梁 丹，張朝昕，王 冕*，吳正鋒，陳 娜，潘麗娟，王 通，陳明娜，楊 珍，禹山林，遲曉元*

(1. 山東省花生研究所，山東 青島 266100； 2.青島市市容環(huán)境衛(wèi)生管理中心，山東 青島 266100)

花生(ArachishypogaeaL.)，是世界范圍內(nèi)廣泛種植的油料和經(jīng)濟作物。我國是世界花生生產(chǎn)和消費大國，花生總產(chǎn)量和出口量均占世界第一[1]。花生適宜種植在疏松的沙土地上，適應(yīng)性較強。但是因其地下結(jié)果的特性，容易受到土傳病害的影響。已報道的花生土壤侵染性病害有多種，包括真菌性病害、細菌性病害和線蟲病害等，其中由真菌病害感染導(dǎo)致的果腐病給花生生產(chǎn)帶來極大危害，其一旦發(fā)病就造成作物成片死亡，莢果腐爛，防治艱難，給花生產(chǎn)量和品質(zhì)帶來極大威脅[2]。

研究證明植物在長期與病原物互作的進化過程中，獲得了應(yīng)答病原物侵染的感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，并通過協(xié)同進化，逐漸建立了一整套防御機制來抵抗病原物的侵入，最終獲得了植物的抗病性[3]。該過程中涉及到植物對病原的信號識別、傳遞、抗病基因的激活以及表達等[4]。

植物與病原物的信號傳遞與植物激素及信號分子密切相關(guān)。植物激素以一類低濃度存在的小信號分子參與到植物生物脅迫的信號傳遞過程[5-6]。如ABA與植物的抗旱、耐鹽等非生物脅迫密切相關(guān)[7]；水楊酸(SA)介導(dǎo)植物對病原菌的免疫翻譯，是植物系統(tǒng)獲得性抗性過程的關(guān)鍵激素；茉莉酸(JA)需要和乙烯(ET)信號途徑的共同參與，主要調(diào)節(jié)植物對腐生菌的抗性等[8-9]；赤霉素(GA)參與植物生長和發(fā)育，是一類重要的抗逆相關(guān)激素[10]；H2O2作為重要的信號分子參與植物的氧化脅迫反應(yīng)[11]。

研究發(fā)現(xiàn)，植物的抗病基因具有同源序列和保守的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)在外源信號識別和信號傳導(dǎo)中起重要作用，其中序列高度保守的蛋白激酶通過蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化方式參與植物細胞信號傳導(dǎo)過程[12]。蛋白激酶根據(jù)其磷酸化底物蛋白的不同氨基酸殘基類型可分為5大類，其中研究較多的是促絲裂原活化蛋白激酶家族(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)。MAPKs存在高度保守的T-X-Y基序，是一類保守的Ser/Thr/Tyr雙重特異性蛋白激酶[13]。植物MAPK分為四個家族(A-D)，其中以擬南芥中的MAPKs為例，AtMAPK3、AtMAPK6、AtMAPK10屬于A組，含有TEY保守基序；AtMAPK4、AtMAPK5和AtMAPK11-13屬于B組，含有TEY保守基序；AtMAPK1-2、AtMAPK7和AtMAPK14屬于C組含有TEY保守基序；AtMAPK8-9和AtMAPK15-20屬于D組含有TDY保守基序，不同結(jié)構(gòu)決定MAPKs參與不同的生物學(xué)過程[14]。

許多研究表明，MAPK參與各種植物激素(ABA、JA、ET、SA等)、低溫、高鹽、干旱、UV等非生物脅迫信號的傳遞、病原體信號的傳導(dǎo)、植株的生長和發(fā)育等生物學(xué)過程[15]。其中擬南芥MAPK13基因在其各組織中的表達量都很低；黃瓜中MAPK13基因在受到病原物侵染時表達量下降，在熱誘導(dǎo)時表達量上升[16]；棉花中MAPK13基因被證明參與病原菌的信號傳遞過程[17]。

目前關(guān)于MAPK的研究依舊是逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方向的熱點，MAPK級聯(lián)途徑在不同的植物、動物和微生物中的功能不斷得以明確。但是花生中抗性相關(guān)的基因克隆與功能研究還處于起步階段，有關(guān)MAPK級聯(lián)途徑的研究報道更少，僅有少數(shù)的MAPK基因被克隆出來，尤其關(guān)于花生MAPK13基因的研究還未見報道。

