馬麥艷，張相鋒，馬正海，焦子偉

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830046；2.伊犁師范大學(xué)生物與地理科學(xué)學(xué)院，新疆伊寧 835000)

0 引 言

【研究意義】我國是世界上主要的硒資源國之一，但仍然是缺硒大國，2/3的地區(qū)存在不同程度的缺硒[3]。人體通常通過生物轉(zhuǎn)化的方式來補(bǔ)硒[4,5]。真菌具有較強(qiáng)的生物富集和轉(zhuǎn)化能力，可以將無機(jī)物轉(zhuǎn)化為有機(jī)物。蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)是一種和冬蟲夏草相媲美的藥食兩用真菌，且具有良好的富硒能力[6,7]。鑒于不同地區(qū)蛹蟲草生物學(xué)特性會有一些差異性，因此，對新疆蛹蟲草生物富硒進(jìn)一步研究，為開發(fā)天然富硒蛹蟲草提供技術(shù)支持?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】食用菌作為富硒載體，其效果較好，如今在我國正被廣泛應(yīng)用，目前已培育出富硒靈芝、富硒金針菇、富硒平菇等產(chǎn)品[8-11]。在生物載體方面，而關(guān)于富硒蛹蟲草的研究相對較少，于田田等[12]研究生物富硒對人工蛹蟲草菌絲體中粗脂肪、粗蛋白、總灰分、蟲草素、腺苷、蟲草酸及蟲草多糖等多種功效成分含量均有顯著影響。凌宏通等[13]研究表明,硒可提高蛹蟲草的耐硒能力，但加過量硒源會導(dǎo)致蛹蟲草分化時間延長和子座產(chǎn)量降低。【本研究切入點(diǎn)】不同地區(qū)蛹蟲草生物學(xué)特性會有一些差異。以亞硒酸鈉(Na2SeO3)作為外源硒，新疆地區(qū)蛹蟲草為富硒載體，采用不同硒濃度培養(yǎng)液對蛹蟲草進(jìn)行人工栽培處理，研究蛹蟲草對亞硒酸鈉的耐受性。【擬解決的關(guān)鍵問題】系統(tǒng)研究不同濃度亞硒酸鈉處理對蛹蟲草菌絲、子座、子實(shí)體生長，產(chǎn)量、總硒及其功能成分腺苷、蛹蟲草含量的影響，研究富硒蛹蟲草栽培最佳適宜的濃度，為大面積人工栽培富硒蛹蟲草提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試菌株

供試菌株為不同交配型MAT1-1和MAT1-2代表菌株d9、a11，來源于實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

改良PDA固體培養(yǎng)基、改良PD液體培養(yǎng)基[14]。

含硒培養(yǎng)液：在配好的改良PD液體培養(yǎng)基中分別加入一定量的Na2SeO3，分別配成硒濃度為20、40、60、80、100、150和200 mg/L含硒培養(yǎng)液。

大米培養(yǎng)基：每個組培瓶中加入20 g大米和20 mL不同濃度含硒改良培養(yǎng)液，蓋緊瓶蓋，于115℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)8個處理，每個處理重復(fù)3次。表1

表1 不同處理人工栽培培養(yǎng)基
Table 1 Artificial media ingredents of different treatments

處理Treatments人工培養(yǎng)基配方Artificial cultivation medium ingredients 1大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(20 mg/L)濃度的含硒培養(yǎng)液2大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(40 mg/L)濃度的含硒培養(yǎng)液3大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(60 mg/L)濃度的含硒培養(yǎng)液4大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(80 mg/L)濃度的含硒培養(yǎng)液5大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(100 mg/L)濃度的含硒培養(yǎng)液6大米 20 g/瓶+20 mL/瓶(150 mg/L)濃度的含硒培養(yǎng)液 7大米 20 g/瓶+20mL/瓶(200 mg/L)濃度的含硒培養(yǎng)液8(CK)大米 20 g/瓶+20 mL/瓶不含硒的改良培養(yǎng)液

1.2.2 蛹蟲草栽培

人工栽培參照努爾買買提等[14]的方法進(jìn)行。

將MAT1-1，MAT1-2兩個菌株接種于改良PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)15～20 d進(jìn)行活化。將活化后的兩種菌種分別接種在改良PD液體培養(yǎng)基中，獲得d9、a11兩種菌懸液。將這兩種菌懸液等體積混合均勻后用無菌水稀釋10倍，吸取10 mL均勻添加到各個處理的培養(yǎng)瓶中，放置培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間人工定期對培養(yǎng)室進(jìn)行消毒擦洗，在室內(nèi)相對濕度(80%)、溫度(25 ± 1)℃和光照16 h條件下培養(yǎng)55～60 d。

