沒食子酸酯類化合物對(duì)食品中1,2-二羰基產(chǎn)物的清除效果

王佳琦，肖留榜，王 茜，章鼎敏，鄭鐵松，呂麗爽*

（南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210097）

20世紀(jì)以來，因1,2-二羰基化合物（乙二醛（glyoxal，GO）、甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO））對(duì)生物體健康存在一定毒害作用，受到食品、醫(yī)藥領(lǐng)域廣泛關(guān)注。GO與MGO結(jié)構(gòu)如圖1所示。GO、MGO均具有細(xì)胞毒性，GO能抑制細(xì)胞中DNA的合成，并可損傷線粒體功能[1]，MGO則通過特定的凋亡信號(hào)引起細(xì)胞凋亡[2-3]。此外，GO、MGO屬于高反應(yīng)活性糖基化因子[4]，因而可與氨基酸及蛋白質(zhì)的游離氨基發(fā)生反應(yīng)形成一系列不可逆轉(zhuǎn)、穩(wěn)定的晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）。AGEs在體內(nèi)會(huì)引起羰基應(yīng)激和氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致組織損傷[5]，損害機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘發(fā)糖尿病及糖尿病并發(fā)癥[6]、阿爾茨海默癥[7]、動(dòng)脈粥樣硬化[8]等。

圖1 GO（A）與MGO（B）的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structures of GO (A) and MGO (B)

GO和MGO的來源主要分為內(nèi)源性和外源性，內(nèi)源性GO和MGO的來源包括體內(nèi)糖降解、非酶糖化、丙酮體內(nèi)代謝及氨基丙酮氧化分解等；外源性GO和MGO的來源主要為蛋白質(zhì)和糖含量高的加工類食品及飲料，如曲奇餅干、蛋糕、酸奶、蜂蜜等[9-11]。食品經(jīng)熱加工處理或長(zhǎng)期貯藏中發(fā)生的Maillard反應(yīng)[12]、油脂的氧化[13]、焦糖化反應(yīng)[14]以及微生物發(fā)酵過程[15]均能導(dǎo)致食物中1,2-二羰基化合物含量增高。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于清除1,2-二羰基化合物的研究主要集中于天然黃酮類、酚酸類物質(zhì)[16]。Wu等[17]發(fā)現(xiàn)蘆丁和木犀草素對(duì)MGO及AGEs有清除效果，部分歸因于黃酮類化合物的抗氧化性。此外，白藜蘆醇也被報(bào)道有清除MGO活性的作用[18]。Liu Guimei等[19]發(fā)現(xiàn)槲皮素不僅可以捕獲MGO，而且其與MGO的加合產(chǎn)物仍有清除α-羰基化合物的能力。Sang Shengmin[20]、Shao Xi[21]及Lü Lishuang[22]等研究表明，兒茶素、根皮素、根皮苷可以有效地捕獲體系中GO或MGO，與其形成相應(yīng)的加合產(chǎn)物，進(jìn)而清除由GO、MGO介導(dǎo)的蛋白質(zhì)糖基化形成的AGEs；盡管黃酮、酚酸類物質(zhì)大多為天然活性產(chǎn)物，有良好的清除效果，但考慮到黃酮類化合物尚未獲批為食品添加劑被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，且溶解性、穩(wěn)定性不佳，以及部分色澤鮮艷及具有特殊氣味，使得其應(yīng)用存在局限性。因此，尋找在食品中能廣泛使用的GO、MGO清除劑，對(duì)減少外源性1,2-二羰基化合物的攝入、提高食品安全性、預(yù)防因不良飲食引發(fā)慢性疾病具有重要理論和現(xiàn)實(shí)意義。

