死亡率的原因分析

與青海湖裸鯉感染小瓜蟲后短時(shí)間內(nèi)全部死亡相比, 黃河裸鯉尻魚出現(xiàn)延遲現(xiàn)象, 即死亡高峰出現(xiàn)在感染后第3到第5天, 之后死亡數(shù)逐漸減少趨于平穩(wěn), 2周后死亡率約為97.3%。這一趨勢(shì)與黃河裸裂尻魚感染小瓜蟲后的病理特征密切相關(guān)。病理學(xué)研究顯示, 感染組黃河裸裂尻魚鰓絲黏連, 鰓絲上皮細(xì)胞壞死脫落; 皮膚表皮細(xì)胞發(fā)生明顯空泡化病理改變, 失去原有的緊密結(jié)構(gòu); 肝臟有明顯病理改變, 膽囊有不同程度腫大。鰓和皮膚的損傷會(huì)嚴(yán)重影響到魚體多種正常生理功能[23], 引起機(jī)體嚴(yán)重缺氧及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡, 短時(shí)間內(nèi)造成各器官不可逆的病理改變和功能障礙, 導(dǎo)致黃河裸裂尻魚在感染后第3到第5天出現(xiàn)大量死亡。

與其他適應(yīng)淡水的魚類相似[28], 黃河裸裂尻魚在小瓜蟲感染后皮膚寄生部位易發(fā)生繼發(fā)性感染。從死亡高峰期存活下來的大多數(shù)個(gè)體均出現(xiàn)蛀鰭和細(xì)菌感染樣皮膚潰爛。鰭缺失使魚體無法控制方向和平衡而出現(xiàn)斜游、浮于水面的癥狀, 嚴(yán)重影響到魚的攝食、呼吸等。皮膚潰爛使機(jī)體內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境間的屏障被打破, 體液大量流失, 水進(jìn)入體內(nèi), 進(jìn)一步影響到內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài), 導(dǎo)致剩余個(gè)體逐漸死亡。組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn), 小瓜蟲感染后黃河裸裂尻魚皮膚表皮結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯空泡化病理改變, 失去了原有的緊密結(jié)構(gòu), 這種改變使魚體第一道防線受到嚴(yán)重破壞, 使細(xì)菌能輕易侵入魚體,引發(fā)繼發(fā)性感染而死亡。綜上所述, 黃河裸裂尻魚死亡高峰的出現(xiàn)主要與小瓜蟲發(fā)育過程中對(duì)鰓和皮膚組織的急性損傷相關(guān), 而感染后期的死亡與繼發(fā)性感染密切相關(guān), 因此小瓜蟲感染造成的急性損傷和繼發(fā)性感染是導(dǎo)致黃河裸裂尻魚高死亡率的原因。

3.3 青海湖裸鯉和黃河裸鯉尻魚感染小瓜蟲的病理學(xué)差異及原因分析

青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚屬于裂腹魚類中親緣關(guān)系較近的2種魚, 2種魚分布海拔相似, 但棲息環(huán)境卻有很大的差異, 青海湖裸鯉指明亞種適應(yīng)高鹽堿湖泊環(huán)境, 黃河裸裂尻魚則主要棲息于淡水河流中。裂腹魚類對(duì)高原不同水體環(huán)境的適應(yīng)使物種間和種群間在一些特征上產(chǎn)生明顯分化, 如棲息于河流和棲息于湖泊環(huán)境的裂腹魚類在腮耙特征和口裂特征上呈現(xiàn)出明顯的分化[11,29,30], 而對(duì)淡水和咸水環(huán)境的適應(yīng)則使青海湖裸鯉不同種群間個(gè)體的腮上皮細(xì)胞形態(tài)及黏液細(xì)胞、氯細(xì)胞數(shù)量產(chǎn)生差異[30]。而本研究發(fā)現(xiàn), 適應(yīng)不同生境的兩種裂腹魚在感染同一種寄生蟲時(shí), 表現(xiàn)的癥狀和造成的組織損傷同樣有明顯的差異。

