王桂燕, 吳沁霏, 張 平, 倪 倩, 張 馳, 遲艷玲, 肖 月

(沈陽(yáng)藥科大學(xué) 制藥工程學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110016)

對(duì)二氯苯(1,4-dichlorobenze,P-DCB)是重要的有機(jī)化工原料,質(zhì)量好的P-DCB在各項(xiàng)新的工業(yè)和經(jīng)濟(jì)生活領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前途.P-DCB具有高度的脂溶性,能夠穿過(guò)包括胎盤屏障和血腦屏障在內(nèi)的各種生物膜,1987年它被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)確定為可能的人類致癌物,在水生生物中可發(fā)生生物蓄積. 重金屬鎘(Cd2+)被廣泛應(yīng)用于各種工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,由此產(chǎn)生的大量含鎘離子的廢水給土壤和水資源帶來(lái)嚴(yán)重污染[1-2].現(xiàn)在有多種污染物共同存在于環(huán)境中[3-4].因此,多種污染物之間的復(fù)合污染應(yīng)該更加受到人們的關(guān)注.在生活中廣泛使用的P-DCB和重金屬Cd2+常常同時(shí)存在于水環(huán)境中且易構(gòu)成復(fù)合污染.對(duì)于二者復(fù)合污染脅迫魚類導(dǎo)致對(duì)其抗氧化酶系統(tǒng)的影響至今尚未見(jiàn)有報(bào)道.因此,我們用草魚作研究對(duì)象,考察草魚肝胰臟和腎臟組織的超氧化物歧化酶(SOD)和過(guò)氧化物酶(POD)在P-DCB 和Cd2+的聯(lián)合脅迫下的變化情況,并詳細(xì)探討了用SOD和POD的酶活變化來(lái)作為P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染生物指標(biāo)的可能性,為防治水環(huán)境的污染、保護(hù)水生生物的正常生長(zhǎng)提供科學(xué)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)材料、試劑和儀器

試驗(yàn)魚苗選購(gòu)于沈陽(yáng)北市花鳥批發(fā)市場(chǎng).挑選鱗片無(wú)缺口、行動(dòng)敏捷、大小相近的魚,體長(zhǎng)不大于5 cm,體重在 4.5 g左右.購(gòu)回后投入大水族缸里,全天曝氣,馴養(yǎng)7 d(在此時(shí)間段死亡率不能超過(guò)5%).

對(duì)二氯苯,純度>97%,購(gòu)于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司,氯化鎘(CdCl2·2.5 H2O)、硝基藍(lán)四氮唑(NBT)、愈創(chuàng)木酚、L-甲硫氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、核黃素、磷酸二氫鈉和磷酸氫鈉等都是分析純?cè)噭?購(gòu)于沈陽(yáng)禹王化學(xué)試劑公司.

CR-GIII離心機(jī)(HITACHI),UV1902PC分光光度計(jì)(上海奧析科學(xué)儀器有限公司),HM-330培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司),Seven2Go便攜式溶解氧儀(METTLER TOLEDO),空氣壓縮機(jī).

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟與方法

采用靜態(tài)試驗(yàn)法[5].實(shí)驗(yàn)用水是已曝氣3 d的自來(lái)水.水溫為18 ℃左右,pH值為6.6±0.1,溶解氧質(zhì)量濃度(ρ)大于5.0 mg·L-1.試驗(yàn)使用大小為25 cm×18 cm×25 cm的水族缸.試驗(yàn)過(guò)程中定期測(cè)試溶液的溫度(T)、pH值、ρ等.在試驗(yàn)期間一直曝氣,整個(gè)試驗(yàn)期間和試驗(yàn)的前一天都不投食.

1) 試驗(yàn)質(zhì)量濃度設(shè)計(jì).在P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染試驗(yàn)基礎(chǔ)上,得到的聯(lián)合毒性各污染物96 h的LC50值作為一個(gè)毒性單位(TU)[6],然后以毒性1∶1進(jìn)行復(fù)合毒性試驗(yàn),設(shè)置0.5 TU、0.25 TU、0.125 TU和0.062 5 TU 4個(gè)質(zhì)量濃度組,各質(zhì)量濃度分別設(shè)3個(gè)平行組和1個(gè)空白對(duì)照組,每組隨機(jī)投入10尾魚.