具有優(yōu)良抗氧化活性的沒食子酸酯類物質(zhì)由沒食子酸與相應(yīng)的醇酯化反應(yīng)生成，碳鏈的延長(zhǎng)使其脂溶性與安全性得到增強(qiáng)[23]，其中可作為食品抗氧化劑的沒食子酸酯類包括沒食子酸丙酯（propyl gallate，PG）、沒食子酸辛酯（octyl gallate，OG）、沒食子酸十二烷酯（dodecyl gallate，DG）等，PG、OG、DG的結(jié)構(gòu)式見圖2。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于沒食子酸酯類物質(zhì)的研究主要集中在抗氧化活性、抑菌活性以及分析檢測(cè)方面[23-25]。Shao Xi等[26]研究發(fā)現(xiàn)沒食子酸清除MGO的能力較差，37 ℃條件下沒食子酸與MGO反應(yīng)24 h后，對(duì)MGO的清除率僅為14.9%，但對(duì)焦沒食子酸清除率達(dá)90%；而關(guān)于沒食子酸酯類物質(zhì)PG、OG、DG對(duì)GO、MGO的清除能力及作用機(jī)理有待進(jìn)一步考證。本課題組前期研究了PG對(duì)MGO的捕獲機(jī)理[27]，本實(shí)驗(yàn)側(cè)重研究PG、OG、DG對(duì)GO、MGO的作用活性，考察影響PG、OG、DG清除GO、MGO的因素，以及其在食品中的具體應(yīng)用。

圖2 PG（A）、OG（B）和DG（C）的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 2 Chemical structures of PG (A), OG (B) and DG (C)

本研究通過氣相色譜法探究食品添加劑沒食子酸酯類物質(zhì)（PG、OG、DG）對(duì)1,2-二羰基化合物的清除率，考察清除劑濃度、反應(yīng)體系pH值、反應(yīng)溫度與時(shí)間對(duì)PG、OG、DG清除GO和MGO效果的影響。此外，選擇蛋白、糖及油脂含量高的休閑類烘烤食品曲奇餅干，驗(yàn)證PG、OG、DG對(duì)GO和MGO的清除效果，并采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）技術(shù)分析曲奇餅干中PG、OG、DG清除GO和MGO的途徑及機(jī)制，以期為調(diào)控食物加工貯藏過程中有害物質(zhì)（GO、MGO）含量提供有效的理論指導(dǎo)，從而保障食品安全。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞蛋、黃油及白砂糖購(gòu)自南京鼓樓區(qū)蘇果超市；高筋小麥粉及低筋小麥粉購(gòu)自深圳南海糧食工業(yè)有限公司。

MGO（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%溶液）、GO（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%溶液）、鄰苯二胺（分析純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；OG、DG（分析純） 日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；PG、2,3-丁二酮、乙醛、乙酸、二氯甲烷、葡萄糖、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純） 上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；精氨酸 上海生工生物工程有限公司。除特殊說明外，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

7820A氣相色譜儀（HP-5色譜柱、火焰離子化檢測(cè)器）、1290/6460 Triple Quad LC/MS HPLC-MS/MS儀美國(guó)Agilent公司；CentriVap離心濃縮儀 美國(guó)Labconco公司；Biofuge Stratos離心機(jī)、ULT1386-3V型超低溫冰箱美國(guó)Thermo Scientific公司；SHZ-82型水浴振蕩器 常州華怡儀器制造有限公司；HH-S型恒溫油浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；KQ-300B型超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；AUY220型分析天平 日本島津公司；PHS-3C型數(shù)字式pH計(jì) 上海三信儀表廠；XW-80A型微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；YXP 101-2型商用電烤爐 上海早苗食品有限公司；FW177型高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜法分析GO、MGO的含量

氣相色譜條件參照本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[28]，衍生化方法優(yōu)化如下：于樣品管內(nèi)依次加入1 mL待測(cè)反應(yīng)液、0.5 mL 0.1 mmol/L 2,3-丁二酮（內(nèi)標(biāo)）及1 mL 0.1 mol/L鄰苯二胺（衍生化試劑），漩渦混勻，37 ℃水浴振蕩60 min，冰浴后加入1 mL 2 mol/L乙醛，混勻，37 ℃水浴振蕩60 min，冰浴后加入3 mL二氯甲烷，漩渦混勻、超聲萃取2 次。離心濃縮至干，加入200 μL二氯甲烷復(fù)溶，取1 μL進(jìn)行氣相色譜儀檢測(cè)。按下式計(jì)算清除率。

