原花青素對反式脂肪酸致小鼠肝臟損傷的修復(fù)作用

王友良 甘功友 張冬初 劉艷華 何衛(wèi)國 陳靜

摘 要：目的：探討原花青素（Proanthocyanidins， PC）對反式脂肪酸（trans fatty acids， TFAs）染毒小鼠肝臟損傷的修復(fù)及其可能機(jī)制。方法：將50只成年昆明（KM）小鼠（雌雄各半）隨機(jī)分為5組，正常對照組、TFA組（100 mg·kg-1劑量的TFA）、TFA+低、中、高劑量PC組（100 mg·kg-1劑量的TFA+50、100、150 mg·kg-1劑量的PC），隔天灌胃生理鹽水和反式脂肪酸，總共灌胃60天，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，檢測小鼠丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）水平和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）含量，并對肝臟組織進(jìn)行病理檢測。結(jié)果：與對照組比較，TFA染毒組小鼠體重、肝臟臟器系數(shù)、ALT、AST及MDA含量增加（P<0.05）;SOD、GSH-Px活性降低（P<0.05）;肝臟組織結(jié)構(gòu)中肝小葉出現(xiàn)紊亂，肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的壞死;與TFA染毒組相比，TFA+低、中、高PC組小鼠體重、肝臟臟器系數(shù)、ALT、AST及MDA含量降低（P<0.05）;SOD、GSH-Px活性提高（P<0.05）;且肝臟的損傷程度得到了明顯改善。結(jié)論：PC對TFA染毒小鼠的肝臟損傷具有保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)表明其機(jī)制可能與原花青素具有抑制細(xì)胞損傷和清除氧自由基的作用有關(guān)。

關(guān)鍵詞：原花青素;反式脂肪酸;肝臟損傷;抗氧化

Abstract：Objective： To investigate the effect of proantho cyanidins （PC） on liver injury induced by trans fatty acids （TFA） in mice and its possible mechanism. Methods Fifty adult KM mice （half male and half female） were randomly divided into 5 groups： Normal control group， TFA group （100 mg·kg-1 TFA）， TFA + low， medium and high doses PC group （100 mg·kg-1 TFA + 50， 100， 150 mg·kg-1 PC） were perfused with normal saline and trans fatty acids every other day for

60 days. After the experiment， the levels of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST） and superoxide dismutase （SOD） were detected. Results Compared with the control group， the body weight， liver viscera coefficient， ALT， AST and MDA contents in TFA-exposed mice increased （P<0.05）. The activities of SOD and GSH-Px were decreased （P<0.05）. The hepatic lobules appeared disorder in the liver tissue structure， and the hepatocytes appeared necrosis in varying degrees. Compared with TFA exposure group， the body weight， liver organ coefficient， ALT， AST and MDA contents in TFA + low， medium and high PC groups were decreased （P<0.05）. The activities of SOD and GSH-Px increased （P<0.05）. And the degree of liver injury was significantly improved. Conclusion： PC has protective effect on liver injury induced by TFA in mice. The mechanism may be related to the inhibition of cell injury and scavenging of oxygen free radicals by procyanidins.

Key words：Proanthocyanidins; Trans fatty acid; Liver injury; Anti-oxidative

中圖分類號：R285.5

原花青素（proantho cyanidins，PC）是廣泛存在于山楂、葡萄籽、玉米、藍(lán)莓、桑葚和松樹皮等植物中的一大類多酚化合物的總稱，目前國際上公認(rèn)其為清除機(jī)體自由基最有效的天然抗氧化劑[1]。諸多研究表明，原花青素具有多種生物活性，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、糾正胰島素抵抗、保護(hù)心血管功能等作用[2-4]，

目前研究發(fā)現(xiàn)，原花青素可拮抗反式脂肪酸所致的小鼠肝臟毒性，但關(guān)于PC修復(fù)反式脂肪酸肝臟毒性的研究未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以小鼠為研究對象，對小鼠給予原花青素干預(yù)，然后進(jìn)行TAF染毒，探討PC的預(yù)防修復(fù)作用。

反式脂肪酸（Trans fatty acids，TFA）是一類含有反式構(gòu)型非共軛雙鍵的不飽和脂肪酸的總稱[5]。研究表明，在一些油炸食品、人造奶油、面包、蛋糕、餅干、炸薯?xiàng)l、炸薯片奶油和黃油等食品中含有大量的TFA[6-7]。

