侯松林，蔣先虹，周國俊，李利發(fā)，張廣軍，周彤

（1.川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 胃腸外二科，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院肝膽胰腸研究所，四川 南充 637000）

腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）是腫瘤內(nèi)少數(shù)具有長期克隆生長、自我更新和多向分化能力的特殊腫瘤細胞亞群，與腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)關(guān)系密切[1]。但因為CSCs含有量很少、較難獲得且費用高昂，所以使得建立CSCs的擴增模型更具必要性。有幸的是Cariati等[2]發(fā)現(xiàn)，利用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)出的腫瘤球細胞具有CSCs樣特點，從而為CSCs的研究提供了廣闊的空間。CSCs的惡性程度與其自我更新、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物特性密切相關(guān)[3-4]，因此抑制其惡性生物學(xué)特性表達成為了CSCs治療的重要策略之一。自噬（autophagy）是細胞內(nèi)一種高度保守的、受基因調(diào)控的代謝過程，其通過供能、清除異常細胞器和蛋白質(zhì)、防止染色體異常，在維持細胞的自穩(wěn)態(tài)、生長分化以及對抗環(huán)境壓力等過程中發(fā)揮重要作用[5]。而目前，細胞自噬在結(jié)直腸癌CSCs上述生物學(xué)特性中可能具有的作用還未曾探索。因此，本實驗用無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)人結(jié)直腸癌腫瘤球細胞（結(jié)直腸癌腫瘤干樣細胞），并探索結(jié)直腸癌細胞及其球細胞自我更新、增殖、侵襲和遷移能力，以及自噬在上述兩種細胞中發(fā)生的差異。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和設(shè)備

主要材料和試劑：人結(jié)直腸癌HCT116細胞系購于美國模式菌種收集中心（ATCC），DMEM/F-12培養(yǎng)基、McCoy's 5a培養(yǎng)基、無血清培養(yǎng)基添加因子（B27）和牛血清白蛋白（BSA）均購于博士德生物工程有限公司，生長因子購于美國PeproTech公司，Gibco胎牛血清購于美國賽默飛世爾科技公司，4%多聚甲醛購于北京索萊寶科技有限公司，兔抗人LC3B（microtubule-associated protein 1 light chain 3β，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β）、ATG5（autophagy related gene 5，自噬相關(guān)基因5）、ATG7（autophagy related gene 7，自噬相關(guān)基因7）和羊抗兔二抗均購于美國CST公司，CY3紅色熒光羊抗兔二抗購自上海優(yōu)寧維生物科技公司，RT-PCR試劑盒購自Takara公司，PCR引物（F/R）LC3B：GAG AGC AGC ATC CAA CCA AA/CTG AGA TTG GTG TGG AGA CG；ATG5：GAA GCT GTT TCG TCC TGT GG/TCT GTT GGC TGT GGG ATG AT；ATG7：TTC TGC AAT GAT GTG GTG GC/CAA GAG AGG TTG GAG GCT CA購自上海生物工程有限公司，Western blot試劑盒和結(jié)晶紫染液購于上海碧云天生物技術(shù)公司。

主要設(shè)備：BIO-RAD電泳儀及Biorad Transblot SD Semi-Dry Transfer Cell轉(zhuǎn)膜儀均系Bio-Rad中國公司產(chǎn)品，Vilber FusionSolo4顯影成像系統(tǒng)系北京VILBER公司產(chǎn)品，實時定量熒光PCR儀購自ROCHE公司，免疫熒光激光共聚焦儀購自O(shè)LYMPUS科技公司，DMIL Leica顯微鏡購于徠卡顯微鏡中國有限公司，CCL-170B-8 ESCO恒溫箱購于藝斯高上海貿(mào)易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)HCT116細胞的培養(yǎng)：HCT116細胞復(fù)蘇后接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的McCoy's 5a培養(yǎng)基，放置于CO2恒溫孵箱培養(yǎng)，待培養(yǎng)瓶中細胞貼壁70%～80%活性較高時進行消化傳代。HCT116球細胞的培養(yǎng)：在HCT116細胞活性狀態(tài)較高時棄原培養(yǎng)液，更換為不含血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，消化離心、調(diào)整密度，最終以3×104/mL的細胞密度懸浮培養(yǎng)HCT116細胞以獲得其球細胞，隔日添加含生長因子的無血清培養(yǎng)基2 mL，共培養(yǎng)2周。

1.2.2 腫瘤細胞克隆集落形成實驗分別取對數(shù)期的HCT116細胞和HCT116球細胞進行消化、離心，吹打分散為單細胞懸浮液，最終均以500個細胞/孔的密度分別接種于含血清培養(yǎng)基的6孔板中（每組3個復(fù)孔）。放置入恒溫孵箱中培養(yǎng)，待形成肉眼可見的細胞集落時停止培養(yǎng)，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，拍照并計數(shù)。

