李 冰，劉 康，張 錦，李翠芹,2,*

（1.陜西師范大學(xué) 西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，藥用植物資源與天然藥物化學(xué)教育部重點實驗室，陜西 西安 710119；2.陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119）

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是代謝綜合征在肝臟中的表現(xiàn)，是臨床上十分常見的肝臟疾病[1]。NAFLD很容易發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化[2]。長期攝入高脂飲食會導(dǎo)致肥胖和NAFLD等疾病[3]。來源于天然植物中的黃酮類成分可預(yù)防或輔助治療高脂飲食誘發(fā)的肥胖和肝損傷[4]。花色苷是一種常見的黃酮類天然色素和膳食營養(yǎng)因子，廣泛分布于水果、蔬菜和農(nóng)作物中[5]。由于具有較高的藥用價值和亮麗的色澤，花色苷已經(jīng)作為一種功能性的天然色素和營養(yǎng)物質(zhì)廣泛應(yīng)用于食品和藥品等領(lǐng)域[6-7]。

唐古特白刺（Nitraria tangutorun Bobr.）為蒺藜科（Zygophyllaceae）白刺屬（Nitraria）植物，廣泛分布于青藏高原沙漠地區(qū)，為中國特有品種[8]?！侗静菔斑z》記載“東廧（白刺古名），味甘平、無毒，益氣輕身（減肥），久服不饑，堅筋骨”，唐古特白刺果實經(jīng)常被當?shù)厝擞脕碇委熎⑽柑撊?、消化不良、神?jīng)衰弱和感冒[9]?，F(xiàn)代研究表明，唐古特白刺果實富含花色苷、多酚和黃酮等多種生物活性成分[10]。唐古特白刺是花色苷的優(yōu)質(zhì)來源[11]，然而有關(guān)唐古特白刺果實花色苷防治高脂飲食誘發(fā)的肥胖及NAFLD損傷的研究鮮見報道。

本研究提取唐古特白刺果實花色苷，經(jīng)過長期高脂飲食建立小鼠NAFLD模型。在此基礎(chǔ)上研究唐古特白刺果實花色苷對NAFLD的預(yù)防與緩解作用，及其作用機制。以期為唐古特白刺果實花色苷防治NAFLD提供數(shù)據(jù)支撐，并對唐古特白刺果實的資源開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

30 只SPF級C57BL/6J雄性小鼠，體質(zhì)量（20±2）g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗中心（生產(chǎn)許可證號：SCXK（陜）2014-002）。

唐古特白刺干果購于青海西寧市城東區(qū)中藥批發(fā)市場。

XDA-6大孔樹脂 西安藍曉新材料有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、總甘油三酯（total triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）和低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）測定試劑盒 長春匯力生物技術(shù)有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、過氧化物酶增殖體激活受體-α（peroxisome proliferative activated receptor-α，PPAR-α）、肝X受體α（liver X receptor-α，LXR-α）、脂肪酸轉(zhuǎn)位酶（fatty acid translocase，CD36）和乙酰輔酶A羧化酶（acetyl coenzyme A carboxylase，ACC）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 南京建成生物工程研究所；無水甲醇、無水乙醇和多聚甲醛等試劑均為國產(chǎn)分析純；超純水為自制。

1.2 儀器與設(shè)備

DFT-50粉碎機 溫嶺市林大機械有限公司；TCX-600S超聲波清洗機 濟寧天宇超聲機械設(shè)備有限公司；1510型全波長酶標儀 美國Thermo Scientific公司；H1850型離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 唐古特白刺果實花色苷的制備

按照本實驗室建立的唐古特白刺總花色苷的分離純化方法[11]制備唐古特白刺總花色苷樣品。具體步驟如下：用粉碎機粉碎唐古特白刺干果，粉末用0.1%（體積分數(shù)，下同）HCl-70%甲醇溶液以料液比1∶10（m/V）、70 ℃提取32 min，提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去甲醇，然后用XDA-6大孔樹脂分離純化，得到純化后的唐古特白刺果實花色苷。將唐古特白刺果實花色苷溶液冷凍干燥保存于-20 ℃冰箱待用。采用高效液相色譜面積歸一化法測得唐古特白刺果實花色苷中?；ㄉ照伎偦ㄉ盏?7.76%。

1.3.2 實驗動物分組與喂養(yǎng)

