不同炒制程度下決明子中11 種成分含量變化研究＊

楊 冰，秦昆明，李偉東,3，鄭艷萍，金俊杰,3＊＊，蔡寶昌,＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心 南京210023；2.南京海昌中藥集團(tuán)有限公司 南京 210061；3.江蘇海昇藥業(yè)有限公司南京 210061；4.淮海工學(xué)院藥學(xué)院 連云港 222005）

決明子為豆科植物決明Cassia obtusi foliaL.或小決明Cassia toraL.的干燥成熟種子，具清熱明目、潤(rùn)腸通便的功效[1]。現(xiàn)代研究表明，決明子具有多種藥理作用[2]，如降血脂[3]、降血壓[4]、抗氧化[5]、保肝[6]及抑菌[7]等。決明子含蒽醌類(lèi)、萘駢吡喃酮類(lèi)、脂肪酸類(lèi)、氨基酸和無(wú)機(jī)元素等，其主要成分為蒽醌類(lèi)及萘駢吡喃酮類(lèi)成分[8]。

炒決明子為決明子的炮制品，決明子炒制后能緩和寒瀉之性，具有平肝養(yǎng)目的功效[8]。生、炒決明子功效各異，主要在于炒制過(guò)程中決明子內(nèi)化學(xué)成分的含量發(fā)生變化。根據(jù)2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》，決明子按照清炒法，炒至微鼓起、有香氣[1]即可，但沒(méi)有規(guī)定明確的炒制溫度及炒制時(shí)間。為探究決明子炒制過(guò)程中化學(xué)成分變化規(guī)律，并有效地控制生、炒決明子飲片的質(zhì)量，本課題組采用高效液相色譜法對(duì)生決明子及其不同炒制程度的炒決明子中11 種化學(xué)成分進(jìn)行含量測(cè)定，揭示炒制溫度及炒制時(shí)間對(duì)決明子中主要成分的影響，尋找決明子在不同炒制溫度及炒制時(shí)間下11種成分的含量變化規(guī)律，并為炒決明子質(zhì)量評(píng)價(jià)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20AB 高效液相色譜系統(tǒng)（島津公司，包括在線脫氣機(jī)、Prominence SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器、SPD-M20A 二極管陣列檢測(cè)器、CTO-20A 柱溫箱）；Shimadzu LC-20AD高效液相色譜儀（SPD-20A紫外-可見(jiàn)光檢測(cè)器，島津LC-Solusion 工作站）；BP121S電子分析天平（梅特勒-托雷多公司）；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DY-20流水式中藥打粉機(jī)（溫嶺市奧力中藥器械有限公司）；YMC-Pack-ODS-A C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料）（YMC Co.Ltd，Japan）；Fluke 62MAX 紅外測(cè)溫儀（珠海天創(chuàng)儀器有限公司）。

乙腈、甲醇及無(wú)水乙醇均為色譜純，水為超純水，磷酸、甲酸等均為分析純，購(gòu)自南京維之誠(chéng)化學(xué)試劑有限公司。對(duì)照品決明素（批號(hào)：170813，純度≥98.0% ）、決明子苷（批號(hào)：161215，純度99.0% ）、決明子苷B2（批號(hào)：161219，純度98.5% ）、決明子苷C（批號(hào)：161215，純度98.8% ）及紅鏈霉素-龍膽二糖苷（批號(hào)：170312，純度97.6% ）購(gòu)自成都昂賽思生物科技有限公司，大黃素（批號(hào)：140728，純度98.0% ）、大黃酚（批號(hào)：130406，純度98.0% ）、橙黃決明素（批號(hào)：170304，純度98.0% ）、大黃素甲醚（批號(hào)：131227，純度98.0% ）、黃決明素（批號(hào)：170306，純度98.0% ）、美決明子素（批號(hào)：170326，純度98.0% ）均購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。