前期本課題組，參考花生的兩個二倍體野生種和四倍體栽培種的基因組序列信息，對果腐病花生籽仁的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行分析，從花生抗病相關(guān)途徑中篩選出關(guān)鍵基因MAPK13。對該基因進行全長克隆和序列分析發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列上存在MAPK家族典型TEY的結(jié)構(gòu)域；并進行了亞細胞定位；利用RT-qPCR檢測其在不同花生組織的表達量，及其在各種非生物脅迫(ABA、GA、SA、JA、ET、H2O2、高鹽、干旱、低溫)誘導(dǎo)下的表達量。本研究將為闡明花生抗病的分子調(diào)控機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

供試品種花育20號，由本課題組育成并保存。花生種子經(jīng)無菌水清洗，浸泡3h后，點播于水培培養(yǎng)箱中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為16h光照/8h黑暗，培養(yǎng)溫度25℃。花生不同組織表達模式分析采用的材料分別為根、莖、葉、花、子葉和下胚軸，其中根、莖和葉取自花生4葉期的幼苗，花取自盛花期的花生植株花瓣，子葉取自成熟期的鮮花生種子，下胚軸取自催芽露白時的花生種子胚。

基因克?。河谒嗯囵B(yǎng)箱中長到4葉期，取葉片提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，為克隆基因的模板。不同植物激素濃度分別為SA(2mmol/L)、ET(100μmol/L)、JA(100μmol/L)、GA(100μmol/L)和ABA(100μmol/L)，取樣時間分別為處理后：0、4、8、12、24、36和72 h；H2O2處理時，取4葉期的幼苗，將濃度為2 mmol/L的溶液2 mL涂抹于葉片上，剩余溶液灌根；鹽脅迫和干旱脅迫處理時，取4葉期的水培幼苗，將根分別浸泡于200 mmol/L NaCl和15% PEG 6000溶液中，取樣時間分別為浸泡后：0、4、8、12、24、36和72 h；ABA處理下以相同濃度乙醇作為對照，其他處理則以清水作為對照?；騺喖毎ㄎ辉囼灢捎玫牟牧蠟楸旧鸁?Nicotianabenthamiana)，種子由青島生工生物工程有限公司提供。將煙草種子播種于土壤中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光周期為16h光照/8h黑暗，培養(yǎng)溫度25℃，待3葉期時取煙草葉片作為試驗材料。

1.2 質(zhì)粒和菌株

大腸桿菌(EscherichiacoliDH5α、TOP-10)，農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens、GV3101)感受態(tài)，為本實驗室保存，pEasy-T購買自Transgen生物科技有限公司，PMD18-T simple、PMD19-T購自寶生物工程(大連)有限公司TaKaRa，載體pCAMBIA-1300(Kana抗性，潮霉素篩選)來自本實驗室保存。

1.3 工具酶及主要實驗試劑

所用分子生物學(xué)試劑和生化試劑等分別購自美國Promega、Sigma、寶生物工程(大連)有限公司TaKaRa、天根、臺灣生工等公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa公司生產(chǎn)，質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司，RNA提取用TRIZOL Kit為Life Technology公司產(chǎn)品，RNeasy Plant Mini Kit為Clontech公司產(chǎn)品，cDNA純化試劑盒Wizard DNA Clean-up System購于Promega公司。其他所用RNase、抗生素和普通化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 DNA生物信息學(xué)分析軟件和網(wǎng)絡(luò)資源及數(shù)據(jù)庫

DNAMAN軟件進行序列分析、比對與同源性比較；MEGA 4.0軟件用于構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；GraphPad Prism軟件用于數(shù)據(jù)分析作柱狀圖。

