寧 奇， 孫培冬*， 曹光群， 張 晨， 鄔鳳娟

（1．江南大學(xué) 化學(xué)與材料工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2．無限極（中國）有限公司，廣東 江門 529156）

山藥具有很高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值，現(xiàn)代藥理研究表明山藥具有多種生物活性，山藥的開發(fā)利用具有巨大潛力[1-10]。

粗提的植物多糖中蛋白質(zhì)為主要雜質(zhì)，蛋白質(zhì)的存在不僅會導(dǎo)致多糖純度的下降，而且會干擾多糖性能的測定。酶法脫蛋白質(zhì)優(yōu)于Sevage法、三氯乙酸（TCA）法等常用脫蛋白質(zhì)方法，其反應(yīng)條件溫和，同時(shí)具有較高的蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率。作者以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，以蛋白脫除率和多糖保留率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化山藥粘液質(zhì)多糖的脫蛋白質(zhì)工藝條件，并對純化后的山藥粘液質(zhì)多糖的抗氧化活性和保濕性進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山藥：市售；牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶：均為生物試劑。

1.2 主要儀器設(shè)備

TU-1900雙光束紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；LyoQuest-85冷凍干燥機(jī)：西班牙泰事達(dá)公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山藥粘液質(zhì)多糖的提取將新鮮山藥洗凈去皮后切片，稱重，加入組織搗碎機(jī)中，按0.5 mL/g的比例加入去離子水，粉碎10 min，得山藥勻漿；將山藥勻漿稱重后用高速離心機(jī)離心，速度為8 000 r/min，時(shí)間為40 min；離心后取上層清液，得山藥粘液質(zhì)原液。

取適量山藥粘液質(zhì)原液于燒杯中，向燒杯中加入4倍體積的無水乙醇，邊緩慢加入、邊攪拌，將攪勻后的混合溶液置于4℃的冰箱中，沉降過夜，離心取下層沉淀，沉淀用無水乙醇洗兩次，丙酮洗1次，將洗后的沉淀放入真空干燥箱中于45℃干燥4 h，得山藥粘液質(zhì)粗多糖。

1.3.2 脫蛋白質(zhì)工藝評價(jià)方法采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，以牛血清蛋白的質(zhì)量濃度c（mg/mL）為橫坐標(biāo)，595 nm處所測得的吸光度為縱坐標(biāo)，得到牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；采用苯酚-濃硫酸法測定樣品中多糖質(zhì)量濃度，以葡萄糖的質(zhì)量濃度c（mg/mL）為橫坐標(biāo)，490 nm處所測得的吸光度為縱坐標(biāo)，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程[11]。

評價(jià)脫蛋白質(zhì)方法的兩個(gè)主要指標(biāo)為蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率，其計(jì)算方法如公式（1）和（2）所示；綜合評分的計(jì)算方法如公式（3）所示。

式中：W1為蛋白質(zhì)脫除率（%），m1為脫蛋白質(zhì)后多糖質(zhì)量，m2為脫蛋白前多糖質(zhì)量。

式中，W2為多糖保留率（%），m3為脫蛋白質(zhì)后多糖質(zhì)量，m4為脫蛋白前多糖質(zhì)量。

式中：A為綜合評分，W1，max為蛋白脫除率中最大值，W2，max為多糖保留率中最大值。

1.3.3 酶解條件單因素實(shí)驗(yàn)比較4種蛋白酶脫蛋白效果，確定較優(yōu)蛋白酶；在該蛋白酶的最適溫度下分別考察pH、酶底質(zhì)量比、時(shí)間和液料體積質(zhì)量比對蛋白脫除率和多糖保留率的綜合影響，以此來確定響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對蛋白脫除率和多糖保留率的綜合評價(jià)結(jié)果影響差異性最顯著的3個(gè)因素為變量，以綜合評分為響應(yīng)值，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析[11-12]；固定其余酶解的條件。

采用Design-Expert系統(tǒng)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，建立綜合評分與各因素關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，并通過對模型的分析來獲得較優(yōu)的酶解工藝條件。

1.3.5 抗氧化活性的測定參考文獻(xiàn)[13-15]測定山藥粘液質(zhì)多糖對DPPH自由基、OH自由基和過氧化氫的清除效果，分析山藥粘液質(zhì)的抗氧化活性[16]。