1.2.3 蛹蟲草子實(shí)體生物量的測定

定期對不同濃度亞硒酸鈉處理的蛹蟲草子菌絲體及子實(shí)體生長狀況進(jìn)行觀察、記錄；將在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)55～60 d的蛹蟲草子實(shí)體進(jìn)行采收。并對采收的蛹蟲草子實(shí)體的長度、干重、鮮重、生物轉(zhuǎn)化率、硒含量及主要功能成分等相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.2.4 蛹蟲草子實(shí)體中硒含量檢測

蛹蟲草子實(shí)體中硒含量檢測方法參照蔡寶祥等方法[15]。

1.2.5 蛹蟲草子實(shí)體中腺苷、蟲草素含量檢測

采用高效液相色譜法進(jìn)行檢測[16]。

測定條件∶C18∶250 mm×4.6 mm×5 μm；流動相∶A∶乙腈B∶1.0%乙酸，A∶B(v/v)=5∶95；流速：1.0 mL/min，柱溫：35℃，檢測波長：260 nm，進(jìn)樣量：10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：取蟲草素、腺苷標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg(按實(shí)際含量折算)，用流動相(乙腈∶水(v/v)為5∶95)定容至100 mL(100 μg/mL)，充分搖勻。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制不同梯度的蟲草素和腺苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至10 mL，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL。將待測提取液逐一進(jìn)高效液相色譜儀進(jìn)行檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其蟲草素和腺苷的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件(Version 11.5，USA)、EXCEL軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草菌絲生長

研究表明，經(jīng)接菌、人工栽培后，不同濃度Na2SeO3處理與對照相比，處理1和處理2中的蛹蟲草菌絲體生長狀況最好，接種后4 d，菌絲已布滿整個培養(yǎng)基基質(zhì)，且菌絲密度最好，菌絲轉(zhuǎn)成橘黃色速度最快，10～11 d菌餅變黃；其它處理的蛹蟲草菌絲生長情況不盡一致。處理3、處理4與對照處理相比，對蛹蟲草菌絲體生長有輕微的抑制作用，菌餅變黃用時14 d，菌絲密度較好，菌絲轉(zhuǎn)色較快；而處理5(硒濃度100 mg/L)對蛹蟲草菌絲體生長具有明顯的抑制作用，菌絲轉(zhuǎn)色速度較慢，且菌餅變黃用時19 d；處理7(硒濃度200 mg/L)蛹蟲草菌絲生長情況最差，抑制最強(qiáng)，菌絲長滿培養(yǎng)基用時19 d，菌餅變黃用時33 d，且菌絲密度最差，菌絲轉(zhuǎn)成橘黃色速度最慢。硒濃度≤40 mg/L時對蛹蟲草菌絲體生長無影響，但隨著硒濃度的不斷增加，對其菌絲體生長抑制越強(qiáng)。表2

表2 不同處理蛹蟲草的菌絲生長比較
Table 2 Comparison on growth of hypha inCororcepsrnitarisserved as different treatments

處理Treatments菌絲長滿時間Mycelia overgrown time (d)菌絲密度Mycelia density菌絲轉(zhuǎn)色Mycelia color transformation菌餅變黃時間Media colour transformation (d)14++++白色變橘黃色快1024++++白色變橘黃色快113 6+++白色變橘黃色較快1446+++白色變橘黃色較快1459+++白色變橘黃色較慢19611++白色變橘黃色慢24719+白色變橘黃色最慢338(CK)4++++白色變橘黃色快11

注：“++++”密度最好；“+++” 密度較好；“++” 密度一般； “+”密度差

Note: “++++” indicates the best density; “+++”indicates better density; “++” indicates ordinary density; “+”indicates poor density