1.5 RNA提取和cDNA合成

按照RNeasy Mini Kit試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)操作步驟提取花生樣品總RNA，用Pultton P100超微量分光光度計(Plextech，美國)測定提取的RNA濃度后，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)步驟，合成第一鏈cDNA：將2μg RNA加入反應(yīng)體系，至總體系為20μL，PCR擴增條件為42℃延伸1 h，0℃保存15 min。合成后cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 基因全長克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組文庫中已知AhMAPK13基因的編碼區(qū)序列，設(shè)計3′端特異引物k13-3P1和k13-3P2，與B26和B25進行3′ RACE巢式PCR，PCR反應(yīng)體系：引物各1μL，1μL cDNA模板，10μL LATaqTMmix和7μL ddH2O，共計20μL。PCR擴增程序中第一輪擴增：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，25個循環(huán)；72℃延伸10min；15℃保存。第二輪擴增：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min；15℃保存。

設(shè)計5′端特異引物k13-5P1和k13-5P2，與AAP和AUAP進行5′RACE巢式PCR，PCR反應(yīng)體系：引物各1μL，1μL cDNA模板，10μL LATaqTMmix和7μL ddH2O，共計20μL。PCR擴增程序中第一輪擴增：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，25個循環(huán)；72℃延伸10min；15℃保存。第二輪擴增：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min；15℃保存。將克隆片段與pEASY-T1載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂板后篩選陽性克隆，由上海生工生物工程有限公司進行測序。將測序結(jié)果與中間片段進行序列比較，確定所得片段為目的基因的兩端片段。

根據(jù)序列拼接結(jié)果設(shè)計引物，利用RT-PCR從花育20號中擴增目的基因的全長序列。PCR反應(yīng)體系：引物各1μL，1μL cDNA模板，10μL LATaqTMmix和7μL ddH2O，共計20μL。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1.5min，35個循環(huán)；72℃延伸10min；15℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后回收純化。純化產(chǎn)物連接至pEASY-T1載體，送至上海生工生物工程有限公司進行測序。測序結(jié)果進行序列比對，確認翻譯的氨基酸序列無錯誤后，進行序列BLAST并分析序列信息。

1.7 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將克隆的基因序列在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站上利用BLAST工具進行基因序列的相似性及同源性查找，利用DNAMAN軟件的Multiple Alignment對這些序列進行基因同源性的比較，用MEGA 4.0軟件的Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 RT-qPCR基因表達分析

根據(jù)序列設(shè)計熒光定量引物： K13-QF和K13-QR。提取處理好的花生組織材料的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并稀釋到8ng/μL作為模板，利用熒光定量試劑盒(Everbright?Inc.,美國)進行定量PCR檢測基因表達圖譜。反應(yīng)體系：10μL 2SYBR Premix，2μL cDNA模板，200nmol/L引物各0.4μL和7.2μL ddH2O，共計20μL。PCR反應(yīng)用羅氏的熒光定量PCR儀Light Cycler 2.0 instrument system(Roche，Germany)進行，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10s；95℃變性 5s，60℃退火30s和72℃延伸10s，40個循環(huán)；60℃退火30s；72℃延伸10s。PCR反應(yīng)在65℃下繪制溶解曲線，溫度每10s上升0.5℃。由LightCycler軟件自動生成Baseline和quantification cycles(Cq)。每個PCR反應(yīng)均進行三次重復(fù)實驗，每次PCR反應(yīng)均設(shè)定無模板的陰性對照。所用內(nèi)參基因為花生Actin11，本研究中所有使用的引物詳見表1。

1.9 植物表達載體的構(gòu)建

用帶有酶切位點的引物擴增基因序列，PCR產(chǎn)物回收后與pMD18-T simple載體進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進行測序驗證。序列正確的菌株進行擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用BamHI/XbaI雙酶切質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒，將酶切產(chǎn)物與pCAMBIA-1300空載體用T4連接酶連接在一起，構(gòu)建pCAMBIA-1300-AhMAPK13表達載體，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽性克隆進行測序驗證。驗證陽性的菌株擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌備用。DNA片段與pMD18-simple載體的連接體系：pMD18-simple 1μL，DNA回收片段4μL(-50ng)，SolutionI(TaKaRa，日本)5μL，共10μL，反應(yīng)混和液于16℃下連接過夜(約12～16h)。PMD18-T simple和pCAMBIA-1300載體的酶切反應(yīng)體系：質(zhì)粒10μL，Buffer 5μL，XbaI 1μL，HamHI 1μL，ddH2O 34μL，共計50μL。將反應(yīng)混和液于37℃溫育6h。取1μL酶切反應(yīng)液，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果，并估測載體和DNA片段的大小，該酶切反應(yīng)液可直接用作連接。