1.3.6 保濕性研究

1）吸濕率 準(zhǔn)確稱取山藥粘液質(zhì)和透明質(zhì)酸鈉各0.100 g，每種樣品需做3份平行，將樣品放入相對濕度為43%的密閉容器內(nèi)吸濕，放入后開始計(jì)時(shí)，每6 h稱重1次，分別計(jì)算各個(gè)時(shí)間下的吸濕率。使用同樣的方法測定相對濕度為81%的環(huán)境下的吸濕率與時(shí)間的關(guān)系。

式中：W3為吸濕率（%），D0為吸濕前樣品的質(zhì)量；D1為吸濕后樣品的質(zhì)量。

2）保濕率 分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的山藥粘液質(zhì)多糖和透明質(zhì)酸鈉溶液；準(zhǔn)確稱取配制好的溶液各0.300 g，每種樣品需做3份平行，將樣品放入相對濕度為43%的密閉容器內(nèi)保濕，放入后開始計(jì)時(shí)，每6 h稱重1次，分別計(jì)算各個(gè)時(shí)間下的吸濕率；使用同樣的方法測定相對濕度為81%的環(huán)境下的保濕率與時(shí)間的關(guān)系。

式中：W4為保濕率（%），H0為保濕劑中水分初始質(zhì)量；H1為保濕劑中水分最終質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈線性相關(guān)，如圖1（a）所示，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=5.255x+0.067 3（R2=0.999 8）；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)驗(yàn)濃度下呈線性相關(guān)，如圖1（b）所示，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=11.38x+0.063 8（R2=0.999 5）。

2.2 蛋白酶種類篩選

分別在4種不同蛋白酶的最佳酶解條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)，如圖2所示，胰蛋白酶是這4種蛋白酶中的最優(yōu)蛋白酶。

圖1 蛋白質(zhì)和葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of protein and glucose

2.3 酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)

如圖3所示，蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率均隨酶底質(zhì)量比的增大而增加，酶底質(zhì)量比為30%時(shí)效果最佳；pH、時(shí)間和液料體積質(zhì)量比對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的綜合影響較為顯著。因此固定酶底質(zhì)量比為30%，選定pH、時(shí)間和液料體積質(zhì)量比為變量，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。變量 pH（A）、時(shí)間（B）和液料體積質(zhì)量比（C）的因素水平見表1。

圖2 酶法脫蛋白質(zhì)結(jié)果Fig.2 Deproteinization effect by enzyme method

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

采用Design Expert 8.0.6軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到二次多項(xiàng)回歸模型方程，綜合評價(jià)用Y表示，則回歸模型的方程式為：

2.4.2 交互作用對綜合評分的影響圖4～6為pH、時(shí)間和液料質(zhì)量體積比之間的交互影響的等高圖和響應(yīng)面。

2.4.3 響應(yīng)面回歸模型的方差分析為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性，進(jìn)一步確定各因素對山藥粘液質(zhì)多糖酶解脫蛋白質(zhì)的影響，對回歸模型進(jìn)行了方差分析，結(jié)果見表3，由表可知，模型的F=132.88，模型顯著；P（＜0.000 1）＜0.01，差異極顯著；失擬項(xiàng)的P=0.012 2，顯著；決定系數(shù)R2=0.9867，說明響應(yīng)值的變化有98%以上來源于所選因素，模型擬合度好，回歸方程能很好的描述各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，該試驗(yàn)方法可靠。

在以上的回歸模型中，一次項(xiàng)的有A、C，二次項(xiàng)、A2、B2和C2的P值均小于 0.01，說明 pH、液料比以及3個(gè)因素的二次項(xiàng)都具有顯著影響。二次項(xiàng)AC、BC的P值小于0.01，說明pH與液料體積質(zhì)量比的相互影響、時(shí)間與液料體積質(zhì)量比的相互影響都極為顯著。B的P值小于0.05，大于0.01，說明時(shí)間的影響顯著。AB的P值大于0.05，說明pH與時(shí)間的相互影響較小。一次項(xiàng)中各因素對山藥粘液質(zhì)酶解影響顯著性大小順序是：pH＞液料體積質(zhì)量比＞時(shí)間。通過響應(yīng)面優(yōu)化得出最佳酶解條件為pH=8.0，時(shí)間2.0 h，液料體積質(zhì)量比80 mL/g，酶底質(zhì)量比30%，溫度37℃；該條件下的蛋白質(zhì)脫除率為83.4%，多糖保留率為92.7%。

