洪全興， 周嘉惠， 李 潔， 王曉陽， 張中萍， 俞 允， 魏國強， 林 多， 陳偉煒， 黃 浩

(1． 福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院, 福建 福州 350122； 2． 福州大學科技處, 福建 福州 350108； 3． 南京軍區(qū)福州總醫(yī)院醫(yī)學影像科, 福建 福州 350025； 4． 福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院, 福建 福州 350122)

0 引言

茵陳蒿湯[1]在臨床上廣泛用于肝炎治療， 現(xiàn)有的化學成分檢測方法[2](如色譜法)耗時持久. 拉曼技術具有便捷、 無損等優(yōu)點[3]， 已被用于檢測水煎液化學成分[4-5]， 但液體的強熒光背景很容易覆蓋拉曼信號. 表面增強拉曼散射(surface-enhanced Raman scattering, SERS)技術可淬滅熒光[6]， 增強拉曼信號， 實現(xiàn)高靈敏度的測量， 特別適合檢測水煎液[7].

本研究利用SERS技術結(jié)合多元統(tǒng)計算法， 包括主成分分析(principal component analysis, PCA)、 線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)和支持向量機(support vector machine, SVM)， 檢測判別兩種不同配比的茵陳蒿湯水煎液， 進而探索一種能快速檢測分析水煎液化學成分的方法， 該研究有助于水煎液質(zhì)量控制和制劑生產(chǎn)的規(guī)范化.

1 材料與方法

1.1 水煎液制備

水煎液通過合理配比， 能使不同配方成分相互增強或制約， 達到增加療效及減少毒性的目的， 因此不同配比水煎液的具體療效存在差異. 本研究中水煎液Ⅰ依據(jù)茵陳蒿湯原方[8]， 取茵陳18 g、 梔子12 g及大黃6 g加入1 000 mL水中， 煎煮2 h后過濾并收集濾液， 加熱濃縮至100 mL后冷卻至室溫. 水煎液Ⅱ為臨床常用配比， 取茵陳18 g、 梔子15 g及大黃6 g， 制成水煎液. 與水煎液Ⅰ相比， 適當增加了梔子用量， 由于梔子的主要化學成分梔子苷具有護肝、 利膽、 降壓功效， 因此可增強清熱利濕、 瀉火除煩、 涼血解毒的療效[9].

1.2 SERS檢測

1.2.1水煎液最佳SERS檢測條件的確定

首先比較不同粒徑銀納米粒子的水煎液SERS增強效果. 根據(jù)Leopold的方法[10]， 制備三種粒徑的銀納米粒子， 如圖1所示. 其中. 圖1(a)的銀納米粒子粒徑為(24±5) nm， 圖1(b)粒徑為(40±6) nm， 圖1(c)粒徑為(87±11)nm.

圖1 不同粒徑銀膠的透射電鏡圖Fig.1 TEM micrograph of Ag colloids with different particle sizes

圖2 不同粒徑大小的銀膠作用下的水煎液SERS光譜Fig.2 SERS spectra of decoction under the action of Ag colloids with different particle sizes

取10 μL水煎液分別與三種銀膠等體積混勻后滴加于載玻片上檢測SERS光譜. 785 nm半導體激光器輸出功率200 mW； 測量范圍500～1 700 cm-1， 采用萊卡50×鏡頭(數(shù)值孔徑為0.75)采集散射信號， 光斑直徑約10 μm， 光譜分辨率為2 cm-1， 積分時間10 s. 每種樣品均隨機位置檢測3條譜線， 并計算平均譜作為該樣品的SERS光譜， 所得譜線如圖2所示. 粒徑40 nm的銀納米粒子與水煎液混合后的SERS光譜具有最佳的拉曼峰強度及信噪比， 故后續(xù)研究將采用該粒徑的納米粒子.

其次探究銀膠和水煎液不同體積比混合后的SERS檢測效果(如圖3所示). 從圖3可見， 水煎液與銀膠等體積混合后檢測獲取的SERS光譜信噪比最好， 故后續(xù)研究均采用10 μL水煎液與銀膠等體積混合.

SERS增強效果的實現(xiàn)需滿足一個前提條件， 就是檢測樣本要有效地附著在拉曼信號增強基底表面. 水煎液的拉曼信號增強主要是由激發(fā)光子與銀納米粒子表面的電子產(chǎn)生共振所引起的. 銀納米粒子表面的自由電子在入射光作用下產(chǎn)生運動， 形成表面等離子激元共振， 此時在銀粒子表面形成巨大的局域電磁場， 從而顯著增強附著在銀納米粒子表面的水煎液分子的拉曼信號.