2.2 蛹蟲草子實(shí)體生長

研究表明,不同處理的蛹蟲草子實(shí)體生長狀況及各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)各不相同。與對照相比，處理1、處理2表現(xiàn)最好，蛹蟲草子實(shí)體形成時間最早，為27 d，子座粗長、均勻，子實(shí)體正常、橘紅色，有子囊殼，且出草質(zhì)量最好；處理3、處理4對蛹蟲草子實(shí)體生長僅有輕微的抑制作用，這兩個試驗(yàn)組的蛹蟲草各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)均表現(xiàn)較好，出草時間較早，用時29 d，子座較粗長、均勻，子實(shí)體較正常、橘紅色，有子囊殼，出草質(zhì)量較好；處理5(硒濃度100 mg/L)時，對蛹蟲草子實(shí)體生長具有明顯的抑制作用，出草時間為33 d，子座粗短，出草較晚，且出草質(zhì)量較差；Na2SeO3濃度為150 mg/L的試驗(yàn)組次之；處理7(硒濃度200 mg/L)蛹蟲草子實(shí)體生長及各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)表現(xiàn)最差，僅少量出草，且細(xì)短，出草最慢，有子囊殼，出草質(zhì)量最差。硒濃度≤40 mg/L時對蛹蟲草子座、子實(shí)體生長無影響但隨著硒濃度的不斷增加，對蛹蟲草子座、子實(shí)體生長抑制越強(qiáng)。表3

表3 不同處理蛹蟲草的子實(shí)體生長比較
Table 3 Comparison on growth of fruitbody inCororcepsrnitarisserved as different treatments

處理Treatments出草時間Formation time of fruiting-body子座生長Stromata formation子實(shí)體生長及色澤Fruiting-body growth and colour子囊殼Ascocarp出草質(zhì)量Fruiting-body Quality127子座粗長,均勻出草早,正常,橘紅色有+++227子座粗長,均勻出草早,正常,橘紅色有+++3 29子座較粗長,均勻出草較早,較正常,橘紅色有++429子座較粗長,均勻出草較早,較正常,橘紅色有++533子座粗短,均勻出草較晚,較差,橘紅色有+635子座粗短,均勻出草較晚,較差,橘紅色有+742子座較細(xì)短,不均勻出草最晚,最差,僅部分出草,橘紅色有-8(CK)27子座粗長,均勻出草早,正常,橘紅色有+++

注：“+++”表示80%的子實(shí)體直徑≥3 mm，長度≥4 cm；“++”表示80%的子實(shí)體直徑≥2 mm，長度≥3 cm；“+”表示80%的子實(shí)體直徑≥1 mm，長度≥2 cm。“-”表示80%的子實(shí)體直徑<1 mm，長度<2 cm

Note: “+++” means 80% of the fruitbody dimeter ≥3 mm, and length ≥4 cm; “+ +” means means 80% of the fruitbody dimeter ≥2 mm, and length ≥3 cm; “+” means 80% of the fruitbody dimeter ≥1 mm, and length ≥2 cm; “-” means 80% of the fruitbody dimeter <1 mm, and length <2 cm

2.3 蛹蟲草出草比較

研究表明,不同處理對蛹蟲草子實(shí)體生長狀況有不同的影響。處理1、處理2與對照相比對蛹蟲草子實(shí)體無影響，長勢最好，子實(shí)體粗長、均勻，色澤鮮艷；處理3、處理4對蛹蟲草子實(shí)體生長具有輕微的抑制作用，蛹蟲草長勢較好；處理5和處理6對其抑制作用較明顯，蛹蟲草子實(shí)體長勢較差；處理7(硒濃度200 mg/L)對蛹蟲草子實(shí)體生長影響最大，長勢最差，僅少量出草，且細(xì)短，不均勻。圖1

處理1和處理2兩個處理與對照相比對蛹蟲草子實(shí)體的長度、鮮重、干重、生物轉(zhuǎn)化率等方面無顯著差異(P<0.05，下同)；處理2的蛹蟲草子實(shí)體鮮重最高，為8.94 g，生物轉(zhuǎn)化率44.68%。處理3至處理7與對照相比對蛹蟲草的鮮重、干重、生物轉(zhuǎn)化率等方面均呈顯著性差異；處理3當(dāng)硒濃度達(dá)到60 mg/L，蛹蟲草的除鮮干比以外其他指標(biāo)明顯低于對照，并呈顯著性差異；處理7(硒濃度200 mg/L)的蛹蟲草除鮮干比以外其他指標(biāo)均表現(xiàn)最差，其處理的子實(shí)體長度3.48 cm，鮮重5.12 g，干重1.13 g，生物轉(zhuǎn)化率最低，為25.30%。硒濃度≤40 mg/L時對蛹蟲草子實(shí)體的鮮重、干重、生物轉(zhuǎn)化率生長無影響，但隨著處理硒濃度不斷增加，對蛹蟲草子實(shí)體的長度、鮮重、干重、生物轉(zhuǎn)化率等降低越明顯。表4