1.3.2 HPLC-MS/MS分析PG、OG、DG結(jié)構(gòu)變化

1.3.2.1 HPLC條件

Kromasil100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；紫外檢測(cè)器；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；流動(dòng)相流速0.6 mL/min；流動(dòng)相A：水，流動(dòng)相B：乙腈，流動(dòng)相C：甲醇。PG洗脫程序：0～3 min，30% C；3～20 min，30%～70% C；20～30 min，70% C。OG洗脫程序：0～3 min，70% B；3～10 min，70%～80% B；10～13 min，80%～100% B；13～19 min，100%～30% B；19 min，30% B。DG洗脫程序：0～3 min，90% B；3～15 min，90%～100% B；15～16 min，100% B。

1.3.2.2 MS/MS條件

電噴霧負(fù)離子模式電離，MS1為MS2Scan模式，MS2為Product Ion模式，掃描范圍為m/z 100～500；噴霧電壓3 500 kV；霧化氣壓力45 psi；輔助氣壓力5 psi；相對(duì)碰撞能量20 eV；毛細(xì)管溫度300 ℃；裂解電壓200 eV；氣體流速5.1 L/min。數(shù)據(jù)采集使用Masshunter軟件進(jìn)行定性分析。

1.3.3 影響PG、OG、DG清除GO、MGO效果的因素分析

1.3.3.1 PG、OG、DG濃度對(duì)清除GO、MGO效果的影響

向玻璃小瓶中分別加入2.0 mL濃度分別為0.01、0.1、1.0、2.0、4.0 mmol/L的PG（或OG、DG）甲醇溶液和2.0 mL 0.1 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（含0.33 mmol/L GO或MGO），漩渦混勻，90 ℃油浴鍋中避光反應(yīng)30 min后迅速取出置于冰水浴中冷卻。對(duì)照組為GO/MGO溶液和甲醇溶液（無PG/OG/DG）的反應(yīng)液。取1.0 mL樣品按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定并計(jì)算體系中GO或MGO清除率。每個(gè)樣品做3 組平行。

1.3.3.2 pH值對(duì)PG、OG、DG清除GO、MGO效果的影響

向玻璃小瓶中分別加入pH值為5.5、6.5、7.0、8.0的PBS配制的0.33 mmol/L GO（或MGO）溶液2.0 mL，加入1.0 mmol/L的PG（或OG、DG）甲醇溶液2.0 mL，漩渦混勻，在90 ℃油浴鍋中避光反應(yīng)30 min后迅速取出置于冰水浴中冷卻。取1.0 mL樣品按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定并計(jì)算體系中GO或MGO清除率。每個(gè)樣品做3 組平行。

1.3.3.3 不同反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間對(duì)PG、OG、DG清除GO、MGO的影響

向玻璃小瓶中分別加入2.0 mL 0.1mol/L pH 7.0的PBS（含0.33 mmol/L GO或MGO）和2.0 mL 1.0 mmol/L PG（或OG、DG）甲醇溶液，漩渦混勻后分成3 個(gè)溫度處理組，分別為：90 ℃水浴加熱5、10、15、30、40 min；60 ℃水浴加熱10、30、60、120、240 min；25 ℃水浴鍋中避光反應(yīng)1、2、3、5、8 d。加熱后迅速取出置于冰水浴中冷卻。取1.0 mL樣品按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定并計(jì)算體系中GO或MGO清除率。每個(gè)樣品做3 組平行。

1.3.4 PG、OG、DG對(duì)氨基酸-糖體系中GO、MGO形成的影響

1.3.4.1 精氨酸-葡萄糖體系中GO、MGO形成過程研究

向耐高溫玻璃小瓶中分別加入2 mL 180 mmol/L精氨酸溶液（0.2 mol/L、pH 7.0的PBS配制）和2 mL 180 mmol/L葡萄糖溶液（0.2 mol/L、pH 7.0的PBS配制），再加入2 mL PBS使其終體積為6 mL。漩渦混勻后170 ℃油浴加熱，分別反應(yīng)0、5、15、30、40、60 min后迅速取出置于冰水浴中冷卻。取1.0 mL樣品按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定并計(jì)算體系中GO或MGO清除率。每個(gè)樣品做3 組平行。