圖3 銀膠與水煎液不同體積比混合后的SERS光譜Fig.3 SERS spectra of decoction mixed with different volume of Ag colloids

圖4 同一水煎液樣本不同時間檢測獲取的SERS光譜Fig.4 Time-resolved SERS spectra recorded at 1 min intervals at a same decoction sample

進一步分析水煎液SERS檢測的重復性及穩(wěn)定性. 取10 μL水煎液與等體積銀膠混勻后滴加于載玻片上， 以1 min為間隔， 先后檢測樣本10個不同位置的SERS光譜， 所得譜線如圖4所示. 從圖4可以看出， 由于檢測過程中樣本處于液態(tài)， 故所得譜線的重復性及穩(wěn)定性較好.

1.2.2兩種水煎液SERS檢測分析

水煎液Ⅰ和水煎液Ⅱ分別取10 μL與銀膠等體積混勻后滴加于載玻片上檢測SERS光譜. 檢測條件如前所述. 兩種水煎液均檢測50個樣品， 每個樣品均隨機位置檢測3條譜線， 并計算平均譜作為該樣品的SERS光譜.

1.3 數(shù)據(jù)分析

首先對原始數(shù)據(jù)進行熒光背景扣除、 歸一化等處理[11], 隨后將光譜數(shù)據(jù)導入SPSS 15.0(SPSS Inc., Chicago)進行PCA處理， 進而獲取具有顯著性差異(P<0.05)的主成分[12]. 再進一步通過LDA和SVM算法對獲取的主成分進行判別分析， 其中LDA選擇留一交叉驗證法(leave-one-out cross-validation method)； 而SVM的核函數(shù)為高斯徑向基函數(shù)(Gaussian radial basis function)[12].

2 結(jié)果與討論

兩種水煎液的SERS光譜對比如圖5所示. 水煎液Ⅰ和Ⅱ的具體SERS光譜峰位置及其初步歸屬如表1[6-7]所示 . 兩種水煎液SERS譜峰極為相似， 表明兩種水煎液所包含的生化物質(zhì)成分基本相同. 兩種水煎液的SERS光譜強度差異如圖5 差譜曲線所示， 即便是水煎液Ⅰ和Ⅱ的SERS光譜中均出現(xiàn)的拉曼峰， 其峰強度也不一致. 兩種水煎液的SERS光譜如圖6所示， 其中623、 734、 961及1 331 cm-1等拉曼峰的強度都存在顯著性差異(P< 0.05). 這一結(jié)果表明， 兩種水煎液中相同化學成分的具體含量也有所區(qū)別. 此外， 水煎液Ⅰ和Ⅱ所用藥物種類相同， 只是藥物用量存在差異， 但是測得的拉曼峰位也存在區(qū)別. 如654和1 517 cm-1拉曼峰只存在于水煎液Ⅰ的SERS光譜中， 而1 002 cm-1峰只存在于水煎液Ⅱ的SERS光譜中. 這可能是由于藥物在煎煮過程中所含化學成分發(fā)生反應， 因藥物配比不同， 故反應生成的復合物中成分含量及種類存在細微區(qū)別， 而高靈敏度的SERS光譜可檢測到這些差異.

圖5 水煎液SERS光譜Fig.5 SERS spectra of decoction

圖6 兩種水煎液的SERS譜峰強度柱狀圖(*代表P<0.05)Fig.6 Histogram displaying the prominent differences of SERS peak intensities for two kinds of decoction (*P<0.05)

表1 水煎液SERS光譜的譜峰及歸屬[6-7]

圖7 水煎液SERS光譜主成分的三維分布圖Fig.7 A three-dimensional mapping of the principal components for the decoction

PCA算法可針對全部SERS光譜進行分析[13-14]. 對經(jīng)PCA后提取的主成分進行t檢驗， 可得出主成分1、 2、 3最具有診斷意義[15]. 三個主成分的光譜貢獻率分別為49.82%、 22.16%以及13.65%， 累計貢獻率達85.63%. 利用主成分1、 2、 3繪制的三維散點圖如圖7所示. 圖7中， 代表水煎液Ⅰ和水煎液Ⅱ的數(shù)據(jù)點分布在三維圖中可較好地區(qū)分. 進一步利用LDA及SVM建立判別模型用于區(qū)分兩種水煎液， 所得結(jié)果如表2所示， 判別區(qū)分的靈敏度、 特異性、 正確率均為100%. 該結(jié)果表明， PCA算法提取主成分后再結(jié)合LDA以及SVM可有效地區(qū)分水煎液Ⅰ和Ⅱ的SERS光譜.

表2 LDA及SVM判別區(qū)分水煎液

3 結(jié)語

采用SERS技術檢測分析茵陳蒿湯水煎液化學成分. SERS技術結(jié)合PCA、 LDA和SVM可有效區(qū)分兩種水煎液， 判別正確率為100%. 該研究表明SERS技術可實現(xiàn)對水煎液化學成分的快速檢測與鑒別， 可用于水煎液的品質(zhì)監(jiān)督與管控.