30 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為3 組（每組10 只）：對照組（N）、模型組（M）和唐古特白刺果實花色苷組（TA）。飼養(yǎng)條件：溫度（22±2）℃，相對濕度（55±5）%，12 h光照/12 h黑暗飼養(yǎng)，自由進食與飲水。普通嚙齒動物飼料為40%（質(zhì)量分數(shù)，下同）玉米粉、26%小麥粉、10%麩皮、10%魚粉、10%豆餅、2%礦物質(zhì)、1%粗粉和1%維生素，高脂飼料為普通飼料與牛油以質(zhì)量比3∶1制得，添加唐古特白刺果實花色苷的高脂飼料為普通飼料+1%花色苷粉末與牛油（質(zhì)量比3∶1）[12]，小鼠花色苷粉末攝入量為479.62 mg/kg。所有實驗均遵守中國第四軍醫(yī)大學(xué)動物倫理委員會頒布的《實驗動物管理條例》。對照組喂食普通飼料；模型組喂食高脂飼料；TA組喂食添加唐古特白刺果實花色苷的高脂飼料，持續(xù)飼養(yǎng)14 周，監(jiān)測小鼠每天的進食量及形態(tài)、行動特征，每周末稱量小鼠體質(zhì)量一次，最后1 d禁食不禁水12 h，摘眼球取血，測量小鼠體長（鼻尖至肛門的長度），并收集肝組織、腹部脂肪和內(nèi)臟脂肪。所有實驗均按照國家科學(xué)技術(shù)委員會發(fā)布的實驗動物管理指南（ISBN-100-309-15396-4）進行。

1.3.3 脂體指數(shù)的測定

小鼠處死后分離附睪周圍脂肪并稱質(zhì)量，按式（1）計算脂體指數(shù)。

1.3.4 Lee’s指數(shù)的測定

小鼠處死前，測量每組小鼠的體質(zhì)量和體長，按式（2）計算Lee’s指數(shù)。

1.3.5 血清AST和ALT活力、TC和TG質(zhì)量濃度、HDL和LDL濃度的測定

收集的血液樣本于3 000×g離心15 min，取上層血清于1.5 mL離心管中4 ℃貯存?zhèn)溆?。血清AST和ALT活力、TC和TG質(zhì)量濃度、HDL和LDL濃度均依據(jù)相應(yīng)的試劑盒說明書進行測定。

1.3.6 肝勻漿中MDA含量、SOD和GSH-Px活力、PPAR-α、LXR-α、CD36和ACC質(zhì)量濃度的測定

稱取0.5 g肝臟組織，加入4.5 mL生理鹽水后用手持勻漿機3 000 r/min充分勻漿，肝勻漿于3 000×g離心10 min，取上清液于離心管中貯存?zhèn)溆?。MDA含量、SOD和GSH-Px活力、PPAR-α、LXR-α、CD36和ACC質(zhì)量濃度均按相應(yīng)試劑盒說明進行測定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)以 ±s表示，用GraphPad Prism 5.01軟件中單因素方法分析和Tukey’s Multiple Comparison Test進行分析并作圖，P＜0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐古特白刺果實花色苷對高脂飲食小鼠體質(zhì)量的影響

整個實驗過程中，對照組小鼠食欲正常、毛色光潔且行動靈活，未出現(xiàn)異常特征。與對照組比較，模型組小鼠毛色油亮、行動遲緩且體型肥胖。與模型組比較，TA組小鼠毛色和體型得到很好地改善，毛色光潔、體態(tài)均勻靈活。實驗過程中各組小鼠均未死亡。

圖1 唐古特白刺果實花色苷對高脂飲食小鼠體質(zhì)量的影響Fig. 1 Effects of anthocyanins from N. tangutorun Bobr. on HFD-induced body mass gain in C57BL/6J mice

體質(zhì)量異常是長期高脂飲食引起的主要健康問題之一[13]。如圖1所示，從第2周開始，模型組小鼠體質(zhì)量顯著高于對照組，TA組小鼠體質(zhì)量顯著低于模型組，對照組和TA組小鼠體質(zhì)量沒有顯著性差異；第9周后，模型組小鼠體質(zhì)量增長速率并未減慢，對照組和TA組小鼠體質(zhì)量增長緩慢。與模型組相比，TA組小鼠體質(zhì)量增長情況得到改善。

2.2 唐古特白刺果實花色苷對高脂飲食小鼠常規(guī)生理指標的影響

表1 唐古特白刺果實花色苷對C57BL/6J小鼠常規(guī)生理指標的影響Table 1 Effects of anthocyanins from N. tangutorun Bobr. on food intake, abdominal fat mass, body fat index, visceral fat mass, body length and Lee’s index in HFD-fed C57BL/6J mice

表1結(jié)果顯示，對照組、模型組和TA組小鼠進食量無明顯差異。連續(xù)14 周攝入高脂飲食導(dǎo)致模型組小鼠的腹部脂肪質(zhì)量、脂體指數(shù)、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量以及Lee’s指數(shù)與對照組小鼠比較分別顯著增加了263.64%、192.16%、90.91%和8.93%（P＜0.05）。而與模型組比較，TA組小鼠腹部脂肪質(zhì)量、脂體指數(shù)、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量以及Lee’s指數(shù)顯著降低，且Lee’s指數(shù)與對照組相比無顯著差異。