圖1 混合對(duì)照品（A）決明子樣品（B）HPLC 色譜圖

決明子飲片（批號(hào)：20160608）購(gòu)自銅陵禾田中藥飲片股份有限公司，產(chǎn)地為河南洛陽(yáng)，經(jīng)南京海源中藥飲片有限公司丁斐中藥師鑒定，為豆科植物決明Cassia obtusi foliaL．的干燥成熟種子。不同炒制程度的炒決明子飲片于南京海源中藥飲片有限公司實(shí)驗(yàn)室自制，方法如下：稱(chēng)取6 份決明子飲片，每份200 g，采用紅外測(cè)溫儀測(cè)定溫度，于140℃熱鍋下藥，不斷翻炒，待藥溫達(dá)到140℃開(kāi)始計(jì)時(shí)，分別持續(xù)此溫度3、5、8、10、12、15 min，出鍋，制備得到6份140℃不同炒制時(shí)間的決明子飲片，上述過(guò)程重復(fù)3 次，將相同炒制程度下的3份樣品混合。160℃及180℃不同炒制時(shí)間的決明子飲片均按此法炒制。制備得到的不同炒制程度的炒決明子飲片表面暗棕色，偶見(jiàn)焦斑，整體顏色隨著炒制溫度升高及炒制時(shí)間的延長(zhǎng)而加深，均符合2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》中炒決明子的性狀特征。生決明子及不同炒制程度的炒決明子飲片粉碎，過(guò)50目篩。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱YMC-Pack ODS-A C18柱（250×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相選用乙腈（A）-0.1% 甲酸水溶液（B）進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序：0-10 min，15% -25% （A）；10-15 min，25% -26% （A）；15-35 min，26% -26% （A）；35-45 min，26% -45% （A）；45-50 min，45% -45% （A）；50-70 min，45% -55% （A）；70-90 min，55% -85% （A）；90-95 min，85% -100% （A）；95-110 min，100% -15% （A）；110-120 min，15% -15% （A）；流速：0.5 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。混合對(duì)照品及決明子的色譜圖（圖1）。

3.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別取待測(cè)成分的對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為決明子苷64.80 μg·mL-1，決明子苷B2100.00 μg·mL-1，決明子苷C 99.20 μg·mL-1，紅鏈霉素-龍膽二糖苷131.76 μg·mL-1的苷類(lèi)混合對(duì)照品溶液及濃度分別為決明素10.48 μg·mL-1，黃決明素12.62 μg·mL-1，橙黃決明素26.82 μg·mL-1，美決明子素μg·mL-1，大黃素28.20 μg·mL-1，大黃酚44.00 μg·mL-1，大黃素甲醚13.65 μg·mL-1的苷元類(lèi)混合對(duì)照品溶液，冷藏（4℃），備用。

表1 回歸方程及線性范圍

2.3 供試品溶液的制備

取決明子或炒決明子粉末（50 目）于60℃烘干至恒重，精密稱(chēng)0.5 g，置于錐形瓶中，加85% 乙醇30 mL，超聲30 min，過(guò)濾，取濾液過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得供試品溶液，備用。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對(duì)照品貯備液，依次稀釋?zhuān)苽涑砂敢涸趦?nèi)的7 份不同濃度的混合對(duì)照品溶液，并按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積（Y）對(duì)分析物濃度（X）作線性回歸，求回歸方程及線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果（表1）。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液10 μL，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示：決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積的RSD 分別為2.02% 、1.39% 、0.72% 、1.72% 、1.91% 、1.17% 、1.23% 、2.04% 、0.36% 、0.53% 、0.52% ，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取決明子供試品溶液，分別在0、2、8、16、36、48 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD 分別為0.39% 、0.92% 、2.28% 、0.50% 、0.20% 、1.02% 、1.21% 、0.63% 、1.72% 、0.48% 、1.77% ，表明供試品溶液48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取決明子粉末0.5 g，共6 份，分別按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為0.99% 、1.05% 、2.33% 、0.94% 、0.98% 、1.14% 、1.25% 、0.85% 、1.35% 、1.46% 、1.28% ，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取決明子粉末0.25 g，共6 份，精密加入對(duì)照品適量（與0.25 g 決明子中各成分含量相當(dāng)），按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試溶液，在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。結(jié)果決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率分別為101.44% 、100.66% 、101.33% 、101.15、99.55% 、100.49% 、99.09% 、99.34% 、100.43% ，100.84% 、103.60% ，RSD 分別為2.26% 、2.65% 、2.08% 、1.94% 、2.40% 、2.69% 、2.72% 、2.44% 、2.89% 、1.91% 、1.95% ，表明方法的回收率良好（表3）。

2.9 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取決明子及不同炒制程度的炒決明子粉末約0.5 g，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，按“2.4”項(xiàng)下回歸方程計(jì)算決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量，結(jié)果（表2、圖2）。

