蝦干中AFB₁毒素LC-MS/MS檢測(cè)方法的建立

王小博 鄭琳 鄭培君

摘 要：通過對(duì)前處理方法及色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化建立了蝦干中AFB1的LC-MS檢測(cè)方法。選用甲醇-水（含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨）為流動(dòng)相，ESI+掃描模式，乙腈/水（84/16）為提取溶液，提取時(shí)間60 min，提取溫度25 ℃，正己烷脫脂凈化。該條件下建立的蝦干中AFB1毒素檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。

關(guān)鍵詞：AFB1;毒素;蝦干;LC-MS/MS

Abstract：The LC-MS method for the determination of AFB1 in dried shrimp was established by optimizing the pretreatment method and the conditions of chromatography and mass spectrometry. Methanol-water （5 mmol·L-1 ammonium acetate containing 0.1% formic acid） was selected as mobile phase， ESI+ scanning mode， acetonitrile/water （84/16） as extraction solution， extraction time was 60 min， extraction temperature was 25 ℃， n-hexane degreasing and purification. Under this condition， the determination method of AFB1 toxin in dried shrimp is rapid， accurate and sensitive.

Key words：AFB1; Mycotoxin; Dried shrimp; LC-MS/MS

中圖分類號(hào)：O657.63

黃曲霉毒素是黃曲霉菌、寄生曲霉菌等產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的次生代謝物。在天然食物中黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）最易產(chǎn)生、存在最多、毒性最強(qiáng)，具有高致癌性[1]，已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為Ⅰ類致癌物[2]。AFB1在自然環(huán)境中廣泛存在，其造成的農(nóng)作物、動(dòng)物飼料污染和病害時(shí)有發(fā)生[3]。魚、蝦等水產(chǎn)品攝食被AFB1污染的飼料后，可在體內(nèi)蓄積，同時(shí)水產(chǎn)品在加工制作、儲(chǔ)存過程中不易被消減，誤食被AFB1污染的水產(chǎn)制品會(huì)對(duì)人類的健康構(gòu)成巨大威脅。因此，為了保障水產(chǎn)品及消費(fèi)者安全，應(yīng)建立快速高效的水產(chǎn)制品中AFB1的檢測(cè)方法，從而加強(qiáng)對(duì)水產(chǎn)制品的監(jiān)測(cè)。然而，現(xiàn)有的針對(duì)水產(chǎn)制品中AFB1毒素的檢測(cè)方法還較為缺乏。LC-MS/MS檢測(cè)法靈敏性極高、檢測(cè)限極低，準(zhǔn)確性好，非常適合AFB1的痕量分析，近年來受到了大家的廣泛歡迎[4]。本研究以蝦干為研究對(duì)象，通過對(duì)色譜條件、質(zhì)譜條件、毒素提取方法的優(yōu)化，建立水產(chǎn)制品中AFB1毒素LC-MS/MS檢測(cè)方法，從而為水產(chǎn)品中AFB1的檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

蝦干購(gòu)自佛山市市場(chǎng);AFB1標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%），Enzo，USA;甲醇（色譜純，≥99.9%）、乙腈（色譜純，≥99.9%）、乙酸銨、甲酸及乙酸乙酯，天津光復(fù)試劑有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TSQ Quantum Access液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Thermo Scientific公司;渦旋震蕩儀，美國(guó)Scientific Industries;離心機(jī)，艾本德;氮吹儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司;電子天平，上海英恒。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

從濃度為10 μg·mL-1的AFB1母液中取1 mL于10 mL容量瓶中，用乙腈定容，獲得濃度為1 μg·mL-1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。吸取適量AFB1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用純甲醇配成500 ng·mL-1的毒素標(biāo)準(zhǔn)液，然后根據(jù)需要用30%的甲醇溶液配制所需濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液。

1.3.2 色譜條件的建立

色譜柱：Hypersil Gold（100 mm × 2.1 mm，5 μL）;

流動(dòng)相：甲醇-5 mmol·L-1乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）。進(jìn)樣體積：10.0 μL;進(jìn)樣速率：10.0 μL·s-1;采用梯度洗脫，梯度洗脫條件見表1。進(jìn)樣速率：250.0 μL·min-1。流動(dòng)相：A甲醇，B 5 mmol·L-1的乙酸銨溶液+0.1%的甲酸溶液。

1.3.3 質(zhì)譜條件的建立

對(duì)目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，最終選取二級(jí)質(zhì)譜中響應(yīng)較高的子離子進(jìn)行SRM的質(zhì)譜條件優(yōu)化。

1.3.4 樣品處理

蝦干剪碎后取2.00 g，置于50 mL離心管中，加入15 mL的乙腈/水（84/16）勻漿，渦旋振蕩10 min

（2 000 r·min-1），超聲萃取10 min，離心5 min

（7 500 r·min-1）后準(zhǔn)確移取上清液，重復(fù)3次，合并上清液[4];60 ℃下N2吹干，用1 mL30%的甲醇溶液（含5 mmol·L-1 CH3COONH4溶液∶0.1%甲酸=3∶7;V∶V）溶解，加入5 mL正己烷7 000 r·min-1離心