2.3 唐古特白刺果實花色苷對高脂飲食小鼠肝臟損傷的影響

圖2 唐古特白刺果實花色苷對C57BL/6J小鼠血清中AST和ALT活力的影響Fig. 2 Effects of anthocyanins from N. tangutorun Bobr. on AST and ALT activity in serum of C57BL/6J mice

血清AST和ALT活力是評價肝損傷程度的經(jīng)典指標，肝損傷發(fā)生時，血清AST和ALT活力會顯著升高[14]。如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中AST和ALT活力顯著增加，表明長期攝入高脂飲食導(dǎo)致了明顯的肝損傷。而與模型組比較，唐古特白刺果實花色苷極顯著降低了小鼠血清中AST和ALT活力（P＜0.01）。

2.4 唐古特白刺果實花色苷對高脂飲食小鼠肝臟脂肪代謝的影響

長期攝入高脂飲食在導(dǎo)致體質(zhì)量異常增加的同時，通常伴隨著脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)生，而脂質(zhì)代謝紊亂是NAFLD的主要誘因[15]。肝臟發(fā)生脂肪性病變時，脂肪代謝能力下降，導(dǎo)致血液中TC和TG質(zhì)量濃度上升。LDL和HDL與膽固醇在體內(nèi)的運輸相關(guān)，其濃度會隨著血液中TC和TG質(zhì)量濃度的變化而變化[16]。如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠血清中TC、TG質(zhì)量濃度和LDL濃度極顯著增加（P＜0.01），而HDL濃度極顯著降低（P＜0.01），表明長期攝入高脂飲食導(dǎo)致了明顯的肝臟脂肪代謝異常。而與模型組比較，唐古特白刺果實花色苷極顯著降低了小鼠血清中TC、TG質(zhì)量濃度和LDL濃度（P＜0.01），并極顯著提高了血清HDL濃度（P＜0.01）。

圖3 唐古特白刺果實花色苷對C57BL/6J小鼠血清中TC和TG質(zhì)量濃度（A）、LDL和HDL濃度（B）的影響Fig. 3 Effects of anthocyanins from N. tangutorun Bobr. on TC and TG (A), LDL and HDL (B) levels in serum of C57BL/6J mice

2.5 唐古特白刺果實花色苷對高脂飲食小鼠肝勻漿中MDA含量、SOD和GSH-Px活力的影響

圖4 唐古特白刺果實花色苷對C57BL/6J高脂飲食小鼠肝勻漿中MDA含量（A）、SOD活力（B）和GSH-Px活力（C）的影響Fig. 4 Effects of anthocyanins from N. tangutorun Bobr. on MDA (A),SOD (B) and GSH-Px (C) levels in liver homogenate of C57BL/6J mice

如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠肝臟MDA含量和SOD活力極顯著升高，GSH-Px活力極顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，TA組小鼠肝臟MDA含量和SOD活力極顯著降低，GSH-Px活力極顯著升高（P＜0.01）。

2.6 唐古特白刺果實花色苷對高脂飲食小鼠肝勻漿中PPAR-α、LXR-α、CD36和ACC質(zhì)量濃度的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠肝勻漿中LXR-α、CD36和ACC質(zhì)量濃度極顯著升高（P＜0.01），而PPAR-α質(zhì)量濃度極顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，TA組小鼠肝勻漿中的LXR-α、CD36和ACC質(zhì)量濃度極顯著降低，PPAR-α質(zhì)量濃度極顯著升高（P＜0.01）。

圖5 唐古特白刺果實花色苷對C57BL/6J小鼠肝勻漿中PPAR-α（A）、LXR-α（B）、CD36（C）和ACC（D）質(zhì)量濃度的影響Fig. 5 Effects of anthocyanins from N. tangutorun Bobr. on PPAR-α (A),LXR-α (B), CD36 (C) and ACC (D) levels in liver homogenate of C57BL/6J mice

3 討 論

高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖在動物模型中主要表現(xiàn)為體質(zhì)量增加、體脂積累、肝臟損傷和血脂異常[17]。小鼠連續(xù)14 周攝入高脂飲食引起了其體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、Lee’s指數(shù)、血清AST和ALT活力、TC和TG質(zhì)量濃度顯著增加，與已有報道的結(jié)果[17-18]一致，進一步證實了長期攝入高脂飲食會導(dǎo)致肥胖、肝臟損傷和高甘油三酯血癥。高脂飲食誘導(dǎo)的血脂異常不僅與增加血清TC、TG質(zhì)量濃度和LDL濃度有關(guān)，也與降低血清中的HDL濃度緊密相關(guān)[19]。與模型組相比，TA組小鼠體質(zhì)量增長情況明顯改善，脂體指數(shù)、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量以及Lee’s指數(shù)顯著降低，表示脂肪肝得到一定改善；血清中AST和ALT活力、TC和TG質(zhì)量濃度、LDL濃度極顯著降低，HDL濃度極顯著升高，表明唐古特白刺果實花色苷能夠改善肝損傷和肝臟脂肪代謝。

