洪 亮，余方流，黃月娥

(皖南醫(yī)學(xué)院 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；2.公共衛(wèi)生學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

乳酸桿菌(Lactobacillus bacillus)是一類可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸革蘭陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱，有研究證實(shí)乳酸桿菌在抗腫瘤、抗感染、抗衰老等方面均具有明顯的調(diào)節(jié)作用[1]。Sato等[2]認(rèn)為，肽聚糖(peptidoglycan，PG)可能是乳酸桿菌發(fā)揮免疫賦活作用的主要功能性物質(zhì)，PG能夠通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能和誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放，對機(jī)體免疫應(yīng)答發(fā)揮重要影響。但在局部黏膜免疫中，關(guān)于乳酸桿菌PG成分的調(diào)節(jié)作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)篩選4株乳酸桿菌提取細(xì)胞壁肽聚糖，探討其對昆明小鼠局部黏膜免疫的調(diào)節(jié)機(jī)制，旨在為乳酸桿菌的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與菌種 健康昆明系小鼠50只，8～10周，雌雄各半，體質(zhì)量20～25 g(購于南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心)。4株乳酸桿菌從正常育齡婦女陰道內(nèi)分離所得(皖南醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室提供)，經(jīng)API-CH 50系統(tǒng)鑒定。

1.2 肽聚糖提取 將乳酸桿菌細(xì)菌培養(yǎng)后，調(diào)整菌液濃度為1010CFU/mL，迅速降溫至4℃冰浴，在4℃，3000 r/min離心20 min收集菌體沉淀。反復(fù)洗滌沉淀，收集菌體，置于100℃沸水中滅活，4℃保存使用。釆用宋曉玲等改進(jìn)的Prak三氯乙酸法提取肽聚糖[3]。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 將實(shí)驗(yàn)動物按雌雄各半隨機(jī)分為5組，分別為卷曲乳酸桿菌組(Group J)、嗜酸乳酸桿菌Ⅰ組(GroupⅠ)、嗜酸乳酸桿菌Ⅱ組(GroupⅡ)、嗜酸乳酸桿菌Ⅲ組(GroupⅢ)，另設(shè)對照組(Control)，每組均為10只。各試驗(yàn)組以100 mL /(kg·d)劑量灌服相應(yīng)菌液提取物，對照組按同劑量灌服生理鹽水，連續(xù)給藥7 d。

1.4 免疫學(xué)指標(biāo)檢測 給藥7 d后，小鼠斷頸處死眼球采血，分離血清。用ELISA雙抗體夾心法(試劑盒購于依科賽公司)檢測血清TGF-β、IL-2、IL-6含量變化。另取小鼠小腸全段，用磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗，離心去沉淀。用ELISA雙抗體夾心法(試劑盒購于華美公司)檢測SIgA含量變化。

2 結(jié)果

2.1 各組對IL-2的影響 結(jié)果顯示，GroupⅡ組IL-2水平高于Group J和Control組(P<0.05)，GroupⅠ組IL-2水平高于Control組(P<0.05)；其他各組間IL-2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組對IL-6的影響 結(jié)果顯示，GroupⅡ、GroupⅠ和Group J組IL-6水平高于Control組(P<0.05)；而GroupⅢ 、GroupⅡ、GroupⅠ和Group J組間、GroupⅢ和Control組IL-6水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 各組對TGF-β的影響 結(jié)果顯示，GroupⅢ和GroupⅡ組TGF-β水平高于GroupⅠ、Group J和Control組(P<0.05)；GroupⅠ組TGF-β水平高于Group J和Control組(P<0.05)；GroupⅢ和GroupⅡ組、Group J和Control組TGF-β水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.4 各組對SIgA的影響 結(jié)果顯示，GroupⅡ組SIgA水平高于GroupⅢ、GroupⅠ、Group J和Control組(P<0.05)；GroupⅠ和Group J組SIgA水平高于GroupⅢ和Control組(P<0.05)，而GroupⅠ和Group J組SIgA水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；GroupⅢ組SIgA水平高于Control組(P<0.05)。見表1。