表2 決明子及炒決明子中11個(gè)活性成分的含量（mg·g-1，n=3）

由含量測(cè)定結(jié)果可知，在決明子炒制過(guò)程中決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C 及紅鏈霉素-龍膽二糖苷4種苷類(lèi)成分的含量整體呈下降趨勢(shì)，尤其在160℃及180℃炒制溫度下4 種成分的含量下降較為明顯。決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素及大黃素5種苷元類(lèi)成分的含量在決明子不同炒制程度下變化較小，但以180℃炒制時(shí)含量略高。大黃酚及大黃素甲醚2 種苷元類(lèi)成分在決明子炒制過(guò)程中變化顯著，且隨著炒制溫度升高，大黃酚及大黃素甲醚的含量也逐漸升高。決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚7 種苷元類(lèi)成分在藥溫為180℃下炒制8 min 時(shí)均出現(xiàn)含量突增現(xiàn)象，之后其含量保持平穩(wěn)或緩慢增加。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

續(xù)表3

圖2 不同炒制程度下決明子中11種成分變化趨勢(shì)圖

縱觀11 種化學(xué)成分的變化趨勢(shì)，決明子在180℃炒制時(shí)，其內(nèi)的11種成分變化較為顯著，其中180℃變炒制8 min是決明子中11種化學(xué)成分變化的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)，8 min后11種化學(xué)成分的含量則相對(duì)穩(wěn)定。

3 討論

2015 版《中華人民共和國(guó)藥典》中決明子項(xiàng)下并未對(duì)炒決明子的炮制工藝進(jìn)行量化闡述，僅用“取凈決明子，照清炒法炒至微鼓起、有香氣”表述。本研究在不同炒制溫度（藥溫）及炒制時(shí)間下對(duì)決明子進(jìn)行炮制，制備得到18 種不同炒制程度的炒決明子，采用高效液相對(duì)其內(nèi)的11種成分進(jìn)行含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同炒制程度下的炒決明子中決明子苷、決明子苷B2、決明子苷C、紅鏈霉素-龍膽二糖苷、決明素、黃決明素、橙黃決明素、美決明子素、大黃素、大黃酚及大黃素甲醚11種成分的含量差異顯著，整體呈現(xiàn)出苷類(lèi)成分含量下降及苷元類(lèi)成分含量上升的趨勢(shì)，且炒制溫度及炒制時(shí)間均可影響炒決明子中11種成分的含量，其中炒制溫度對(duì)成分含量的影響較為明顯。此外，有研究發(fā)現(xiàn)決明子中含有糖苷酶，但在炮制過(guò)程中糖苷酶并未發(fā)揮作用，而炮制中的高溫條件是造成決明子炮制后苷類(lèi)成分含量降低、苷元成分含量升高的主要原因，即高溫使苷類(lèi)成分的苷鍵斷裂產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的苷元[9]，此結(jié)果進(jìn)一步體現(xiàn)在決明子炮制過(guò)程中對(duì)炒制溫度控制的重要性。

物質(zhì)基礎(chǔ)的變化與中藥的藥效或藥性密切相關(guān)。在決明子炮制過(guò)程中，不同的炮制溫度及炮制時(shí)間均會(huì)導(dǎo)致決明子物質(zhì)基礎(chǔ)的改變，而物質(zhì)基礎(chǔ)不同必然導(dǎo)致藥效差異。既往的生/炒決明子藥效研究中存在炮制增效、炮制減效及炮制后藥效相當(dāng)?shù)戎T多爭(zhēng)議，本研究在將決明子于140℃、160℃及180℃分別炒制3、5、8、10、12、15 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以上不同程度的炒決明子均符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的“炒制微鼓起、有香氣”，而檢測(cè)結(jié)果顯示不同炒制程度下決明子主要成分存在較大差異，故而考慮既往文獻(xiàn)中藥效爭(zhēng)議可能與研究者采用的炒決明子的炮制程度有關(guān)。在決明子炮制過(guò)程中，物質(zhì)基礎(chǔ)的量變可能會(huì)引起藥效的質(zhì)變，故炮制過(guò)程化學(xué)研究對(duì)揭示中藥炮制的機(jī)制具有重要作用。因此簡(jiǎn)單地用“炒制微鼓起、有香氣”對(duì)炒決明子的炮制終點(diǎn)進(jìn)行判斷是不合理的，為規(guī)范炒決明子的炮制工藝及保證炒決明子的質(zhì)量穩(wěn)定，需對(duì)炒決明子的炮制過(guò)程進(jìn)行量化，在炒決明子飲片的實(shí)際生產(chǎn)中，在固定投料量的基礎(chǔ)上，規(guī)范決明子炒制的溫度及炒制時(shí)間。