青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚感染小瓜蟲后皮膚黏液分泌量有明顯差異。癥狀觀察和電鏡檢查均顯示, 青海湖裸鯉在感染小瓜蟲后黏液分泌量明顯增加并形成膠狀層, 但黃河裸裂尻魚并不明顯。Singh等[31]對(duì)不同的鯉科魚類表皮細(xì)胞進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn), 適應(yīng)不同生境的魚類黏液細(xì)胞數(shù)目具有顯著差異。張仁意等[30]應(yīng)用掃描電鏡對(duì)適應(yīng)咸水湖泊環(huán)境和淡水河流環(huán)境的青海湖裸鯉2個(gè)亞種(青海湖裸鯉指名亞種和甘子河亞種)鰓部進(jìn)行的研究顯示,指名亞種鰓絲表面可見黏液細(xì)胞, 但在甘子河亞種鰓絲表面極少觀察到黏液細(xì)胞的分布, 而黃河裸裂尻魚和青海湖裸鯉甘子河亞種棲息環(huán)境相似, 均為淡水環(huán)境?；谝陨贤茰y(cè), 青海湖裸鯉皮膚黏膜表面具有比黃河裸裂尻魚更加發(fā)達(dá)的黏液分泌系統(tǒng)。利用掃描電鏡對(duì)青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚皮膚進(jìn)行的觀察驗(yàn)證了青海湖裸鯉皮膚具有更多的黏液細(xì)胞。這種差異與青海湖裸鯉長期適應(yīng)高鹽堿湖泊環(huán)境不無關(guān)系。有研究認(rèn)為黏液細(xì)胞和黏液在魚體滲透壓調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用, 當(dāng)外部滲透壓升高時(shí)可增加魚體調(diào)節(jié)滲透壓的能力[25,32,33]。青海湖裸鯉在進(jìn)化過程中可能通過增加皮膚黏液細(xì)胞數(shù)量適應(yīng)高鹽堿的青海湖水體環(huán)境, 黃河裸裂尻魚則不需要通過這種方式去補(bǔ)償滲透壓調(diào)節(jié), 這可能是2種魚在小瓜蟲刺激后黏液分泌量呈明顯差異的主要原因。

在相同感染階段, 青海湖裸鯉感染程度與組織損傷程度明顯比黃河裸裂尻魚重, 死亡也更加急劇,表明青海湖裸鯉對(duì)小瓜蟲的感染更加敏感。有研究認(rèn)為多子小瓜蟲受宿主黏液成分誘導(dǎo)接近宿主,并通過黏液細(xì)胞開口進(jìn)入宿主皮下, 且主要感染部位位于宿主黏液細(xì)胞富集區(qū)域[34,35], 因此宿主皮膚黏液細(xì)胞數(shù)、黏液分泌量可能與小瓜蟲寄生數(shù)量呈正相關(guān)。此外, 本研究中觀察到多子小瓜蟲能在青海湖裸鯉皮膚表面形成的膠狀黏液層中發(fā)育為包囊。綜合以上, 生境差異導(dǎo)致的黏液細(xì)胞數(shù)量不同可能是青海湖裸鯉感染小瓜蟲明顯多于黃河裸裂尻魚的重要原因。另外, 青海湖屬于內(nèi)陸咸水湖,水體理化性質(zhì)限制了病原體的生存[36], 青海湖裸鯉免疫系統(tǒng)所受的病原體選擇壓力較小, 在進(jìn)化過程中可能沒有形成較完善的抵抗寄生蟲策略, 青海湖裸鯉在人工淡水養(yǎng)殖環(huán)境下極易感染多種寄生蟲的特性驗(yàn)證了這一推測(cè)[14]。

另一顯著差異是感染小瓜蟲的黃河裸裂尻魚極易發(fā)生繼發(fā)性感染, 因蛀鰭和皮膚潰爛而死亡。對(duì)感染小瓜蟲的黃河裸裂尻魚皮膚進(jìn)行的組織病理學(xué)檢查顯示, 黃河裸裂尻魚表皮細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重空泡化病理改變, 這種病理改變破壞了魚體第一道防線的完整性, 極易引起細(xì)菌等病原體感染, 這一發(fā)現(xiàn)為黃河裸裂尻魚在小瓜蟲感染后易發(fā)生繼發(fā)性感染提供了合理的解釋。青海湖裸鯉皮膚雖然同樣遭受嚴(yán)重?fù)p傷但在感染過程中并沒有觀察到繼發(fā)性感染的發(fā)生, 這可能與青海湖裸鯉在小瓜蟲感染后形成膠狀黏液層有關(guān)。魚類分泌的黏液中有多種抗菌肽和蛋白, 能有效抵抗細(xì)菌感染, 在魚類適應(yīng)不同水體環(huán)境中發(fā)揮重要作用[37]。青海湖裸鯉在受小瓜蟲感染后會(huì)分泌大量黏液形成膠狀黏液層, 黏液層及其所含的抗菌物質(zhì)能有效抑制細(xì)菌到達(dá)損傷部位, 從而避免繼發(fā)感染。但在黃河裸裂尻魚感染過程中并未觀察到黏液明顯增加, 這使損傷的皮膚暴露于具有各種微生物的水體中, 極易引發(fā)繼發(fā)感染, 因此黏液分泌量少與黃河裸裂尻魚易發(fā)生繼發(fā)性感染密切相關(guān)。

本文通過常規(guī)的病理學(xué)方法結(jié)合掃描電子顯微鏡對(duì)感染多子小瓜蟲的青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚進(jìn)行了詳細(xì)的病理學(xué)研究。研究表明, 多子小瓜蟲對(duì)兩種魚的損傷部位相同, 對(duì)腮和皮膚均造成了嚴(yán)重?fù)p傷, 但2種魚的感染程度、感染后癥狀及組織損傷類型表現(xiàn)出明顯的差異。這些差異可能與青海湖裸鯉和黃河裸裂尻魚長期適應(yīng)咸水和淡水生境密切相關(guān)。研究結(jié)果為青海湖裸鯉、黃河裸裂尻魚及其他裂腹魚類中小瓜蟲病的防治提供了理論依據(jù)。