1.3.4.2 PG、OG、DG對(duì)精氨酸-葡萄糖體系中形成的GO、MGO清除效果的影響

參考文獻(xiàn)[19]方法，將1.3.4.1節(jié)中的2 mL PBS替換成2 mL濃度為5、20、100、200 μmol/L PG（或OG、DG）甲醇溶液，漩渦混勻，170 ℃油浴加熱30 min后迅速取出，置于冰水浴中冷卻。取1.0 mL樣品按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定并計(jì)算體系中GO或MGO清除率。每個(gè)樣品做3 組平行。

1.3.5 PG、OG、DG清除曲奇餅干中GO、MGO的能力及機(jī)制分析

1.3.5.1 曲奇樣品的制備

稱取兩份54 g黃油，加熱融化后，向?qū)嶒?yàn)組黃油中添加5.4 mg PG（或OG、DG），對(duì)照組不添加，分別融化攪拌均勻后，加入40 g高筋面粉與20 g低筋面粉，充分?jǐn)嚢韬螅湃腭鸦ù鼣D至烤盤，每個(gè)曲奇質(zhì)量為5 g。之后置于烤箱，上火180 ℃，下火170 ℃，烘烤15 min。

1.3.5.2 PG、OG、DG清除曲奇餅干中GO、MGO的活性分析

稱取1 g粉碎的曲奇樣品置于15 mL離心管中，加入5 mL蒸餾水，漩渦混合3 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液。向離心管中再加入5 mL、體積分?jǐn)?shù)50%甲醇水溶液，漩渦混合后超聲萃取1 h，8 000 r/min離心10 min，取出上清液。兩次上清液合并均勻后，取出3 mL樣品按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定并計(jì)算體系中GO或MGO清除率。每個(gè)樣品做3 組平行。

1.3.5.3 HPLC-MS/MS分析曲奇餅干中PG、OG、DG清除GO、MGO的機(jī)制

稱取30 g曲奇樣品，置于250 mL錐形瓶，加入120 mL甲醇，磁力攪拌提取2 h，離心濃縮后過濾膜收集濾液備用，按照1.3.2節(jié)方法進(jìn)行HPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)均做3 組平行，采用Excel 2013軟件作圖，SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan’s檢驗(yàn)，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PG、OG、DG濃度對(duì)清除GO和MGO能力的影響

圖3 不同濃度PG、OG、DG對(duì)GO（A）和MGO（B）的清除效果Fig. 3 Scavenging effects of different concentrations of PG, OG and DG on GO (A) and MGO (B)

由圖3可知，PG、OG、DG對(duì)GO、MGO的清除效果均隨著濃度的升高而增強(qiáng)。當(dāng)清除劑終濃度由0.05 mmol/L提高至0.5 mmol/L時(shí)，對(duì)GO、MGO的清除率顯著增加，終濃度0.5 mmol/L PG、OG、DG對(duì)GO的清除率分別為70.5%、64.8%、58.5%，對(duì)MGO的清除率分別為67.6%、61.3%、51.8%，對(duì)MGO清除效果略低于GO。此外，在相同的添加濃度下，3 種清除劑的清除效果為PG＞OG＞DG，推測(cè)應(yīng)為隨著沒食子酸烷基酯（PG、OG、DG）碳鏈的增長(zhǎng)，空間位阻增大，相應(yīng)減少了活性位點(diǎn)與1,2-二羰基化合物的接觸，進(jìn)而影響了清除效果。