然而，在光、熱及催化劑的作用下，在食物油脂的氫化過程中，順式脂肪酸可以轉(zhuǎn)變?yōu)門FA[8]。TFA能夠增加食品的松脆口感、且具有易于長期保存的特點(diǎn)，從而被廣泛應(yīng)用于各類包裝食品和煎炸食品中。研究證實(shí)，長期食用含有TFA的食物會導(dǎo)致肝組織損傷及肝細(xì)胞變性和壞死[9]。最新研究表明，TFA可導(dǎo)致肝臟脂肪堆積、肝細(xì)胞變性、引發(fā)非酒精性脂肪肝[10]。

本實(shí)驗(yàn)觀察了反式脂肪酸對小鼠肝臟損傷的影響，并探討了原花青素對TFA導(dǎo)致的肝臟損傷保護(hù)作用機(jī)制，為預(yù)防生活中食品中TFA所致肝臟損傷提供有效的實(shí)驗(yàn)線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組

試驗(yàn)對象為購自南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物室的昆明（KM）種健康成年小鼠（雌雄各半）50只，體重為25～30 g，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：（SCXK[湘]2016-0009）。試驗(yàn)期間，動物在實(shí)驗(yàn)房中飼養(yǎng)，房間溫度為26 ℃左右，相對濕度為55%～70%，24 h光照明暗交替，實(shí)驗(yàn)動物自由飲水和進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組：正常對照組、TFA組（100 mg·kg-1劑量的TFA）、TFA+低、中、高劑量PC組（100 mg·kg-1劑量的TFA+50、100、150 mg·kg-1劑量的PC）。

1.2 儀器與試劑

原花青素（純度>95%，江蘇江萊生物科技有限公司）;反式脂肪酸（純度>95%，上海惠城生物科技有限公司;超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性及丙二醛（MDA）試劑盒均購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司;CK-40光學(xué)顯微鏡（日本OLYMPUS公司）;7170 A自動生化分析儀（日本OLYMPUS公司）;FB124精密電子分析天平（上海力辰儀器科技有限公司）;TDL-60B低速臺式離心機(jī)（上海重逢科學(xué)儀器有限公司）;5810型低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

給予灌胃方式進(jìn)行染毒，上午灌胃TFA，下午給予PC，連續(xù)灌胃90 d，期間密切觀察小鼠的生長發(fā)育情況。試驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠稱重，并處死小鼠，取小鼠血液，摘除小鼠肝臟，用電子分析天平準(zhǔn)確稱取肝臟重量，計(jì)算其臟器系數(shù)。小鼠肝臟用0～4 ℃的生理鹽水漂洗，用濾紙拭干，稱重后用小燒杯將其裝好。將肝臟組織勻漿并離心，取上清液保存以備檢測。用生化分析儀檢測小鼠肝臟組織勻漿的蛋白含量、谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、MDA、SOD及GSH-Px等的含量，相關(guān)具體操作步驟都要嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析

結(jié)果數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以

P<0.05為差異有顯著性，均進(jìn)行合并分析。應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，多組間比較采用多樣本均數(shù)方差分析，各處理組與對照組間的比較采用卡方檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PC對TFA染毒小鼠體重及肝臟臟器系數(shù)的影響

結(jié)果如表1所示，各組小鼠初體重相差不大，差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;TFA染毒組及低劑量PC保護(hù)組小鼠的終體重增長高于對照組（P<0.05）;

給予不同劑量PC后的TFA染毒組的小鼠體重增長量均低于TFA染毒組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

TFA染毒組及低、中劑量PC保護(hù)組小鼠的肝臟臟器系數(shù)均顯著高于對照組（P<0.05）;經(jīng)低、中、高劑量PC保護(hù)的各組小鼠的肝臟臟器系數(shù)低于TFA染毒組（P<0.05）。

2.2 PC對TFA染毒小鼠小鼠肝臟組織的形態(tài)學(xué)改變

由圖可見，對照組小鼠肝組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，肝中央靜脈、肝索結(jié)構(gòu)清晰可見，未見肝細(xì)胞變性、壞死等病理改變（見圖1a）。TFA染毒組鏡下可見肝細(xì)胞彌漫性大片溶解壞死，肝索離散，靜脈擴(kuò)張，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞核的改變?yōu)榭梢姾斯炭s、核碎裂、核溶解，并可見壞死碎片（見圖1b）。TFA染毒+低劑量PC保護(hù)組可見肝細(xì)胞變性、胞漿疏松化和氣球樣變性（見圖1c）。TFA染毒+中劑量PC保護(hù)組可見肝竇擴(kuò)張，且可見肝小葉輪廓，少量肝細(xì)胞體積增大，伴少量肝細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞浸潤（見圖1d）。TFA染毒+高劑量PC保護(hù)組肝細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)大致正常，肝細(xì)胞水腫和脂肪變性都有所減輕，壞死組織減少（見圖1e）。