1.2.3 成球?qū)嶒炄?shù)期的HCT116細胞和HCT116球細胞進行消化、離心，加入含生長因子的無血清培養(yǎng)基并吹打分散為單細胞懸浮液，最終每孔含有4 mL無血清培養(yǎng)基和1×103的細胞數(shù)目（每組3個復(fù)孔），放置于恒溫孵育箱中培養(yǎng)，顯微鏡下觀察并計數(shù)每視野下形成的細胞球。

1.2.4 Transwell細胞侵襲和遷移實驗取Mateigel膠置于4 ℃冰箱溶解并稀釋至10 mg/mL的濃度，加入稀釋后的膠于Transwell小室的上室內(nèi)震蕩鋪平，恒溫孵箱中3 h凝固成膠（遷移實驗省略此步驟）。分別取對數(shù)期HCT116細胞和HCT116球細胞進行消化、離心，吹打分散為單細胞懸浮液并調(diào)整密度為5×105個/mL待用，最終Transwell小室上室加入200 μL體積約105個的HCT116細胞和HCT116球細胞，Transwell小室下室加入700 μL含10%胎牛血清的McCoy's 5a培養(yǎng)基（每組3個復(fù)孔），置于恒溫孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h（遷移實驗24 h）后取出小室清除上層凝膠，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下拍照、計數(shù)。

1.2.5 免疫熒光激光共聚焦實驗取對數(shù)期的HCT116細胞和HCT116球細胞消化、離心，吹打均勻調(diào)整細胞密度，取少量細胞均勻涂抹于防脫片載玻片上，滴加遇冷的4%多聚甲醛固定，0.2%Triton X-100增加細胞膜通透性，0.5%BSA液封閉，繼而滴加LC3B一抗4 ℃冰箱過夜，CY3熒光二抗再次孵育，最后于激光共聚焦顯像系統(tǒng)下拍照。

1.2.6 RT-PCR實驗提取對數(shù)期的HCT116細胞和HCT116球細胞的RNA，進行濃度和純度檢測后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板加入合成的LC3B、ATG5、ATG7等特異引物置于實時熒光定量PCR儀中進行PCR擴增，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT算法計算目的基因mRNA的相對表達量。

1.2.7 Western blot實驗提取對數(shù)期的HCT116細胞和HCT116球細胞的蛋白質(zhì)，利用BCA法進行測定蛋白濃度測定。采用聚丙烯酰氨凝膠行蛋白電泳，以半干轉(zhuǎn)法行蛋白轉(zhuǎn)膜，再加入LC3B、ATG5、ATG7等兔抗人單克隆抗體和羊抗兔二抗進行抗體孵育，最后成像系統(tǒng)曝光顯影。以目的蛋白條帶和內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對表達水平，其中LC3B的蛋白表達水平由LC3II/LC3I的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad prism 7.0和Image J統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以α=0.05作為檢驗水準。

2 結(jié) 果

2.1 HCT116細胞和HCT116球細胞的培養(yǎng)結(jié)果

HCT116細胞在含血清的普通培養(yǎng)液中的生長狀態(tài)表現(xiàn)為分叉且不規(guī)則的貼壁生長（圖1A），而在含生長因子的無血清培養(yǎng)基中，HCT116球細胞則表現(xiàn)為聚集成球的球團樣生長（圖1B）。

圖1 HCT116細胞及HCT116球細胞的生長狀態(tài)（×200） A：HCT116細胞；B：HCT116球細胞Figure 1 Growth status of HCT116 cells and HCT116 sphere cells (×200) A: HCT116 cells; B: HCT116 sphere cells

2.2 HCT116細胞和HCT116球細胞的增殖能力

采用平板克隆集落形成實驗檢測細胞在體外增殖能力，結(jié)果顯示：HCT116球細胞形成的克隆集落數(shù)目為（154.7±4.63）個，而HCT116細胞形成的克隆集落數(shù)目為（41.0±1.53）個，HCT116球細胞的克隆形成數(shù)明顯多于HCT116細胞（t=22.57，P＜0.05）（圖2）。

圖2 HCT116細胞與HCT116球細胞的克隆集落形成情況Figure 2 Colony formations of HCT116 cells and HCT116 sphere cells