表1 P-DCB和Cd2+ 復(fù)合毒性試驗(yàn)質(zhì)量濃度水平的設(shè)定

2) 酶活性測(cè)定.P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染試驗(yàn)每隔1 d更換1次新制的試驗(yàn)液.在試驗(yàn)后的第1、2、3、4、5、6和7 d分別從染毒組和空白組中隨機(jī)取出3條草魚,迅速解剖,取出草魚的肝胰臟和腎臟,然后在含有0.1 mmol·L-1的EDTA、pH值為7.8的提前冷藏的磷酸鹽緩沖溶液(50 mmol·L-1)里勻漿,再把得到的勻漿液離心30 min(4 ℃、15 000 r·min-1),離心后的上清液就是酶提取液,在4 ℃下保存以備用.采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定SOD活性[7],引起3.0 mL反應(yīng)液達(dá)到50%抑制時(shí)所需要的酶量定義為1個(gè)酶活性單位(U),1 U=16.67nkatal.用U·g-1表示SOD酶活性,采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性[8],吸光度在470 nm處變化0.01表示1個(gè)酶活力單位(IU),用IU·(g·min)-1表示POD酶活性,組織的質(zhì)量都是鮮重.

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素分析,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,用LSD多重比較來(lái)分析試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性,p<0.05表示顯著性差異.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染對(duì)草魚肝胰臟超氧化物歧化酶的影響

如圖1所示,24 h內(nèi)各污染質(zhì)量濃度草魚肝胰臟超氧化物歧化酶活性抑制現(xiàn)象均很顯著(p<0.05);當(dāng)污染暴露達(dá)到48 h時(shí),0.062 5 TU和0.125 TU組肝胰臟的SOD被明顯誘導(dǎo)(p<0.05);隨著暴露時(shí)間的繼續(xù)增加,高質(zhì)量濃度組草魚肝胰臟的SOD活性被明顯誘導(dǎo)(p<0.05);當(dāng)暴露時(shí)間達(dá)到120 h,肝胰臟的SOD活性在各污染質(zhì)量濃度組中均被明顯誘導(dǎo)(p<0.05);當(dāng)暴露144 h時(shí),肝胰臟的SOD活性在各污染質(zhì)量濃度組中都有所下降,但只有在0.25 TU組的草魚肝胰臟SOD酶活明顯低于對(duì)照(p<0.05),其他組SOD酶活仍明顯高于空白對(duì)照組(p<0.05);污染暴露時(shí)間增加到168 h,各質(zhì)量濃度組的SOD活性抑制現(xiàn)象均比較明顯(p<0.05).各質(zhì)量濃度組中草魚肝胰臟組織的SOD酶活隨著 P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先降再升又降的趨勢(shì).

圖1 P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染對(duì)草魚肝胰臟SOD酶活的影響Fig.1 Effects of P-DCB and Cd2+ on the SOD activity in liver pancreas tissues of grass carp

注: 不同大寫字母表示同一質(zhì)量濃度不同暴露時(shí)間之間存在顯著性差異(P<0.05),不同小寫字母表示同一暴露時(shí)間不同質(zhì)量濃度之間存在顯著性差異(P<0.05).下同

2.2 P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染對(duì)草魚腎臟超氧化物歧化酶的影響

如圖2所示,草魚腎臟組織的SOD酶活在暴露24 h內(nèi)被明顯抑制(p<0.05);較低質(zhì)量濃度組腎臟組織SOD活性在污染48 h被明顯誘導(dǎo)(p<0.05);各污染暴露的質(zhì)量濃度在暴露72 h時(shí),草魚腎臟SOD活性都被明顯抑制(p<0.05);當(dāng)P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染時(shí)間達(dá)到96 h,除了最低質(zhì)量濃度組的SOD酶活抑制現(xiàn)象比較明顯(p<0.05)以外,其他質(zhì)量濃度組的SOD酶活均被明顯誘導(dǎo)(p<0.05);草魚腎臟組織SOD酶活隨著P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),低質(zhì)量濃度組被誘導(dǎo)顯著(p<0.05),而高質(zhì)量濃度組被明顯抑制(p<0.05);當(dāng)污染達(dá)到168 h,各暴露質(zhì)量濃度組的草魚腎臟SOD酶活都被明顯被抑制(p<0.05).