2.2 體系pH值對(duì)PG、OG、DG清除GO和MGO能力的影響

pH值是影響酚酸類化合物捕獲二羰基化合物的重要因素[29-30]。如圖4所示，隨著pH值增大（5.5～8.0），3 種清除劑對(duì)GO、MGO的清除率顯著升高（P＜0.05），當(dāng)pH值為8.0時(shí)，PG、OG、DG對(duì)GO和MGO的清除率均達(dá)75%以上，其中PG對(duì)GO的清除率為89.1%，為pH 5.5時(shí)（22.3%）的4.0 倍。Cui Hengqing等[27]研究發(fā)現(xiàn)，PG捕獲MGO是通過由酚羥基鄰位的苯環(huán)碳進(jìn)攻MGO的不飽和碳碳雙鍵，發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，而邁克爾加成反應(yīng)更易發(fā)生于堿性條件，因此相比于酸性條件，中性及堿性條件下酚酸類化合物清除二羰基化合物效果更好。

圖4 不同pH值下PG、OG、DG對(duì)GO（A）、MGO（B）的清除效果Fig. 4 Scavenging effects of PG, OG and DG on GO (A) and MGO (B)under different pH levels

2.3 反應(yīng)溫度與時(shí)間對(duì)PG、OG、DG清除GO、MGO能力的影響

2.3.1 加熱條件下反應(yīng)時(shí)間對(duì)PG、OG、DG清除GO、MGO能力的影響

2.3.1.1 90 ℃條件下反應(yīng)時(shí)間對(duì)PG、OG、DG清除GO、MGO能力的影響

如圖5所示，90 ℃反應(yīng)條件下，0～15 min內(nèi)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，清除劑對(duì)GO、MGO的清除率快速增加，其中反應(yīng)5 min時(shí)PG對(duì)GO的清除率已達(dá)30.4%，但對(duì)MGO的清除率僅為15.3%；15 min以后清除率上升變緩，30 min后逐漸趨于穩(wěn)定。整個(gè)過程中，清除效果為PG＞OG＞DG。

圖5 90 ℃條件下PG、OG、DG對(duì)GO（A）、MGO（B）的清除效果Fig. 5 Scavenging effects of PG, OG and DG on GO (A) and MGO (B)at 90 ℃

2.3.1.2 60 ℃條件下反應(yīng)時(shí)間對(duì)PG、OG、DG清除GO、MGO能力的影響

60 ℃中溫加熱條件下，隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)（0～240 min），PG、OG、DG對(duì)GO、MGO清除率不斷升高，并且3 種清除劑的清除效果差別越來越大。30 min內(nèi)，OG、DG對(duì)GO清除率僅相差0.2%，但240 min時(shí)已相差15.9%；相比于OG、DG，PG具有更高的清除GO、MGO能力。此外，PG、OG、DG對(duì)GO的清除效果優(yōu)于MGO，在加熱240 min時(shí)，PG、OG、DG對(duì)GO的清除率分別為81.9%、76.2%、60.1%，而對(duì)MGO的清除率則為65.1%、58.8%、42.4%。

圖6 60 ℃條件下PG、OG、DG對(duì)GO（A）、MGO（B）的清除效果Fig. 6 Scavenging effects of PG, OG and DG on GO (A) and MGO (B)at 60 ℃

2.3.2 室溫條件下反應(yīng)時(shí)間對(duì)PG、OG、DG清除GO、MGO能力的影響

圖7 室溫條件（25 ℃）下PG、OG、DG對(duì)GO（A）、MGO（B）的清除效果Fig. 7 Scavenging effects of PG, OG and DG on GO (A) and MGO (B)at 25 ℃

富含蛋白質(zhì)和還原糖的食品在貯藏過程中也易發(fā)生美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生晚期糖基化終末產(chǎn)物及其中間產(chǎn)物GO、MGO[9,31]，從而降低食品的品質(zhì)和安全性，因此本實(shí)驗(yàn)在室溫貯藏（25 ℃）條件下，考察PG、OG、DG對(duì)GO、MGO的清除效果。如圖7所示，隨著反應(yīng)時(shí)間（0～8 d）的延長(zhǎng)，PG、OG、DG對(duì)GO、MGO的清除率不斷增加。0～2 d時(shí)3 種清除劑清除GO、MGO的能力均差異不大，3 d后差異逐漸明顯，第8天時(shí)PG對(duì)GO、MGO的清除率分別為82.8%、69.1%，分別為DG對(duì)GO、MGO清除能力的3.4、4.9 倍。對(duì)比來看，3 種清除劑對(duì)GO的清除效果整體高于對(duì)MGO的清除效果，對(duì)GO、MGO清除效果由強(qiáng)至弱為PG＞OG＞DG?？梢奝G更適宜用作GO、MGO的長(zhǎng)效清除劑。