體質(zhì)量異常與血脂代謝紊亂僅是高脂飲食誘導(dǎo)NAFLD的前期階段，在脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激的作用下NAFLD將進一步惡化[20]?；钚匝蹙哂信c脂質(zhì)反應(yīng)的巨大潛力，特別是與多種不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，從而導(dǎo)致細胞膜損傷。MDA被廣泛用作脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激的標志物，其在機體內(nèi)的水平會因為高脂飲食的攝入而顯著提高[21]。SOD是自由基天然清除劑，當機體受到感染、創(chuàng)傷并出現(xiàn)一個或多個臟器功能衰竭時，體內(nèi)SOD活力增高[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝臟MDA含量和SOD活力顯著高于對照組，這表明高脂飲食引起了小鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的加深，且有肝臟功能衰竭跡象，與先前報道結(jié)果[22]一致。體內(nèi)固有的抗氧化酶GSH-Px能通過清除活性氧和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物而有效預(yù)防機體的氧化應(yīng)激損傷[23]，但高脂飲食的攝入降低了體內(nèi)GSH-Px的活力，進而削弱機體的天然抗氧化防御系統(tǒng)。與模型組相比，TA組小鼠肝組織中MDA含量和SOD活力極顯著降低，GSH-Px活力極顯著升高，說明唐古特白刺果實花色苷通過調(diào)節(jié)肝臟氧化應(yīng)激改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD損傷。

肝臟是脂肪合成和分解的重要場所[24]。脂肪酸合成起始于乙酰-CoA轉(zhuǎn)化成丙二酸單酰-CoA，這步反應(yīng)是在ACC作用下實現(xiàn)的。在脂肪合成途徑中，ACC催化的反應(yīng)不僅是第1步反應(yīng)，同時也是限速步驟[25]。LXR-α激活后能增加脂肪酸合成相關(guān)基因的表達，提高血漿甘油三酯的水平[26]。LXR還能直接調(diào)節(jié)脂肪酸合成相關(guān)基因如脂肪酸合成酶、ACC和硬脂酰輔酶A去飽和酶1的表達[27]。Koonen等發(fā)現(xiàn)CD36主要通過促進TG的合成增加脂肪酸的攝取，從而加速NAFLD的形成[28]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肝臟ACC、LXR-α和CD36質(zhì)量濃度顯著高于對照組，與先前報道結(jié)果[28]一致。PPAR-α是脂質(zhì)代謝過程的關(guān)鍵因子[29]，PPAR-α水平的降低會引起一系列與脂質(zhì)代謝相關(guān)蛋白質(zhì)和酶基因轉(zhuǎn)錄水平的降低，使肝臟線粒體內(nèi)脂肪酸的β氧化能力減弱，引發(fā)脂質(zhì)堆積。脂肪沉積的肝細胞可發(fā)生脂性改變，誘發(fā)和加劇胰島素抵抗及炎癥反應(yīng)，促進NAFLD的發(fā)生[30]。本研究結(jié)果表明，與模型組相比，TA組小鼠肝組織中ACC、LXR-α和CD36質(zhì)量濃度極顯著降低，PPAR-α質(zhì)量濃度極顯著提高，說明唐古特白刺果實花色苷通過調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠NAFLD損傷。

綜上所述，唐古特白刺果實花色苷能明顯降低高脂飲食小鼠的體質(zhì)量、腹部脂肪質(zhì)量、脂體指數(shù)、內(nèi)臟脂肪質(zhì)量、體長以及Lee’s指數(shù)，降低高脂小鼠血清AST和ALT活力、TC和TG質(zhì)量濃度、LDL濃度，提高HDL濃度，通過降低肝組織勻漿中MDA含量、SOD活力并提高GSH-Px活力緩解高脂飲食導(dǎo)致的肝臟氧化應(yīng)激損傷，并通過降低脂肪合成相關(guān)酶和受體（ACC、LXR-α和CD36）質(zhì)量濃度、上調(diào)脂肪分解相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（PPAR-α）質(zhì)量濃度調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝，最終改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD損傷。因此，唐古特白刺果實花色苷作為潛在的功能食品在NAFLD的治療中具有重要的意義。