圖2 P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染對(duì)草魚腎臟SOD酶活的影響

2.3 P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染對(duì)草魚肝胰臟POD酶活的影響

如圖3所示,草魚肝胰臟POD酶活在24 h內(nèi)各污染的質(zhì)量濃度組抑制現(xiàn)象明顯(p<0.05);在污染48 h時(shí), 0.25 TU組肝胰臟POD活性被明顯誘導(dǎo)(p<0.05),而其他污染質(zhì)量濃度組POD活性則被抑制比較明顯(p<0.05);0.062 5 TU組肝胰臟POD活性在污染72 h時(shí)被誘導(dǎo)比較顯著(p<0.05),其他污染質(zhì)量濃度組POD活性則被抑制比較顯著(p<0.05);當(dāng)暴露時(shí)間達(dá)到96 h以上時(shí),各暴露質(zhì)量濃度組中草魚肝胰臟POD活性抑制現(xiàn)象均非常顯著(p<0.05).

2.4 P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染對(duì)草魚腎臟POD酶活的影響

如圖4所示,較低質(zhì)量濃度組草魚腎臟POD活性在24 h內(nèi)被明顯誘導(dǎo)(p<0.05),而高質(zhì)量濃度組POD活性則被明顯抑制,其值顯著低于對(duì)照組(p<0.05);當(dāng)污染時(shí)間達(dá)到48 h時(shí),0.5 TU組的POD活性被明顯誘導(dǎo)(p<0.05);污染暴露達(dá)到72 h時(shí),0.5 TU組的POD活性與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異(p>0.05),而其他質(zhì)量濃度組腎臟POD活性均被明顯誘導(dǎo)(p<0.05);當(dāng)P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染到96 h時(shí),0.5 TU質(zhì)量濃度組的腎臟POD活性抑制現(xiàn)象比較明顯(p<0.05);污染暴露到120 h時(shí),較低質(zhì)量濃度組草魚腎臟POD活性被誘導(dǎo)比較顯著(p<0.05),而最高濃度組POD活性則出現(xiàn)顯著的抑制現(xiàn)象(p<0.05);污染達(dá)到144 h以上時(shí),各污染質(zhì)量濃度組草魚腎臟POD活性均明顯低于空白對(duì)照組(p<0.05).

圖3 P-DCB和Cd2+聯(lián)合污染對(duì)草魚肝胰臟POD酶活的影響

圖4 P-DCB和Cd2+復(fù)合污染對(duì)草魚腎臟POD酶活的影響Fig.4 Effects of combined exposure of P-DCB and Cd2+ on POD enzyme activity in kidney tissues of grass carp

3 結(jié) 論

1) P-DCB和Cd2+復(fù)合污染對(duì)草魚肝胰臟和腎臟組織的酶活影響顯著.在P-DCB和Cd2+聯(lián)合作用下,草魚肝胰臟和腎臟組織的POD和SOD酶活均變化比較明顯,隨著污染時(shí)間的增加都呈現(xiàn)出“降-升-降”的趨勢(shì).當(dāng)污染時(shí)間增加到168 h,各質(zhì)量濃度組的肝胰臟SOD均明顯低于空白對(duì)照組(p<0.05);當(dāng)污染時(shí)間增加到120 h以上,0.25 TU和0.5 TU組的草魚腎臟SOD酶活明顯低于對(duì)照組(p<0.05);草魚肝胰臟POD只有在0.062 5 TU和0.25 TU組分別在暴露72 h 和48 h時(shí)明顯高于對(duì)照組(p<0.05),其他情況下始終顯著低于對(duì)照組(p<0.05);當(dāng)污染暴露時(shí)間達(dá)到144 h以上,各質(zhì)量濃度組腎臟組織的POD酶活均明顯低于對(duì)照組(P<0.05).

3) 草魚肝胰臟和腎臟組織SOD活性不穩(wěn)定有待深入研究.在P-DCB和Cd2+復(fù)合污染對(duì)草魚肝胰臟SOD活性的影響中,0.125 TU組和0.25 TU組SOD酶活性分別在72 h和96 h出現(xiàn)波動(dòng),另外腎臟組織SOD酶活在0.062 5 TU組和0.125 TU組在暴露48 h也有波動(dòng),其原因都有待繼續(xù)深入研究.另外在P-DCB和Cd2+復(fù)合污染對(duì)草魚腎臟POD活性的影響中,0.062 5 TU組也出現(xiàn)波動(dòng),這些不穩(wěn)定的原因也需要進(jìn)一步深入研究.