2.3 PC對TFA染毒小鼠血清肝臟功能指標(biāo)變化的影響

與模型對照組相比，TFA染毒組及低、中、高劑量PC保護(hù)組小鼠的血清ALT、AST含量均有所增加

（P<0.05）;表明長期給予TFA可在一定程度上導(dǎo)致小鼠肝功能損傷。與TFA染毒組相比，各劑量PC保護(hù)組小鼠血清中ALT、AST的活性均有不同程度的降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.4 肝臟組織氧化損傷變化

SOD和MDA含量的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P<0.05）。與對照組相比，TFA染毒組及低、中劑量PC保護(hù)組小鼠肝臟組織勻漿中GSH-Px和SOD含量下降，MDA含量升高（P<0.05），各劑量PC保護(hù)組的小鼠肝臟組織勻漿中GSH-Px和SOD含量升高，MDA含量降低（P<0.05），見表3。

3 討論

肝臟是機(jī)體重要的解毒器官，當(dāng)有害物質(zhì)超過肝臟所能承受的量時(shí)，肝臟便不能有效清除這些有毒物質(zhì)，致使肝功能受損進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生相關(guān)疾病[11]。

臟器系數(shù)的變化可反映受試物對肝臟器的毒性情況，也是尋找毒物靶器官的重要線索[12]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TFA組體重明顯增長，說明TFA染毒可導(dǎo)致肥胖;而臟器系數(shù)高于對照組（P<0.05），說明TFA染毒可對肝臟產(chǎn)生影響，而給予PC保護(hù)后，肝臟臟器系數(shù)有改變，說明PC有一定的干預(yù)作用。肝組織病理改變可見肝細(xì)胞彌漫性大片溶解壞死，肝索離散，靜脈擴(kuò)張，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞核改變，并可見碎片壞死，證明小鼠反式脂肪酸肝損傷模型造模成功。而經(jīng)低、中、高PC保護(hù)的3組中隨PC劑量的增加，體重增長減慢，肝臟臟器系數(shù)變小，小鼠肝臟病理組織結(jié)構(gòu)形態(tài)有一定改善，說明PC可修復(fù)TFA引起的肝臟損傷。ALT、AST是機(jī)體肝臟中廣泛存在的重要氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，也是指示肝功能的重要指標(biāo)[13-14]。ALT、AST這兩種酶在正常情況下存在肝細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)，通過質(zhì)膜漏出胞外，因而這兩種酶在血液中的活性變化可準(zhǔn)確、敏感地反映肝臟的功能[15]。ALT與AST升高表明肝臟細(xì)胞已氧化受損[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，反式脂肪酸明顯損傷了肝臟的功能，從而導(dǎo)致小鼠肝臟中ALT與AST活性升高，但給予各劑量的PC保護(hù)后，二者水平明顯降低，說明PC對TFA所致的肝損傷具有一定的保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PC與TFA兩種因素同時(shí)作用于雄性小鼠時(shí)，對小鼠肝臟組織中的AST、ALT含量有拮抗作用，即PC能夠拮抗TFA所致的肝損傷，可能與PC具有良好的抗氧化功能有關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示：與對照組相比，TFA染毒組小鼠肝臟的GSH-Px、SOD活性有明顯下降，MDA含量升高，說明TFA對小鼠體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)的平衡起破壞作用，減弱機(jī)體的抗氧化損傷能力，從而增強(qiáng)脂質(zhì)的過氧化作用，對肝細(xì)胞造成不同程度的損害。而不同劑量的PC保護(hù)組的肝臟SOD、GSH-Px活性均有增高，MDA含量均下降，表明PC具有很強(qiáng)的抗氧化活性和清除自由基的功能，是一種良好的脂質(zhì)過氧化抑制劑和氧自由基清除劑[17，18]，可以減弱反式脂肪酸對機(jī)體的損傷。綜上所述，原花青素具有修復(fù)肝臟細(xì)胞和保護(hù)肝功能的作用，其相關(guān)機(jī)制可能與原花青素具有抗脂質(zhì)過氧化和清除氧自由基的作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用原花青素修復(fù)反式脂肪酸所致的肝損傷，為后續(xù)研究原花青素對過氧化所致的肝損傷的修復(fù)機(jī)制提供新的思路。

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