圖1 不同處理人工栽培蛹蟲草子實(shí)體效果
Fig. 1 Effects on fruitbody ofCororcepsrnitarisin artificial cultivation served as different treatments

表4 不同處理的蛹蟲草子實(shí)體相關(guān)指標(biāo)
Table 4 Relative index analysis of fruitbody inCororcepsrnitarisserved as different treatments

處理Treatments子實(shí)體長度 Fruitbody length (cm)鮮重 (g/瓶)Fresh weight (g/bottle)干重(g/瓶)Dry weight (g/bottle)鮮干比Fresh dry ratio生物轉(zhuǎn)化率Biological conversion rate (%)15.88±0.09a8.82±0.24a1.74±0.04a5.24±0.10abc43.76±1.21a25.79±0.18a8.94±0.44a1.72±0.04a5.51±0.19a44.68±2.21a3 4.64±0.15c7.59±0.33b1.53±0.04b5.12±0.15abc37.74±1.60b44.65±0.10c7.42±0.26b1.47±0.03bc5.38±0.09ab37.12±1.28b54.05±0.11d7.10±0.16b1.51±0.04bc4.99±0.08bc35.17±0.82b64.14±0.09d6.73±0.18b1.40±0.01c5.09±0.15abc33.32±0.90b73.48±0.08e5.12±0.46c1.13±0.06d4.86±0.15c25.30±2.30c8(CK)6.12±0.14a8.70±0.18a1.80±0.03a5.10±0.11abc43.36±0.90a

注:數(shù)據(jù)為平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。(a-e)，不同字母表示為顯著性差異(P< 0.05)，下同

Note: Data is the mean and standard error (a-e), and the different letters indicate significant differences (P< 0.05), the same as below

2.4 總硒含量檢測

研究表明,處理1至處理7與對照相比，其處理的蛹蟲草子實(shí)體中總硒含量均呈顯著性差異(P<0.05，下同)。處理1和處理2相比，其子實(shí)體總硒含量無顯著性差異，處理2的總硒含量最高，達(dá)31.2%；處理1、處理2與處理3、處理4、處理5、處理6、處理7之間相比，其總硒含量呈顯著性差異。處理3和處理4的蛹蟲草子實(shí)體中總硒含量差異不顯著；但隨著培養(yǎng)基中硒濃度的增加，蛹蟲草子實(shí)體中總硒含量下降，處理7(硒濃度200 mg/L)的蛹蟲草子實(shí)體中總硒含量最低，為4.01%。結(jié)果表明，處理1、處理2的蛹蟲草子實(shí)體總硒含量最高，但隨著硒濃度處理的不斷增高，其子實(shí)體中總硒含量不斷降低。表5

表5 不同處理子實(shí)體中總硒含量
Table 5 Total selenium content of fruiting body served as different treatments

處理 Treatments總硒含量Selenium content(%)130.70±0.28a231.20±0.32a326.74±0.47b422.68±0.19c522.45±0.47c618. 38±0.16d74.01±0.437e

2.5 功能成分腺苷、蟲草素含量

研究表明，處理1、處理2與對照相比呈顯著性差異(P<0.05，下同)，功能成分含量增加；處理1和處理2之間呈顯著性差異，其中處理1的功能成分腺苷為1 409 μg/g，蟲草素12 017.54 μg/g，最高。處理3至處理7與對照相比也呈顯著性差異，隨處理濃度不斷增加其功能成分含量逐漸降低，以處理7的最低，為腺苷含量為593.64 μg/g，蟲草素含量為4 235.89 μg/g。結(jié)果表明，硒濃度≤40 mg/L時對蛹蟲草子實(shí)體的功能成分腺苷、蟲草素的含量呈增加現(xiàn)象；但硒濃度≥60 mg/L時，隨著硒濃度的增加其功能成分腺苷、蟲草素的含量呈下降趨勢。表6

表6 不同處理子實(shí)體中腺苷、蟲草素含量
Table 6 contents of adenosine and cordycepin of fruiting body served as different treatments

處理Treatments腺苷Adenosine(μg/g)蟲草素Cordycepin(μg/g)11 409.05±5.08a12 017.54±8.30a21 315.15±11.67b11 211.33±9.77b31 112.66±10.77c9 521.12±2.70d41 012.33±7.56d9 107.10±3.28e5924.40±4.93e6 808.12±4.66f6713.37±6.98f5 856.09±4.67g7593.64±6.45g4 235.89±5.33h對照組(CK)1 105.33±9.96c9 831.11±4.23c