圖3 pH、酶底質(zhì)量比、時(shí)間和液料體積質(zhì)量比對蛋白質(zhì)脫除率和多糖保留率的影響Fig.3 Effects of pH，E/S ratio，time and liquid-to-solid ratio on protein removal rate and the polysaccharide retention time

表1 因素水平表Table 1 Factor level table

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and the result

圖4 pH和時(shí)間對綜合評分交互作用的等高圖和響應(yīng)面圖Fig.4 Contour plots and response surface showing the effect of pH and time on the comprehensive score

圖5 pH和液料體積質(zhì)量比對綜合評分交互作用的等高圖和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour plots and response surface showing the effect of pH and liquid-to-solid ratio on the comprehensive score

圖6 時(shí)間和液料體積質(zhì)量比對綜合評分交互作用的等高圖和響應(yīng)面圖Fig.6 Contour plots and response surface showing the effect of time and liquid-to-solid ratio on the comprehensive score

2.5 抗氧化活性的測定

由圖7可知，山藥粘液質(zhì)多糖對DPPH自由基清除能力較強(qiáng)，其IC50值為1.10 mg/mL，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到80.9%；山藥粘液質(zhì)多糖清除過氧化氫的能力較強(qiáng)，其IC50值為0.24 mg/mL，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到87.0%；山藥粘液質(zhì)多糖清除OH自由基的能力較弱，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到8.0 mg/mL時(shí)，其OH自由基的清除率曲線逐漸趨于平緩，此時(shí)的OH自由基清除率只有32.5%。

2.6 保濕性研究

2.6.1 吸濕率如圖8（a）所示，當(dāng)相對濕度為43%，開始時(shí)透明質(zhì)酸鈉的吸濕率略高于山藥粘液質(zhì)多糖，當(dāng)時(shí)間大于48 h，山藥粘液質(zhì)多糖的吸濕率略高于透明質(zhì)酸鈉；如圖8（b）所示，當(dāng)相對濕度為81%時(shí)，山藥粘液質(zhì)多糖的吸濕率略高于透明質(zhì)酸鈉的吸濕率。

表3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)回歸方程的方差分析Table 3 ANOVA analysis of the fitted quadratic polynomial model

圖7 山藥粘液質(zhì)多糖DPPH自由基、OH自由基和H2O2清除能力Fig.7 DPPH radical、OH radicalandH2O2radical scavenging capacities of yam mucilage polysaccharide

圖8 相對濕度為43%和81%時(shí)吸濕率與時(shí)間的關(guān)系Fig.8 Moisture absorption rate with time at 43%and81%relative humidity

2.6.2 保濕率當(dāng)相對濕度為43%時(shí)，山藥粘液質(zhì)多糖和透明質(zhì)酸鈉的保濕率相近；當(dāng)相對濕度為81%時(shí)，山藥粘液質(zhì)多糖的保濕率略高于透明質(zhì)酸鈉。

3 結(jié) 語

響應(yīng)面法優(yōu)化山藥粘液質(zhì)多糖脫蛋白工藝結(jié)果表明，最佳脫蛋白工藝為pH 8.0，時(shí)間2.0 h，液料體積質(zhì)量比80 mL/g，酶底質(zhì)量比30%，溫度37℃；該條件下的蛋白質(zhì)脫除率為83.4%，多糖保留率為92.7%。研究表明，山藥粘液質(zhì)多糖具有抗氧化活性，其對DPPH自由基和過氧化氫的清除率均可達(dá)到80%以上，對OH自由基的清除能力較弱。當(dāng)相對濕度為43%時(shí)，透明質(zhì)酸鈉和山藥粘液質(zhì)多糖的吸濕率和保濕率接近，當(dāng)相對濕度為81%時(shí)，山藥粘液質(zhì)多糖的吸濕率和保濕率均略高于透明質(zhì)酸鈉，山藥粘液質(zhì)多糖的綜合保濕性能略優(yōu)于透明質(zhì)酸鈉。因此，將山藥粘液質(zhì)多糖應(yīng)用于化妝品中，可以得到比透明質(zhì)酸鈉保濕性更好的產(chǎn)品。