2.3 HCT116細胞和HCT116球細胞的自我更新能力

采用成球?qū)嶒灆z測細胞自我跟新能力，結(jié)果顯示：HCT116球細胞形成新的細胞球數(shù)目為（3.2±0.2）個，HCT116細胞形成新的細胞球數(shù)目為（1.4±0.24）個，HCT116球細胞具有更強的自我更新能力（t=4.81，P＜0.05）（圖3）。

圖3 HCT116細胞與HCT116球細胞新形成細胞球的情況（×400） A：HCT116細胞；B：HCT116球細胞Figure 3 Newly formed spheres from HCT116 cells and HCT116 sphere cells (×400) A: HCT116 cells; B: HCT116 sphere cells

2.4 HCT116細胞和HCT116球細胞的侵襲、遷移情況

T r a n s w e l l侵襲、遷移實驗結(jié)果顯示：HCT116細胞和HCT116球細胞侵襲細胞數(shù)分別為（10.66±2.16）個、（28.50±0.56）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=17.05，P＜0.05）；侵襲細胞數(shù)分別為（41.17±2.30）個、（156.5±4.87）個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=21.39，P＜0.05）（圖4）。

圖4 HCT116細胞與HCT116球細胞侵襲、遷移的發(fā)生情況（×200）Figure 4 Invasion and migration abilities of HCT116 cells and HCT116 sphere cells (×200)

2.5 自噬相關(guān)基因LC3B的熒光表達情況

LC3是自噬相關(guān)基因ATG8的哺乳動物類似物，可以始終與自噬體膜結(jié)合，是自噬過程中膜動力學(xué)的重要標志物，也是目前被確認最肯定的自噬體標志物[6]，CY3二抗發(fā)出的紅色熒光可顯示目的蛋白LC3B的表達強弱。本研究結(jié)果顯示，HCT116球細胞的紅色熒光強度較HCT116細胞明顯升高（t=3.52，P＜0.05）（圖5）。

圖5 兩種細胞中LC3的CY3紅色熒光表達情況（×400） A：HCT116細胞；B：HCT116球細胞Figure 5 Expressions of CY3 red fl uorescence in the two types of cells (×400) A: HCT116 cells; B: HCT116 sphere cells

2.6 自噬相關(guān)基因的mRNA表達情況

ATG5、ATG7與LC3B一樣是自噬發(fā)生相關(guān)的重要基因，它們參與了自噬體的形成和延伸等重要過程，也是自噬發(fā)生良好的標志物[7]。RT-PCR結(jié)果顯示，HCT116球細胞組中自噬相關(guān)基因LC3B、ATG5、ATG7等mRNA的表達明顯較HCT116細胞組更高（P＜0.05）（圖6）。

圖6 HCT116球細胞和HCT116細胞LC3B、ATG5、ATG7的mRNA表達情況Figure 6 The mRNA expressions of LC3B, ATG5 and ATG7 in HCT116 cells and HCT116 sphere cells

2.7 自噬相關(guān)基因的蛋白表達情況

Western blot結(jié)果顯示，與HCT116細胞組相比，HCT116球細胞組中自噬相關(guān)基因LC3B、A T G 5、A T G 7等的蛋白表達水平均明顯增高（P＜0.05）（圖7）。

圖7 HCT116球細胞和HCT116細胞中LC3B、ATG5、ATG7的蛋白表達情況Figure 7 The protein expressions of LC3B, ATG5 and ATG7 in HCT116 cells and HCT116 sphere cells

3 討 論

結(jié)直腸癌作為世界上最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率、病死率已分別高居世界惡性腫瘤第3位和第2位，并且其不斷上升的發(fā)病趨勢也給人們的生命健康帶來了重大風(fēng)險[8]。目前，結(jié)直腸癌的治療措施主要采用手術(shù)切除或聯(lián)合放化療，但是部分患者的臨床預(yù)后卻不甚理想。近年來的研究[9-10]表明，結(jié)直腸癌較差的臨床預(yù)后可能與結(jié)直腸癌CSCs的持續(xù)存在有密切關(guān)系，因此，針對結(jié)直腸癌CSCs的治療策略被認為可能是從根本上治愈結(jié)直腸癌的重要方法。

自20世紀90年代Bonnet等[11]首次從白血病患者的血液中獲取白血病干細胞以來，諸如乳腺癌、肝癌、宮頸癌等多種實性腫瘤組織中的CSCs也被不斷發(fā)現(xiàn)和證實[12-14]。而Ricci-Vitianil等[15]在2007年首次分離出并證實了結(jié)直腸癌CSCs的存在后，從而也開啟了對結(jié)直腸癌CSCs的研究步伐。CSCs擁有特殊的生長方式，其在含有生長因子的無血清培養(yǎng)液中可以懸浮生長并形成CSCs球團，而普通腫瘤細胞則由于不能貼壁生長而發(fā)生失巢性凋亡[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的腫瘤球細胞較普通腫瘤細胞更加接近CSCs的特性，而且能夠高表達如CD133、CD44等CSCs特異性表面標記物[17-18]，除此之外，多位學(xué)者[19-21]在把無血清培養(yǎng)法與流式細胞術(shù)或免疫磁珠篩選法進行比較后發(fā)現(xiàn)，上述3種方法篩選獲得的腫瘤細胞均可展現(xiàn)出較強的干細胞特性，從而進一步肯定了無血清培養(yǎng)法富集篩選CSCs的價值[22-23]。