前文的分析中，詳細(xì)描述了這種列車網(wǎng)絡(luò)通信故障產(chǎn)生的原因，既有線路通信質(zhì)量的原因，又有源設(shè)備與RPT配合的原因。根據(jù)筆者的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，給出針對(duì)這種故障的解決方案。

2.4 PG、OG、DG對(duì)氨基酸-糖體系中GO、MGO形成的影響

2.4.1 精氨酸-葡萄糖體系中GO、MGO變化過程

圖8 精氨酸-葡萄糖體系中GO、MGO的生成量Fig. 8 Production of GO and MGO in Arg-glucose system

如圖8所示，170 ℃加熱條件下精氨酸-葡萄糖體系中，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)（0～60 min），GO、MGO的生成量逐漸增加，在0～5 min內(nèi)，GO、MGO濃度增加最為迅速。在體系反應(yīng)的整個(gè)過程中，MGO的生成量高于GO，60 min時(shí)GO、MGO濃度分別為0.349、0.731 mmol/L，MGO濃度為GO的2.09 倍。這與馬毛毛[32]的研究結(jié)果一致。GO、MGO來源主要為：氨基酸與還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，反應(yīng)初期形成Amadori產(chǎn)物，產(chǎn)物重排后經(jīng)過縮合降解反應(yīng)生成GO、MGO[33]。此外，單糖自氧化會(huì)產(chǎn)生MGO并不斷積累[34]，這是該體系MGO生成量高于GO的原因之一。

2.4.2 PG、OG、DG清除氨基酸-糖體系中GO、MGO的效果

圖9 精氨酸-葡萄糖體系中PG、OG、DG對(duì)GO（A）、MGO（B）的清除效果Fig. 9 Scavenging effects of PG, OG and DG on GO (A) and MGO (B)in Arg-glucose system

如圖9所示，在精氨酸-葡萄糖體系中PG、OG、DG對(duì)GO、MGO均有清除效果，并且PG、OG、DG的清除能力依次遞減；隨著體系清除劑濃度的增加，對(duì)GO、MGO的清除效果逐漸增加。當(dāng)PG終濃度為2.5 μmol/L時(shí)，對(duì)GO、MGO的清除率分別為21.2%、18.0%，差異較小；而PG終濃度提高至100 μmol/L時(shí)，對(duì)GO、MGO的清除率分別達(dá)到49.8%、36.2%，兩者相差13.6%。

2.5 PG、OG、DG對(duì)曲奇餅干中GO、MGO清除能力的研究

圖10 曲奇餅干中PG、OG、DG對(duì)GO、MGO的清除效果Fig. 10 Scavenging effects of PG, OG and DG on GO and MGO in cookies

如圖10所示，PG、OG、DG在曲奇餅干中仍具有清除GO、MGO的活性，并且活性由強(qiáng)至弱依次為PG、OG、DG。相比于清除MGO，清除劑對(duì)GO的清除能力更強(qiáng)。其中，PG對(duì)GO的清除效果最佳，為44.51%；DG對(duì)MGO的清除率最低，為21.19%。

2.6 PG、OG、DG清除GO和MGO的機(jī)制分析

2.6.1 PG清除曲奇餅干中GO、MGO機(jī)制

圖11 PG清除曲奇餅干中GO和MGO的HPLC圖Fig. 11 High performance liquid chromatogram showing PG scavenging of GO and MGO in cookies

表1 曲奇餅干中MG-PG及MM-PG的ESI-MS/MS碎片離子Table 1 ESI-MS/MS fragment ions of MG-PG and MM-PG in cookies