5 min進(jìn)行脫脂，用一次性注射器取下層液過0.22 μm濾膜于進(jìn)樣小瓶中。

1.3.5 方法學(xué)驗(yàn)證

（1）線性?？瞻讟悠分屑尤階FB1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，AFB1的濃度范圍為0.5～100 ng·g-1。

（2）準(zhǔn)確度和精密度。準(zhǔn)確度用AFB1的提取

回收率表示，精密度用AFB1回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的百分?jǐn)?shù)表示（SD）?？瞻讟悠分蟹謩e加入50、100、

200 ng·mL-1 AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.4的方法處理后，上機(jī)檢測(cè)，重復(fù)5次。

（3）LOD與LOQ。最低檢出限（LOD）由3倍信噪比（S/N=3/1）得出，最低定量限（LOQ）由10倍信噪比得出（S/N=10/1）。

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的選擇

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了Hypersil Gold-C18柱和Agilent TC-C18柱對(duì)AFB1的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Hypersil Gold-C18柱對(duì)AFB1的分離效果好于Agilent TC-C18柱，因此選擇Hypersil Gold-C18色譜柱。影響LC-MS/MS檢測(cè)方法靈敏度的因素除了目標(biāo)物自身的性質(zhì)外，還有流動(dòng)相的組成。本研究比較了甲醇-水、乙腈-水的分離效果和離子化效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲醇與乙腈都能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的分離。在流動(dòng)相中加入適量的乙酸銨和甲酸能夠提高目標(biāo)物的離子化效率，同時(shí)可以有效改善峰形[5]。在流動(dòng)相中加入含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨、0.1%乙酸的5 mmol· L-1乙酸銨，結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入含0.1%甲酸的5 mmol·L-1的乙酸銨，可以明顯增加AFB1的響應(yīng)值。因此，最終確定流動(dòng)相為甲醇-水（含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨）。

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

在正離子（ESI+）模式下對(duì)AFB1進(jìn)行全掃描分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFB1在ESI+模式下生成[M+H]+離子團(tuán)，因此本實(shí)驗(yàn)采用ESI+監(jiān)測(cè)模式（表2）。AFB1的MRM圖如圖1。

2.3 提取條件的優(yōu)化

2.3.1 提取時(shí)間的優(yōu)化

在25 ℃下，加標(biāo)量為20 μg·kg-1，選用乙腈/水（84/16）做為提取溶劑，改變提取時(shí)間（20、40、60、80 min及100 min），檢測(cè)計(jì)算毒素的回收率。由圖2可知，隨著提取時(shí)間的增加，當(dāng)提取時(shí)間為60 min時(shí)，AFB1毒素的回收率最高。因此，提取時(shí)間選為60 min時(shí)。

2.3.2 提取溫度的優(yōu)化

選用乙腈/水（84/16）為提取溶劑，提取時(shí)間選為60 min，加標(biāo)量為20 μg·kg-1，改變提取溫度（5、15、25、35 ℃及45 ℃），檢測(cè)計(jì)算毒素的回收率。由圖3可知，當(dāng)提取溫度為25 ℃時(shí)，AFB1的回收率達(dá)到最高。因此，提取溫度選取25 ℃。

2.3.3 提取溶劑比例的優(yōu)化

提取時(shí)間為60 min，提取溫度為25 ℃，加標(biāo)量為20 μg·kg-1，選用乙腈-水為提取溶劑，改變?nèi)軇┍壤?6/24，80/20，84/16，88/12及92/8），檢測(cè)并計(jì)算毒素的回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著乙腈比例的增加，AFB1毒素的回收率先上升后下降;當(dāng)乙腈/水為84/16時(shí)，AFB1的回收率明顯提高（圖4）。因此，溶劑比例選為84/16。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性和檢測(cè)下限

吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入空白樣品中，使空白樣品加標(biāo)量為0、0.5、1、10、50 ng·g-1及100 ng·g-1，參照1.3.4方法進(jìn)行前處理后上機(jī)測(cè)定。以AFB1濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，線性相關(guān)系數(shù)R2為0.999 86，線性范圍良好，蝦干中AFB1的LOD值為0.1 μg·kg-1，LOQ值為0.5 μg·kg-1。

2.4.2 回收率和精密度

在空白樣品中分別添加濃度為1、50、100 μg·kg-1的AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液。平行測(cè)定5次，計(jì)算各毒素的回收率和精密度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AFB1的回收率在84.36%～103.27%。

AFB1的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.46%～8.03%。表明本方法用于蝦干中AFB1的提取具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，符合實(shí)驗(yàn)需求。

3 結(jié)論

通過對(duì)前處理方法及色譜、質(zhì)譜條件的優(yōu)化建立了蝦干中AFB1的LC-MS檢測(cè)方法。選用甲醇-水（含0.1%甲酸的5 mmol·L-1乙酸銨）為流動(dòng)相，ESI+掃描模式，乙腈/水（84/16）為提取溶液，提取時(shí)間60 min，提取溫度25 ℃，正己烷脫脂凈化。該條件下建立的蝦干中AFB1毒素檢測(cè)方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高。

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