李天增，候 鳳，李新蘋，王 鋼，賀 筍

（天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830011）

豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）可引起豬支原體肺炎，又稱地方流行性肺炎，是豬的一種慢性消耗性呼吸道病，臨床感染率極高。其主要癥狀為咳嗽和氣喘，以高發(fā)病率和低死亡率為特點。豬群一旦感染Mhp，便難以清除，不僅嚴重影響豬群的生長發(fā)育，用藥量增加，而且容易繼發(fā)感染PRRSV、PCV等，從而導(dǎo)致多種疫苗接種失敗[1-2]。本病的預(yù)防應(yīng)采用綜合的措施，給豬提供一個理想的環(huán)境是基礎(chǔ)，包括通風(fēng)、溫度及合理的飼養(yǎng)密度和飼養(yǎng)方式，藥物治療雖有效，但由于長期治療耗費大量藥物，并帶來肉質(zhì)藥物殘留的突出問題，因此，疫苗免疫是預(yù)防本病的最主要手段[3-4]。

目前，我國在動物疫苗技術(shù)研發(fā)與世界先進水平相比還存在較大差距，豬肺炎支原體的培養(yǎng)難度很大，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式耗時長，并且滴度不高，是目前支原體疫苗規(guī)模化生產(chǎn)的技術(shù)瓶頸。針對豬肺炎支原體的培養(yǎng)現(xiàn)狀，改進了培養(yǎng)基的配方，選擇豬血清作為培養(yǎng)基的添加血清，并且比較了不同廠家的豬血清，最后選擇廠家1的豬血清作為配制改良Friis培養(yǎng)基用豬血清。

1 材料

1.1 菌種

豬肺炎支原體CJ株，由天康生物股份有限公司分離、鑒定、保管和供應(yīng)。

1.2 試劑

健康豬血清分別購自國外和國內(nèi)的6個廠家；PPLO肉湯粉、BHI均購自美國BD公司；配制培養(yǎng)基用水由Millpore純水儀制備；氯化鈣、氯化鉀、磷酸二氫鉀、氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鈉、酚紅、青霉素均為國產(chǎn)試劑。

2 方法

2.1 液體培養(yǎng)基的配制

該培養(yǎng)基改良于Friis培養(yǎng)基。稱取腦心浸液粉末以及PPLO肉湯粉末，加入純水中。隔水加熱，冷卻至45℃以下。加入Hank'A及Hank'B溶液，以及青霉素。待其溶解后再加入酵母浸出液以及酚紅。最后分別與經(jīng)滅補體處理過的不同廠家的豬血清混合均勻并調(diào)整pH值。配制的改良Friis培養(yǎng)基置于2～8℃下保存?zhèn)溆?。隨機挑選1～2瓶改良Friis培養(yǎng)基按現(xiàn)行《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗。

2.2 種子液的培養(yǎng)

從菌種庫中取出濕毒，分別用配制的改良Friis培養(yǎng)基溶解，并按1∶10～1∶15分別繼代于不同血清配制的改良Friis培養(yǎng)基中，置于36～38℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中，以50～75 r/min振蕩培養(yǎng)，待菌液pH值降低至6.70～6.80時收集菌液，進行含菌量測定。

2.3 含菌量的測定

取菌種依次10倍系列稀釋，稀釋度達到10-1、10-2、10-3……10-12。再設(shè)改良 Friis培養(yǎng)基作對照，置36～38℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14日。每日觀察記錄培養(yǎng)基顏色變化和混濁度的變化。直至培養(yǎng)物pH值不發(fā)生變化，最后發(fā)生顏色變化的稀釋度即為該培養(yǎng)物的CCU滴度。并依上法測定3次。

3 結(jié)果

3.1 豬肺炎支原體CJ株接種6種培養(yǎng)基的生長時間及含菌量測定結(jié)果

將豬肺炎支原體CJ株接種不同培養(yǎng)基后在相同的條件下培養(yǎng)，其生長時間及含菌量的測定結(jié)果見表1。

表1 豬肺炎支原體CJ株接種6種培養(yǎng)基的生長時間及含菌量的測定結(jié)果

由表1中6種不同廠家豬血清配制的改良Friis培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體CJ株的生長時間可知，豬肺炎支原體CJ株在廠家1的豬血清配制的改良Friis培養(yǎng)基中生長時間為2～3日；豬肺炎支原體CJ株在廠家2、3、4、5、6的豬血清配制的改良Friis培養(yǎng)基中生長時間為3～4日。以上結(jié)果表明，由廠家1的豬血清配制的改良Friis培養(yǎng)基更適宜豬肺炎支原體CJ株的生長。

由表1中6種不同廠家豬血清配制的改良Friis培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體CJ株測定的含菌量測定結(jié)果可知，豬肺炎支原體CJ株在廠家1的豬血清配制的改良Friis培養(yǎng)基中的含菌量（以及達到最終含菌量所用時間）為 1.0×109-10CCU/ml（10日 ）， 在 2、3、4、5、6的豬血清配制的改良Friis培養(yǎng)基中的含菌量（以及達到最終含菌量所用時間）分別 為 1.0×108～ 109CCU/ml（11～ 12日 ），1.0×108CCU/ml（13日），1.0×108CCU/ml（11 ～ 12日），1.0×109CCU/ml（10～11日），1.0×108CCU/ml（13日）。以上結(jié)果表明，由廠家1的豬血清配制的改良Friis培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體CJ株的含菌量較高。

3.2 數(shù)據(jù)分析

將6種不同廠家豬血清配制的改良Friis培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體CJ株含菌量的結(jié)果進行對數(shù)化處理，并運用Prism 5.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。表2結(jié)果顯示，由廠家1的豬血清配制的培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體CJ株的含菌量較高，與廠家5的豬血清配制的培養(yǎng)基差異不顯著，與另4種廠家豬血清配制的培養(yǎng)基均有顯著差異，而另4種廠家豬血清配制的培養(yǎng)基之間無顯著差異。

4 結(jié)論

由于支原體很小而產(chǎn)量又少，所以常用的定量估計菌體的方法（如濁度、細胞容積和干重）不適用于豬肺炎支原體的定量檢測。適合一般應(yīng)用的定量測定支原體的主要方法有：濃縮培養(yǎng)物的濁度測定、用菌落計數(shù)測量活菌數(shù)和用測定變色單位測量活菌數(shù)[3、5]。CCU計數(shù)法比較直觀，其測定的是培養(yǎng)物中的活菌數(shù)，結(jié)果更具有代表性，仍是測定支原體含量的經(jīng)典方法，也是獸用生物制品目前仍采用的方法，廣泛運用于支原體的培養(yǎng)檢驗、活疫苗的保存條件檢測等，在檢測疫苗活菌數(shù)的應(yīng)用中具有不可替代的作用[6-7]。

將豬肺炎支原體CJ株接種由不同廠家豬血清配制的改良Friis培養(yǎng)基，從生長時間和含菌量測定結(jié)果可以看出，由廠家1的豬血清配制的改良Friis培養(yǎng)基培養(yǎng)豬肺炎支原體CJ株的生長時間短且含菌量高，最終選擇廠家1的豬血清作為豬肺炎支原體CJ株培養(yǎng)用血清。

表2 豬肺炎支原體CJ株接種6種培養(yǎng)基的含菌量測定結(jié)果比較