3 討 論

以新疆本地蛹蟲草作為富硒載體，研究表明,各個不同濃度Na2SeO3處理對蛹蟲草菌絲密度、菌絲長滿時間、菌絲轉(zhuǎn)色情況、菌餅變黃時間、子座生長、子實(shí)體的出草時間、子實(shí)體生長以及出草質(zhì)量等各項(xiàng)生物學(xué)指標(biāo)的影響各不相同。處理1(硒濃度20 mg/L)和處理2(硒濃度40 mg/L)與對照相比其蛹蟲草的菌絲體生長、子座生長、子實(shí)體出草長度、鮮重、干重、生物轉(zhuǎn)化率等方面無影響；從處理3(硒濃度60 mg/L)至處理7(硒濃度200 mg/L)與對照相比，其蛹蟲草的菌絲體生長、子座生長受到抑制，其子實(shí)體出草長度、鮮重、干重、生物轉(zhuǎn)化率等呈顯著性差異(P<0.05)，呈降低趨勢，并隨著的硒濃度增加，抑制作用越明顯，以處理7的最為嚴(yán)重，其處理的蛹蟲草各項(xiàng)指標(biāo)表現(xiàn)最差，即子實(shí)體長度3.44 cm，鮮重5.04 g，干重1.05 g，鮮干比為4.79，生物轉(zhuǎn)化率最低，為25.22%。陳宏偉等[17]研究表明,較低硒濃度促進(jìn)蛹蟲草菌絲體生長，較高濃度硒抑制其菌絲生長；杜雙田等[18]研究也表明,在蛹蟲草菌株CM-003平板培養(yǎng)基上亞硒酸鈉質(zhì)量濃度≤100 mg/L時對蛹蟲草的菌落形態(tài)基本正常，菌落直徑變化較??；當(dāng)亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為450 mg/L時，其菌絲緩慢生長；隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增加，采用常規(guī)瓶栽法的蛹蟲草的長勢評分和子座產(chǎn)量呈先增加后減小現(xiàn)象。盡管和研究有一定的相似之處，但不同蛹蟲草菌種資源及栽培條件等也影響其對亞硒酸鈉耐受程度。此外，系統(tǒng)深入地研究了亞硒酸鈉對其菌絲生長、子座生長、子實(shí)體生長、出草質(zhì)量等定性指標(biāo)，以及對其子實(shí)體長度、鮮重、干重和生物轉(zhuǎn)化率等定量指標(biāo)進(jìn)行分析，明確了新疆本地蛹蟲草菌種吸收亞硒酸鈉較為理想的濃度。

杜雙田等[18]研究表明,隨著亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的增加，子座硒含量呈逐漸增加趨勢；亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為200 mg/L時，子座硒含量92.68 mg/kg，最高。這與研究結(jié)果有差異，處理1、處理2的蛹蟲草子實(shí)體總硒含量最高，但隨著處理硒濃度不斷增高，其子實(shí)體中總硒含量不斷降低。處理1、處理2與對照相比其蛹蟲草子實(shí)體的腺苷、蟲草素含量明顯增加。這與于田田等[12]研究結(jié)果相似，即生物富硒對蛹蟲草菌絲體化學(xué)成分(營養(yǎng)和功效成分)含量有一定影響，富硒蛹蟲草的腺苷、蟲草素含量等明顯高于普通蛹蟲草。當(dāng)亞硒酸鈉濃度逐步增加時，子實(shí)體中的腺苷、蟲草素含量逐漸下降，這可能是硒的存在對蛹蟲草子實(shí)體代謝產(chǎn)生一定的影響，其影響機(jī)理有待進(jìn)一步深入系統(tǒng)研究。

4 結(jié) 論

低濃度Na2SeO3對新疆地區(qū)蛹蟲草的菌絲密度、菌絲長滿時間、菌絲轉(zhuǎn)色情況、菌餅變黃時間、子座生長、子實(shí)體出草時間、子實(shí)體生長、出草質(zhì)量、子實(shí)體出草長度、鮮重、干重、生物轉(zhuǎn)化率等方面無影響，其總硒含量較高和功能成分腺苷、蟲草素含量增加；高濃度Na2SeO3抑制其生長、總硒含量較低和功能成分腺苷和蟲草素含量下降。以亞硒酸鈉作為外源硒，硒濃度20～40 mg/L效果最好，可作為進(jìn)行蛹蟲草富硒栽培較為理想的濃度。