1.10 煙草葉片瞬時表達及亞細胞定位分析

將準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌擴大培養(yǎng)至100mL，在培養(yǎng)基中加入150μmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)，按照1:100轉(zhuǎn)接，于28℃培養(yǎng)16h。收集菌體，用Infiltration Buffer(MS，10mmol/L MES medium，pH5.6，150μmol/L AS)重懸農(nóng)桿菌至OD600=0.5～0.6。取培養(yǎng)好的3葉期煙草葉片，用一次性注射器將農(nóng)桿菌菌液注射到煙草葉片背面，于陰暗處放置約2～5 d后進行觀察。于注射部位周圍取約1cm2的材料，于Olympus FV300激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)下觀察，使用Olympus DP26數(shù)碼相機(Olympus，日本)拍照。

表1 AhMAPK13基因克隆引物

2 結(jié)果與分析

2.1 AhMAPK13基因的克隆

本研究基因篩選來自轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，所有序列保存成FASTA格式(GeneBank Accession No. PRJNA302339)。根據(jù)KEGG富集通路中的結(jié)果，篩選出MAPK途徑進行克隆，為花生抗果腐病研究提供基因基礎(chǔ)。根據(jù)已知序列設(shè)計引物(K13-F和K14-R)進行編碼區(qū)克隆。利用RACE-PCR擴增出3′端DNA片段約600 bp和5′端DNA片段約150 bp(圖1)。兩端片段與編碼區(qū)片段進行序列比較表明所得片段為目的基因的兩端片段。根據(jù)所獲得的中間片段、5′片段和3′片段拼接出AhMAPK13基因的全長cDNA序列，PCR擴增得到2000 bp左右的片段。同時得到編碼區(qū)全長1000 bp片段。序列分析結(jié)果表明，該PCR片段為目的基因片段(圖2)。

圖1花生MAPK133′和5′片段的PCR擴增

Fig.1 Isolationof3′and5′fragmentofgeneAhMAPK13inpEasy-T

圖2花生AhMAPK13全長和ORF全長的PCR擴增

Fig.2 IsolationofgenefulllengthandfullORF fragmentofgeneAhMAPK13inpEasy-T

注：QC：基因全長；M:Marker;ORF:基因編碼區(qū)。

Note:QC:thefulllengthofgene;M:Marker;ORF:theORFsequenceofgene.

圖3 AhMAPK13與其他物種中MAPK13蛋白質(zhì)序列的同源比較Fig.3 Alignment of the deduced AhMAPK13 protein sequence with other known plant MAPK13s注：大豆(GmMAPK13：XP_003538034.1)，柑橘(CcMAPK13：XP_006424692.1)，梨(PbMAPK13：XP_009358274.1)，擬南芥(AtMAPK13：NP_001030990.1)，花生(AhMAPK13：KP329552)，野生花生(AiMAPK13：XP_016187360.1)。用DNAman軟件進行序列比對，相同的氨基酸序列用黑色部分表示。I～XI表示MAPK的11個保守的催化結(jié)構(gòu)域。A-Loop用下劃線標(biāo)出。

Note:Glycinemax(GmMAPK13:XP_003538034.1);Citrusclementina(CcMAPK13:XP_006424692.1);Pyrusxbretschneideri(PbMAPK13:XP_009358274.1);Arabidopsisthaliana(AtMAPK13:NP_001030990.1);Arachishypogaea(AhMAPK13:KP329552);Arachisipaensis(AiMAPK13:XP_016187360.1).ThesesequenceswerealignedusingtheDNAmanprogram.Identicalandsimilaraminoacidswereshadedinblack.Theportionkinasesubdomainsareshownwithnumerals(ItoXI)onthebottomofthesequences.Activation-loopwasunderlined.