表1 不同乳酸桿菌PG對昆明小鼠IL-2、IL-6、TGF-β和SIgA 分泌的影響 mg/L

GroupIL-2IL-6TGF-βSIgAControl20.510±1.635a16.733±3.473a177.998±18.978a283.386±26.767aGroup J21.576±2.249ab22.269±3.247b175.701±16.874a368.615±36.938cGroupⅠ24.052±2.974bc21.141±4.146b223.302±44.471b346.799±39.120cGroupⅡ25.409±3.478c22.360±4.568b277.737±27.647c394.426±22.254dGroupⅢ23.054±2.694abc17.996±2.724ab257.453±30.451c315.227±24.141bF5.2574.89424.46620.344P0.0010.0020.0000.000

注：多組間兩兩比較，符號完全不同表示P<0.05。

3 討論

研究表明，本實(shí)驗(yàn)所選用的4株乳酸桿菌均具有黏膜免疫調(diào)節(jié)作用，且每種調(diào)節(jié)免疫的效果有一定的區(qū)別，它們具體的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制并不是很清楚，但多個文獻(xiàn)表明肽聚糖可能是乳酸桿菌發(fā)揮免疫賦活作用的主要功能性物質(zhì)[4]。肽聚糖是存在于革蘭陽性和陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種復(fù)合糖類，主鏈?zhǔn)铅?1，4-糖苷鍵連接的N-乙酰氨基葡糖和N-乙酰胞壁酸交替的雜多糖。肽聚糖是乳酸桿菌細(xì)胞壁的主要成分，肽聚糖與肽聚糖識別分子結(jié)合后可以通過不同的信號傳導(dǎo)途徑釋放免疫調(diào)控物質(zhì)來發(fā)揮免疫功能[5]。

黏膜免疫是機(jī)體局部免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其中胃腸道黏膜組織是最大的黏膜免疫場所[6]。分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)的產(chǎn)生是腸黏膜免疫應(yīng)答發(fā)生的重要標(biāo)志之一，它由小腸上皮細(xì)胞分泌，能發(fā)揮免疫清除作用，提高腸道的黏膜免疫功能[7]。SIgA介導(dǎo)的免疫應(yīng)答依賴Th細(xì)胞的輔助，其中Th分為Th1和Th2兩類，Th1通過表達(dá)TGF-β、IL-2等介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2通過表達(dá)IL-4、IL-6等介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。這些細(xì)胞因子通過調(diào)節(jié)黏膜表面對相關(guān)抗原的免疫應(yīng)答，具有重要免疫調(diào)節(jié)作用[8]。

本實(shí)驗(yàn)表明，4種乳酸桿菌均能上調(diào)SIgA表達(dá)，提示4種乳酸桿菌PG均能夠誘導(dǎo)腸黏膜免疫應(yīng)答。其中GroupⅡ的SIgA表達(dá)水平最高，Group J、GroupⅠ和GroupⅢ的SIgA表達(dá)水平次之。GroupⅡ和GroupⅠ均能提高IL-6、TGF-β和IL-2的表達(dá)，GroupⅢ能提高IL-6、TGF-β的表達(dá)，表明這3株乳酸桿菌的PG可能同時參與細(xì)胞免疫和體液免疫兩條途徑，從而促進(jìn)SIgA的表達(dá)。而Group J只能提高IL-6的表達(dá)，表明其PG可能只通過參與體液免疫途徑促進(jìn)SIgA的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)研究證明乳酸桿菌PG具有黏膜免疫調(diào)節(jié)作用，其可能機(jī)制是乳酸桿菌提供病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMP)——肽聚糖和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，LTA)，被Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)識別后，通過TIR區(qū)域向胞漿內(nèi)傳導(dǎo)信號，激活NF-KB等轉(zhuǎn)錄因子和蛋白酶，釋放各類細(xì)胞因子、一氧化氮合成酶等，誘導(dǎo)細(xì)胞表面分子的表達(dá)，進(jìn)而激活第一信號系統(tǒng)和第二信號系統(tǒng)，通過大量蛋白作用使特定炎性因子的表達(dá)減弱和某些抗炎性因子表達(dá)上調(diào),在局部黏膜免疫中發(fā)揮作用[9]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)不同的乳酸桿菌PG對局部免疫的調(diào)節(jié)作用途徑和效果有差別，這為嗜酸乳桿菌微生態(tài)制劑及益生菌免疫佐劑的研究和開發(fā)提供依據(jù)。