如圖11所示，除檢測(cè)到PG主峰（18.37 min）外，出現(xiàn)了保留時(shí)間為14.06 min的色譜峰。在MS1質(zhì)譜中（表1）ESI-MS（m/z）準(zhǔn)分子離子峰是269[M-H]-，比PG（m/z 211）高58；在MS2質(zhì)譜中出現(xiàn)m/z 211（PG），推測(cè)MG-PG為PG與1 分子GO形成的加合產(chǎn)物。

2.6.2 OG清除曲奇餅干中GO、MGO機(jī)制

圖12 OG清除曲奇餅干中GO和MGO的HPLC圖Fig. 12 High performance liquid chromatogram showing OG scavenging of GO and MGO in cookies

表2 曲奇餅干中MG-OG及MM-OG的ESI-MS/MS碎片離子Table 2 ESI-MS/MS fragment ions of MG-OG and MM-OG in cookies

由圖12可知，液相色譜圖中除出現(xiàn)OG色譜峰外，還出現(xiàn)了保留時(shí)間分別為7.21、7.52 min的兩個(gè)色譜峰。對(duì)于保留時(shí)間7.21 min的峰，其MS1質(zhì)譜中（表2）ESI-MS（m/z）準(zhǔn)分子離子峰為339[M-H]-，比OG（m/z 281）高58；在MS2質(zhì)譜中，出現(xiàn)碎片離子m/z 281（OG），推測(cè)為OG與1 分子GO形成的加合產(chǎn)物MG-OG。

對(duì)于保留時(shí)間7.52 min的峰，MS1質(zhì)譜中ESI-MS（m/z）準(zhǔn)分子離子峰為353[M-H]-，比OG高72；在MS2質(zhì)譜中，出現(xiàn)碎片離子m/z 281，推測(cè)為OG與1 分子MGO形成的加合產(chǎn)物MM-OG。因此，OG在曲奇餅干加工過程中，可以有效捕獲1 分子GO或MGO形成單加合產(chǎn)物MG-OG或MM-OG，從而達(dá)到清除GO、MGO的效果，此作用機(jī)制與PG相同。

2.6.3 DG清除曲奇餅干中GO、MGO機(jī)制

圖13 DG清除曲奇餅干中GO和MGO的HPLC圖Fig. 13 High performance liquid chromatogram showing DG scavenging of GO and MGO in cookies

表3 曲奇餅干中MG-DG的ESI-MS/MS碎片離子Table 3 ESI-MS/MS fragment ions of MG-DG in cookies

由圖13可知，添加了DG的曲奇餅干的HPLC圖中，盡管響應(yīng)值低，但出現(xiàn)保留時(shí)間9.31 min的色譜峰，其MS1質(zhì)譜中（表3）ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰是395[M-H]-，比DG（m/z 337）高58；在MS2質(zhì)譜中，出現(xiàn)碎片離子m/z 337（OG），推測(cè)為DG與1 分子GO形成的加合產(chǎn)物MG-DG。該體系中未檢出DG與MGO形成的加合產(chǎn)物，這可能與DG對(duì)MGO清除率較低有關(guān)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)證明了PG、OG、DG具有清除1,2-二羰基化合物GO和MGO的活性。PG、OG、DG對(duì)GO和MGO的清除能力均隨著濃度的升高而增強(qiáng)，在相同的添加濃度下，清除能力從大到小依次為PG＞OG＞DG。隨著體系pH值（5.5～8.0）增加，3 種清除劑對(duì)GO和MGO的清除率顯著升高；在不同溫度下（25～90 ℃），PG、OG、DG均隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)對(duì)GO、MGO清除率逐步增大，并且對(duì)GO的清除能力優(yōu)于MGO。PG對(duì)GO、MGO清除能力最佳，適合作為長(zhǎng)效清除劑使用，25 ℃反應(yīng)8 d后對(duì)GO、MGO清除率分別為82.8%、69.1%。此外，在模擬食品加工精氨酸-葡萄糖體系及食品加工體系曲奇餅干中驗(yàn)證了PG、OG、DG對(duì)GO、MGO存在清除效果，并在曲奇餅干體系采用HPLC-MS/MS技術(shù)分析其清除機(jī)制為：PG、OG、DG能捕獲GO、MGO，形成相應(yīng)加合產(chǎn)物。