2.2 AhMAPK13基因編碼的蛋白序列分析

對獲得全長序列進行分析表明，序列全長1818 bp，含有3′非編碼區(qū)593 bp，5′非編碼區(qū)122 bp，編碼區(qū)全長1104 bp，編碼一條含有368個氨基酸的蛋白序列。預(yù)測其分子量為42.5kDa。氨基酸的序列比對發(fā)現(xiàn)其序列中含有MAPK家族典型的特異性11個保守區(qū)域，和特異性的N端T-Loop保守基序和TEY基序，與B組的MAPK13同源性較高，達到80%以上，認為AhMAPK13屬于B組，因此將基因命名為AhMAPK13，并且序列提交到GenBank，獲得序列號：KP329552。利用DNAman軟件，對不同來源的MAPK13蛋白進行同源性分析，結(jié)果顯示AhMAPK13與已知的野生種花生AiMAPK13、擬南芥中的AtMAPK13、大豆中的GmMAPK13、梨中的PbMAPK13和柑橘中的CcMAPK13的同源性較高，分別為100%、91.42%、88.47%、84.82%和81.13%(圖3)。利用MEGA軟件對來自于不同植物的MAPK13蛋白進行分子聚類分析，構(gòu)建同源進化樹(圖4)。結(jié)果顯示，栽培種花生MAPK13基因與野生花生、大豆中的MAPK13基因的親緣關(guān)系最近，同時與擬南芥、柑橘等植物中的親緣關(guān)系也較近，說明該基因在同源進化上具有高度的保守性。

2.3 AhMAPK13蛋白亞細胞定位

觀察GFP基因的定位結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)入空載體的GFP在細胞的核和質(zhì)中均有定位，且AhMAPK13-GFP在細胞核和細胞質(zhì)中均有綠色熒光，表明AhMAPK13基因可能在細胞核和細胞質(zhì)中都發(fā)揮重要功能(圖5)。

圖4 AhMAPK13與其他物種中MAPK13蛋白質(zhì)序列的聚類分析Fig.4 Alignment and dendrogram of the deduced AhMAPK13 protein sequence with other known plants MAPK13s注：At，擬南芥；Gm，大豆；Cc，柑橘；Ai：野生花生；Pb，梨；Cs，亞麻薺；Bn，油菜；Ah：花生。Note: At:Arabidopsis thaliana; Gm:Glycine max; Cc:Citrus clementina; Ai:Arachis ipaensis; Pb: Pyrus x bretschneideri; Cs: Camelina sativa; Bn: Brassica napus; Ah:Arachis hypogaea.

圖5 AhMAPK13-GFP在煙草葉片中的亞細胞定位 Fig.5 Subcellular localization of AhMAPK13-GFP in the leaves of tobacco 注：空載體GFP蛋白的表達為對照。Note: The expression of GFP was used as control.

2.4 AhMAPK13基因的組織特異性分析

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，AhMAPK13基因在莖中表達最高，在根和葉中表達次之，在花、子葉和下胚軸中表達量極低，這說明該基因可能在花生莖、根和葉等組織中發(fā)揮重要的作用(圖6)。

圖6 AhMAPK13基因在花生不同組織中的表達分析Fig.6 The expression analysis of AhMAPK13 in different peanut tissues

2.5 AhMAPK13基因在植物激素和信號分子誘導(dǎo)下的表達分析

圖7-A可知，在ET誘導(dǎo)下，AhMAPK13基因的表達量呈現(xiàn)顯著上調(diào)的表達模式，在處理8h表達量達到最高，上調(diào)倍數(shù)在15倍以上；在JA誘導(dǎo)下，AhMAPK13基因的表達量呈先上調(diào)再下調(diào)的表達模式，在誘導(dǎo)處理4 h時表達量達到最高，上調(diào)倍數(shù)在5倍以上；在SA、GA誘導(dǎo)下，AhMAPK13基因的表達量均呈上調(diào)的表達模式，在誘導(dǎo)處理12 h時表達量均達最高，上調(diào)倍數(shù)分別在5倍和10倍以上；在信號分子H2O2處理下，AhMAPK13基因的表達量表現(xiàn)為下調(diào)的表達模式。這些結(jié)果表明該基因可能參與ET、JA、SA、GA的激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，不參與或者負調(diào)控參與信號分子H2O2的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

2.6 AhMAPK13基因在ABA誘導(dǎo)、低溫、干旱和鹽脅迫下的表達分析

由圖7-B可知，在ABA誘導(dǎo)下，AhMAPK13表現(xiàn)為上調(diào)，且在誘導(dǎo)處理8 h時表達量最低，推測該基因可能參與ABA介導(dǎo)的干旱調(diào)控途徑中，并可能起到負調(diào)控作用。