由于CSCs具備較強的惡性生物學(xué)特點，如更強的致瘤能力、更高的侵襲和遷移能力，其惡性程度影響著治療效果[1,24]，因此，探索影響CSCs惡性生物學(xué)特性的潛在機制具有重要意義。自噬本質(zhì)上是一種細胞內(nèi)的代謝過程，負責(zé)細胞內(nèi)的各組分循環(huán)利用，與正常組織相比，實體腫瘤處于缺氧、高乳酸、細胞外低pH值和營養(yǎng)物質(zhì)高消耗的微環(huán)境下，而自噬則可通過提高細胞內(nèi)代謝活性和物質(zhì)利用效率進而增強腫瘤細胞適應(yīng)外部微環(huán)境的壓力。近年來，國內(nèi)外學(xué)者不斷的研究發(fā)現(xiàn)[25-26]，自噬參與了對腫瘤細胞增殖、分化、凋亡和藥物抵抗的調(diào)節(jié)，以促進腫瘤細胞的生存。在此基礎(chǔ)上，部分學(xué)者探索了自噬與CSCs的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)自噬可能以某種機制同樣地參與了對干細胞增殖、分化、干性表達及凋亡發(fā)生的調(diào)控過程，并影響CSCs對放化療藥物的敏感性從而致使抗癌治療失敗[27-29]。同時，Zhai等[30]在動物學(xué)實驗中發(fā)現(xiàn)，在擾亂結(jié)直腸癌CSCs中自噬的表達后，裸鼠形成的種植性腫瘤體積更小，并且更不易形成肝肺的轉(zhuǎn)移性腫瘤，說明了自噬可能具有促進結(jié)直腸癌CSCs的增殖和轉(zhuǎn)移的作用。然而令人遺憾的是，目前從細胞生物學(xué)角度對CSCs和自噬的關(guān)系研究還相對不足，而對于自噬與結(jié)直腸癌CSCs生物學(xué)行為的關(guān)系研究更是缺乏。故本次實驗以結(jié)直腸癌腫瘤球細胞為基礎(chǔ)，從細胞學(xué)角度進一步探索自噬與結(jié)直腸癌CSCs惡性生物學(xué)行為的關(guān)系。

本次實驗通過成球?qū)嶒灪涂寺〖湫纬蓪嶒?，比較了HCT116細胞和HCT116球細胞自我更新和體外增殖能力，采用Tranwell侵襲和遷移實驗比較了它們發(fā)生侵襲和遷移的能力，結(jié)果顯示：⑴ HCT116球細胞形成新細胞球的數(shù)目較HCT116細胞明顯增多，表明HCT116球細胞具有更強的自我更新能力；⑵ HCT116球細胞形成的細胞集落數(shù)目明顯高于HCT116細胞，表明HCT116球細胞具有更強的體外增殖能力；⑶ HCT116球細胞較HCT116細胞穿透基底膜侵襲到小室下層或直接遷移到下層的細胞數(shù)目顯著增多，提示HCT116球細胞具有更強的侵襲和遷移能力。上述的結(jié)果不同程度的表明了HCT116球細胞具有更強的惡性生物學(xué)行為能力。同時，通過Western blot和RT-PCR實驗檢測出在HCT116球細胞中自噬特異標記基因LC3B、自噬相關(guān)基因ATG5、ATG7均呈現(xiàn)顯著的高表達，而HCT116球細胞中LC3B也具有較高的熒光表達強度，上述結(jié)果均顯示出HCT116球細胞中自噬的表達具有更高的活性。

本實驗結(jié)果表明，細胞自噬在具有更高惡性生物學(xué)行為能力的HCT116球細胞中的表達顯著高于HCT116細胞，提示出較高的自噬活性可能與人結(jié)直腸癌HCT116球細胞較高的自我更新、致瘤、侵襲和遷移能力有關(guān)，抑制自噬可能具有降低結(jié)直腸癌CSCs生物學(xué)惡性程度的作用，自噬或許能夠成為未來針對結(jié)直腸癌CSCs治療的重要靶點。