在PEG模擬干旱脅迫處理下AhMAPK13基因表達量表現(xiàn)為下調(diào)模式，脅迫處理1 h時表達量最低；在NaCl脅迫處理下AhMAPK13基因表達量呈先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢，且在脅迫處理2h時表達量最高。綜上表明，AhMAPK13基因在干旱和鹽脅迫下的表達模式存在差異，且對鹽脅迫更敏感。

圖7 花生AhMAPK13基因表達特異性分析Fig.7 Expression patterns of AhMAPK13

3 討 論

前期本課題進行了花生果腐病轉(zhuǎn)錄組測序，測序結(jié)果上傳GenBank數(shù)據(jù)庫(GeneBank Accession No. PRJNA302339)。從差異表達基因的功能注釋發(fā)現(xiàn)，花生響應(yīng)果腐病過程中，MAPK家族中差異表達的基因有11個，其中MAPK13在棉花、黃瓜抗逆過程中的功能已有報道[16-17]，參與植物與病原物互作，因此本研究推測其可能在響應(yīng)花生果腐病過程中具有重要作用。已有研究表明，在擬南芥中已經(jīng)克隆得到20個MAPK家族基因，它們被證明參與植物生長的各個方面[18]。

目前已經(jīng)從植物中成功分離到了很多MAPK基因，例如：擬南芥、棉花、水稻、楊樹、玉米中分別有20、28、17、21、21個MAPK基因[18-22]。本研究克隆得到的AhMAPK13序列含有MAPK家族特異的11個保守結(jié)構(gòu)，并且與B組的MAPK13同源性較高，達到80%以上，認為AhMAPK13屬于B組。分析其序列發(fā)現(xiàn)，該基因與野生花生序列基本相同，與其他植物的MAPK13序列相似性很高，說明該基因的序列具有高度保守性，因此推測該基因在功能上也與其他植物中MAPK13基因的功能相似。

植物MAPK參與多種信號的傳遞，對MAPK基因的亞細胞定位研究有利于了解其在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用。由于MAPK序列N端的特殊結(jié)構(gòu)，使得MAPK的定位也不同。已有研究表明，MAPK可以定位于細胞核和細胞質(zhì)中，例如：棉花MAPK2基因定位于細胞核[23]。本研究構(gòu)建了AhMAPK13的GFP表達載體，在煙草的瞬時表達過程中發(fā)現(xiàn)，該基因定位在細胞核和細胞質(zhì)中，這表明該基因可能在細胞質(zhì)和細胞核中起作用。

研究表明，植物MAPK作為MAPK級聯(lián)途徑中的下游組分，容易受到多種環(huán)境的刺激，引起植物的自身免疫反應(yīng)來應(yīng)答刺激。本研究結(jié)果表明，花生AhMAPK13基因在莖和根、葉等組織中高表達，而在花、子葉和下胚軸中表達極低，這可能是花生的根和莖在花生發(fā)生果腐病病原菌侵染時更為敏感，當(dāng)土壤中病原菌數(shù)量超標(biāo)，莖和根系最先感知并且傳遞信號。植物應(yīng)答環(huán)境變化過程中內(nèi)源激素水平也發(fā)生變化[7,10,24]。AhMAPK6a在ABA誘導(dǎo)下，表達量上調(diào)；GhMAPK2受JA誘導(dǎo)時，表達量上調(diào)[23]；黃瓜中MAPK13基因在受到病原物侵染時表達量下降，在熱誘導(dǎo)時表達量上升[16]。

本研究中用ABA、NaCl、PEG6000和低溫處理時，該基因的表達量都相應(yīng)上調(diào)，說明該基因在花生響應(yīng)外界脅迫時可能具有重要功能，并且可能參與到ABA介導(dǎo)的非生物脅迫過程。用SA、ET、JA、GA3等激素處理花生幼苗后，AhMAPK13基因的表達量均上調(diào)，不同處理條件的上調(diào)倍數(shù)和最大倍數(shù)產(chǎn)生時間略有差異，這說明該基因可能參與花生的生長發(fā)育過程，也可能參與花生的生物脅迫過程，而且該基因在SA和JA處理下的表達量都上調(diào)，也進一步說明該基因可能同時參與SA和JA介導(dǎo)的生物脅迫過程。這些結(jié)果將為進一步研究該基因的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。